Summary

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

Published: August 14, 2018
doi:

Summary

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Abstract

Assay זו נועדה במיוחד הדו ח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. וירוס כתב בלתי HIV-1 (HIV-1 iCre-איסור פרסום) נוצר על-ידי הוספת Cre recombinase לתוך הגנום HIV-1 בין המטריקס את החלבונים capsid של polyprotein איסור הפרסום. זה תוצאות באריזה Cre recombinase לתוך חלקיקי וירוס, אשר לאחר מכן שוחרר לתוך תא היעד קו stably לבטא Cre מופעל recombinase אדום פלואורסצנטי חלבון (RFP) בקלטות מתג ה-GFP. במצב הבזליים, הקלטת הזאת מבטאת רק RFP. בעקבות מסירת Cre recombinase לתוך תא היעד, RFP, ולצדו באתרים loxP, excises, והתוצאה היא ביטוי GFP. Assay זה יכול לשמש כדי לבדוק כל מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא, נעשה שימוש כדי לזהות מחלקה של היריבים קולטן purinergic מעכבי הרומן של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1.

Introduction

הצורך טיפולים חדשניים תרופתי יש בקשה הפיתוח של תריסים מעכבי של HIV-1 ערך תפוקה גבוהה. איסור פרסום-iCre כתב וזמינותו מפותחת לזהות מעכבי כניסה ויראלי בשלב פיוז’ן במערכת-לתא זיהום על ידי מדידת במיוחד ממברנה ויראלי פיוז’ן עם קרום התא המארח1. Assay פותחה עבור מעכבי הרומן כי פעלו במיוחד בשלבים מוקדמים של זיהום ב- HIV-1 עד לנקודה של קרום ויראלי היתוך מסך. אתגר אחד כדי מדידה תא-תא זיהום הוא inoculum הראשוני מכיל תאים נגועים התורם ותאי המטרה ininfected, ולכן מדידת זיהום חדש קשה להפלות את התאים קלט. המערכת אידיאלית מערבת סמן גנטי heterologous זה יכול להיגרם על ידי אתחול של זיהום תא היעד ואינו נוכח בתא התורם. מסגרת תוכן ויראלי פופולרי ערבוב assay מבוסס על שילוב חלבון נגיפי-אנזים, בלאם-Vpr, יכול להיות יעיל, אבל יש מגבלות עבור תפוקה גבוהה, תא-תא ההקרנה2. Assay הזה כרוך גן כתב בטא לקטמאז (בום) כי דבוקה Vpr HIV-1, הארוזים לתוך virions, מועברת לתוך תאי היעד על קרום ויראלי פיוז’ן. המצע CCF2-אם הוא טעון לתוך הציטופלסמה של התאים היעד, עובר פלורסצנטיות משמרת על המחשוף. המצע CCF2-אם הוא יקר וניתן אוסרני עבור מסכי תפוקה גבוהה. על מנת להבחין בין תאי התורם ואת המטרה, יש צורך לצבוע תווית קהלי היעד. לבסוף, הפרוטוקול מחייב מספר שלבים רוחצים את הדגירה אשר יכול להיות מעיק ויקרות בעת בדיקת מספר רב של תרכובות.

וזמינותו איסור פרסום-iCre פותחה כפתרון לסוגיות הללו, לפתח הקרנת עבור מעכבי של פיוז’ן-לתא בשידור של תפוקה גבוהה. מערכת זו אינה דורשת מצע שיש לטעון לתוך התאים. וזמינותו יכול לשמש גם ללימודים ללא תאים, ניתנת להתאמה מחקרים אחרים פיוז’ן ויראלי באמצעות חלקיקי וירוס HIV-1 איסור פרסום-iCre מדומים מוקלד. HIV Env מתווכת תא-cell fusion מבחני יכול למדוד וירוס Env בתיווך חלבון תאי היתוך, אולם אלה אין להשתמש חלקיקי וירוס בפועל כמו וזמינותו HIV-1 איסור פרסום-iCre3,4,5. Assay הזה ניתן לקרוא עם מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה שימש בהצלחה למסך את ספריית ה-FDA, כמו גם ספרייה קטנה של purinergic מעכבי1,6. חוקרים אחרים זיהו גם מעכבי purinergic ב- HIV-1 היתוך באמצעות וזמינותו של פיוז’ן תפוקה גבוהה המותאמים וממוטב מדווח על העברת וירוס-אנקפסולציה בטא לקטמאז לתוך הציטופלסמה7,8 .

הווירוס איסור פרסום-iCre תוכנן עם גישה דומה לנגיף איסור פרסום-iGFP, החדרת Cre recombinase בין מטריקס capsid, ולצדו אתרי פרוטאז HIV-19. האנזים Cre עשוי כמבשר מוכנס בתוך polyprotein איסור פרסום זה מבשיל פרוטאז HIV-1 מופעל בתוך החלקיק וירוס המתהווה. המשלוח Cre הוא, לפיכך, תלויה מסירת התכנים של חלקיק מופעל פרוטאז HIV-1 לתוך היעד התא באמצעות תהליך היתוך ממברנה ויראלי. שתי גרסאות של הפרוטוקול ניתנים כאן. הראשון משתמש אוכלוסיה נגוע ב- HIV-1 כדי להדביק את התאים היעד, ללמוד שידור ישיר-לתא של HIV. הגירסה השנייה משתמש וירוס ללא תא ללמוד זיהום ויראלי נטול תאים. וזמינותו שידור לתא מקבל 7 ימים להשלמת מהיום שהתאים הם הקרת, או 5 ימים אם התאים נמצאים כבר הקרת, passaged. וזמינותו תא ללא זיהום יכול להתבצע ב 5 ימים אם התאים צריכים להיות הקרת ו- 3 ימים, אם התאים נמצאים הקרת, passaged. ההוראות ניתנות גם לייצר קו של תא המטרה (אדום-כדי-ירוק) RG סוג התא הרצוי (אם אינו נמצא בשימוש קו תא היעד שישנו RG) באמצעות פלסמיד נוצר על ידי המעבדה Clevers10. מומלץ כי אמצעי אבטחה המתאים נלקחים עם הוירוס ולא התאים לבטא וירוס זה וזמינותו. אנו מבצעים של חלק זה וזמינותו במתקן תרביות רקמה BSL2 + זיהומיות. לאחר התאים קבועים, ניתן לנתח הם ב cytometry זרימה רגילה ומתקני מיקרוסקופ.

כאן נתאר את היישום של זה וזמינותו למסך עבור הרומן תרכובות זה לעכב פיוז’ן ממברנה נגיפי HIV-1 (איור 1). קולטנים Purinergic הם מתווכים פרו-דלקתיים. המעבדה שלנו הוכיחה כי מעכבי לא בררניים של קולטני purinergic לפעול כמו מעכבי של פיוז’ן ממברנה נגיפי HIV-16. . מדווחים כי הניצול של זה וזמינותו של תפוקה גבוהה יכול לזהות הרומן מעכבי פיוז’ן של קרום נגיפי HIV-1. נדגים כי מעכב של המחלקה purinergic של קולטני מייצג מחלקה הרומן של מעכבי פיוז’ן ממברנה נגיפי HIV-1.

Protocol

1. דור של שורות תאים היעד הערה: שלב זה הוא אופציונלי; אם באמצעות קו תא היעד הקיים RG, להתחיל בשלב 2. Cotransfect צלחת confluent 10 ס מ 70% של 293T תאים11 [10 מ”ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS)] עם pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE10 ו- pCL-10A112 (אריז?…

Representative Results

נגוע RG Jurkat תאים להפגין רמה נמוכה של אות ה-GFP רקע (0.3%) עם אות RFP חזק מאד (איור 2 א, טור נגוע). הזיהום עם איסור פרסום-iCre גורמת לעלייה GFP אות (24.9%), תוך הנוכחות של החומר המדכא פיוז’ן של HIV-1 AMD3100 (20 מיקרומטר) מעכב ההתפתחות של האות הזה, ל רקע נגוע רמות (0.34%). כאשר מעכב של אירו…

Discussion

איסור פרסום-iCre וזמינותו הוכיחה להיות מאוד שימושי עבור מיון מועמדים סמים אשר עלול לעכב את שלב פיוז ‘ ן של שכפול ויראלי. בעת ביצוע וזמינותו הזה, הצעדים החשובים ביותר להשיג קליטה טובה דומים מבחני זיהום ויראלי ביותר. השלב הקריטי הראשון מפיק titers גבוהה של וירוס באיכות טובה. שלב זה דורש כי התאים 293T…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH/NIAID AI112423 ו- NIH/NIGMS GM113885 כדי בנימין ק’ חן ו- NIH/NIAID K08-AI120806 כדי טליה ה שוורץ. ברצוננו להודות על Icahn בית הספר לרפואה באוניברסיטת הר סיני של דין לזרום Cytometry הליבה.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Sigma Aldrich D5546 Media for 293 Cells
RPMI-1640 Sigma Aldrich R0883 Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin Gibco 16140-071 Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.03 Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution GE Healthcare Life sciences SV30010 Penn/Strep used in both media
T75 Flasks Corning 3073 Used for Culture of Jurkat Cells
10cm Tissue Culture Plates Corning 430167 Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated) Corning 3595 Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent Signagen SL100688 Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537-100ML Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease GE Healthcare Life sciences SH30042.01 For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus GE Healthcare Life sciences 17144002 For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes Fisher Brand 13-678-11E For all tissue culture
Pipettor Tips Denville Scientific P3020-CPS For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 micron) Millipore SLHA033 For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes BD Diagnostics 309656 For filtration of virus
Amaxa Nucleofector Lonza 2b for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood Various models Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE Addgene 32702 Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1 Novus Bio NBP2-29542 Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre Benjamin Chen Lab Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).

References

  1. Esposito, A. M., et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology. 490, 6-16 (2016).
  2. Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes. Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).
  3. Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay. Cytometry. 47, 100-106 (2002).
  4. Sakamoto, T., et al. Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene. Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).
  5. Herschhorn, A., et al. An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors. PLoS One. 6, e26731 (2011).
  6. Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).
  7. Marin, M., et al. High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).
  8. Giroud, C., et al. Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).
  9. Hubner, W., et al. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).
  10. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, 81-83 (2011).
  11. Pear, W. S., et al. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).
  12. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).
  13. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium Phosphate Transfection. Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).

Play Video

Cite This Article
Esposito, A. M., Soare, A. Y., Patel, F., Satija, N., Chen, B. K., Swartz, T. H. A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion. J. Vis. Exp. (138), e58074, doi:10.3791/58074 (2018).

View Video