Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Migliaia di mutazioni somatiche legate allo sviluppo del cancro è stati segnalati¹. Tra questi, alcuni sono marcatori predittivi dell’efficacia della terapia mirata ^2,3 e la selezione di queste mutazioni genetica è pratica clinica di routine in questo momento. Tecnologia digitale di PCR (ddPCR) della gocciolina può essere utilizzata per monitorare la presenza o l’assenza di mutazioni con elevata accuratezza ed è altamente compatibile con biopsie liquido invasivo^4,5. Tuttavia, la corrente ddPCR saggi sono progettati principalmente per rilevare mutazioni conosciute a priori. Questo limita fortemente l’uso di ddPCR come uno strumento di scoperta quando la mutazione è sconosciuta. Infatti, nella progettazione convenzionale ddPCR, una sonda di idrolisi riconoscendo l’allele wild-type (WT sonda) compete con una sonda specifica per riconoscere l’allele del mutante (MUT sonda) (Figura 1A). La sonda con maggiore affinità ibridizza con il modello e rilascia il fluoroforo, che indica la natura dell’allele corrispondente. I dati di fluorescenza ottenuti per ciascuna gocciolina possono essere visualizzati in un grafico a dispersione che rappresenta la fluorescenza emessa dalle sonde WT e MUT in diverse dimensioni. Una rappresentazione schematica di un risultato tipico per un dosaggio di ddPCR convenzionale è presentata in Figura 1A. In questo esempio, la nuvola blu corrisponde alle goccioline contenenti alleli WT identificati dalla sonda WT, mentre la nuvola rossa corrisponde a goccioline in cui l’allele MUT è stato amplificato e identificato dalla sonda MUT. A seconda della quantità di DNA caricato nella reazione, doppie positive goccioline contenenti sia WT e MUT ampliconi possono apparire (nuvola verde). La nuvola grigia luce corrisponde a goccioline vuote.

Poiché la maggior parte delle piattaforme consentono la rilevazione di un numero limitato di fluorofori (solitamente 2, ma fino a 5), velocità effettiva di ddPCR convenzionale è limitata. Targeting per regioni con mutazioni multiple adiacenti richiede pertanto, progettazione di tecnicamente impegnativi saggi multiplex ddPCR o l’utilizzo di reazioni multiple targeting ogni mutazione in parallelo. La strategia di ddPCR di drop-off, supera questa limitazione come potenzialmente può rilevare qualsiasi alterazione genetica all’interno di un’area di destinazione utilizzando un unico paio di WT idrolisi sonde. Le prime coperture di sonda (sonda 1) una sequenza non variabile, adiacente alla regione di destinazione e la seconda sonda (sonda 2) è complementare alla sequenza WT della regione di destinazione, dove le mutazioni sono attesi (Figura 1B). Mentre la prima sonda quantifica la quantità totale di molecole amplificabile nella reazione, la seconda sonda discrimina gli alleli WT e MUT tramite l’ibridazione sub-ottima alle sequenze mutanti. Sonda 2 può identificare diversi tipi di mutazioni in destinazione regione (sostituzioni nucleotidiche singole o multiple, cancellazione, ecc.)⁶. Come ddPCR convenzionale, la nuvola grigia luce corrisponde a goccioline non contenenti nessun molecole di DNA. È importante ricordare che in questo tipo di analisi, una ottimale separazione delle nuvole WT e MUT è dipenda dalla quantità di DNA caricato nella reazione, dal momento che le goccioline contenenti sia WT e MUT alleli di destinazione non possono essere distinto da goccioline contenenti solo il WT modulo. Pertanto, questo test richiede che la maggior parte delle goccioline contengono non più di una copia del gene mirato.