عن طريق الحقن الوريدي وداخل السلي في الرحم زرع في نموذج مورين
Summary
يمكننا وصف بروتوكول لأداء في الرحم زرع (الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا) عن طريق الحقن الوريدي وداخل السلي طرق الحقن في نموذج مورين. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإدخال الخلايا والنواقل الفيروسية، وغيرها من المواد في البيئة الجنينية المناعي متسامح فريدة من نوعها.
Abstract
الزرع في الرحم (الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا) هو وضع فريد وتنوعاً للعلاج التي يمكن استخدامها لإدخال الخلايا الجذعية، والنواقل الفيروسية، أو أي مواد أخرى في أوائل الحمل. ويستند الأساس المنطقي وراء الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا لأغراض علاجية صغر حجم الجنين والنضج المناعية الجنين، وإمكانية الوصول وطبيعة التكاثري للخلايا الجنينية الجذعية أو السلف، وإمكانات لعلاج مرض أو ظهور الأعراض قبل الولادة. الاستفادة من هذه الخصائص الإنمائية الطبيعي للجنين، إيصال الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) عن طريق الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا لديها القدرة على علاج الاضطرابات الدموية الخلقية مثل مرض الخلية المنجلية، دون المطلوب ميلوابلاتيفي أو كآبته التكييف اللازمة لعمليات زرع الأعضاء HSC بعد الولادة. وبالمثل، يحتمل أن تكون إمكانية الحصول على خلايا السلف في الأجهزة متعددة أثناء تطوير يسمح لاستهداف أكثر كفاءة للخلايا الجذعية/السلف بعد الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا نواقل الفيروسية للعلاج بالجينات أو الجينوم تحرير. بالإضافة إلى ذلك، الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا يمكن استخدامها لدراسة العمليات التنموية العادية بما في ذلك، لكن ليس على سبيل الحصر، تنمية التسامح المناعية. ويوفر الطراز مورين وسيلة قيمة وأسعار معقولة لفهم إمكانيات وحدود الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا قبل الدراسات الحيوانية الكبيرة قبل الإكلينيكية وتطبيق السريري في نهاية المطاف. هنا، يمكننا وصف بروتوكول للمنفذ الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا في الجنين مورين من خلال طرق الحقن الوريدي وداخل السلي. هذا البروتوكول قد استخدمت بنجاح توضيح الشروط اللازمة والآليات وراء زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم في الرحم والحث على التسامح في الرحم العلاج الجيني.
Introduction
التقدم الذي أحرز مؤخرا في الفحص قبل الولادة والتشخيص قد سلطت الضوء على إمكانية علاج الجنين لعدد من الاضطرابات الخلقية التي ليس لديها خيارات العلاج الملائم بعد الولادة وينتج كبيرة في معدلات الاعتلال والوفيات. على وجه التحديد، في الرحم زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (ايوهكت) وتحرير العلاج/الجينوم الجينات لديها القدرة على الاستفادة من خصائص الإنمائية الطبيعي للجنين لعلاج الخلقية الدموية والمناعية والوراثية اضطرابات أكثر كفاءة مما زرع HSC بعد الولادة وتحرير العلاج/الجينوم الجينات يمكن أن تفعل1،2. على وجه التحديد، نظراً لصغر حجم الجنين، الخلية المانحة أو الجرعة النواقل الفيروسية يمكن تعظيم كل وزن المستلم. بالإضافة إلى ذلك، يسمح عدم النضج المناعية للجنين المانحة هسكس بالحقن دون ميلوابلاتيفي وتكييف كآبته التي مطلوب في البروتوكولات زرع بعد الولادة. وبالمثل، يمكن حقن النواقل الفيروسية يحمل على التحوير العلاجية أو تكنولوجيا الجينوم التحرير دون استجابة المناعة تحد للمنتج التحوير أو ناقلات الأمراض الفيروسية. وأخيراً، إمكانية الوصول وطبيعة التكاثري للخلايا الجذعية الجنينية/السلف تتيح إمكانية توصيل أكثر كفاءة للخلايا الهدف السلف، فضلا عن أوضاع معينة للجينوم التحرير (الموجه من التماثل إصلاح) التي تتطلب ركوب الدراجات الخلايا إلى حدوث كفاءة. نموذج مورين بمثابة وسيلة الثاقبة وميسورة التكلفة لمعالجة المسائل الهامة في بيولوجيا الخلايا الجذعية وعلم المناعة قبل التجريب في نماذج حيوانية كبيرة قبل الإكلينيكية، وعلى هذا النحو، كانت بمثابة النموذج الأساسي ايوهكت و في الرحم العلاج الجيني قد استكشفت1،،من23.
على الرغم من أن العديد من المتغيرات دوراً هاما في نجاح ايوهكت و في الرحم الجينات العلاج/الجينوم التحرير في نماذج حيوانية موريني وكبير، هو متغير رئيسي طريقة تسليم هسكس أو النواقل الفيروسية. تقديم جرعات كبيرة من المانحين هسكس مع تأثير تمرير الأولى التي تحدث في الكبد الجنين، وهو الجهاز المكونة للدم في وقت ايوهكت، قد ثبت أن تكون أداة فعالة في تحقيق مستويات ماكروتشيميريك engraftment في الماوس ونماذج حيوانية كبيرة4 ،5. وكان هذا يتحقق عن طريق حقنه من المانحين الخلايا عن طريق الوريد فيتيلين في طراز الماوس و عن طريق حقن داخل القلب في نموذج الكلاب البوليسية. طريق الحقن أيضا دوراً أساسيا في استهداف الخلايا السلف من مختلف الأجهزة أثناء التطوير. على سبيل المثال، قد ثبت حقن عن طريق الوريد فيتيلين كفاءة ترانسدوسي كارديوميوسيتيس وخلايا الكبد بعد6،حقن7الحمل متأخر. بدلاً من ذلك، يسمح حقن داخل السلي من النواقل الفيروسية استهداف الأجهزة التي يتعرض لها فعلياً على أساس الجنينية قابلة للطي/تطوير وقت الحقن8. هذا هو أفضل مثال على باستهداف من الظهارة التنفسية عن طريق حقنه داخل السلي في أواخر الحمل للاستفادة من حركات طبيعية الجنين “التنفس”، الذي يعرض الجهاز التنفسي لناقلات الأمراض الفيروسية في السلوى 9من السوائل. هذين الوضعين من الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا، عن طريق الحقن عبر الوريد فيتيلين وداخل السلي، وكانت أساسا للعديد من التجارب الماضية والجارية في المختبر. في هذا البروتوكول، يصف لنا بالتفصيل الأساليب لأداء الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا عن طريق الحقن الوريدي وداخل السلي في نموذج مورين.
Protocol
Representative Results
Discussion
الزرع في الرحم هو علاج محتملة للعديد من الاضطرابات الخلقية التي يمكن تشخيصها في وقت مبكر من الحمل. يسمح نموذج مورين للجامعة الإسلامية للتكنولوجيا الباحثين لاستكشاف البيئة الجنينية أو إلى تجريب مختلف أنواع العلاج. اعتماداً على ما يتم حقنها وما يجري استهداف، يمكن أن توفر عن طريق الحقن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
- Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
- Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
- Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
- Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
- Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
- Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
- Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
- Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
- Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
- Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
- Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
- Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
- Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).
