الحفاظ على الثقافات البيولوجية وقياس التعبير الجيني في نيري عافص: نظام عدم-نموذج للتفاعلات بين النبات-الحشرات
Summary
المن نيري عافص كولونيزيس على النباتات التي دافعت عن درجة عالية في الأسرة دوجباني (أبوسياناسي)، ويوفر العديد من الفرص لدراسة التفاعلات بين النبات-الحشرات. هنا، نحن نقدم سلسلة من البروتوكولات للحفاظ على النباتات والمن الثقافات، وتوليد وتحليل الجزيئي، والبيانات–أوميك نيري (أ).
Abstract
المن نماذج تجريبية ممتازة لمجموعة متنوعة من المسائل البيولوجية بدءاً من تطور متنافسة وتطوير بوليفينيسمس للمسائل المحيطة بالتفاعلات الحشرة بمصانعها المضيف. تتوفر الموارد الجينية للعديد من أنواع المن، وهي، مع التقدم في تسلسل الجيل القادم، يجري توسيع نطاق الدراسات ترانسكريبتوميك للكائنات الحية غير النموذجية التي تفتقر للجينوم. وعلاوة على ذلك، يمكن جمعها من الميدان وتربيتها في المختبر لاستخدامها في تجارب العضوي والجزيئية لسد الفجوة بين الدراسات الإيكولوجية والجينية الثقافات أولاً بأول. وأخيراً، يمكن الحفاظ على العديد من المن في المختبر في مصانعها المضيف المفضل في دورات الحياة الأبدية، بارثينوجينيك تسمح بإجراء مقارنات بلا تزاوج استنساخ الأنماط الجينية. نيري عافص، المن الدفلى حشيشة اللبن، يوفر هذا نموذج واحد لدراسة التفاعلات الحشرات مع النباتات السامة باستخدام تجارب العضوي والجزيئية على حد سواء. طرق لتوليد والحفاظ على ثقافات النبات والمن في الدفيئة ومختبر الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي الاستخراج وتحليل ساتل و حيثياته الترنسكربيتوم الجمعية والتعليق التوضيحي، الترنسكربيتوم التعبير التفاضلية التحليل والتحقق qPCR الأثران عن الجينات المبينة ومناقشتها هنا.
Introduction
المن من الحشرات الصغيرة، هيميميتابولوس أن استعمار على العائلات النباتية المختلفة في جميع أنحاء العالم. فمميزة للعديد من الميزات، الأكثر لا سيما دورات حياتها المعقدة التي تنطوي على التوالد العذري الدورية وبوليفينيسمس منفصلة، وما تلزم متنافسة التغذوية مع اندوسيمبيونتس البكتريا أو الخميرة التي توفر المواد المغذية المفقودة من نظامهم الغذائي للنبات sap1. بينما المن معظم الاختصاصيين النبات المضيف، بعض الأنواع اختصاصي آفات المحاصيل الهامة، إلحاق أضرار اقتصادية كبيرة في المحاصيل أما مباشرة أو عن طريق الجراثيم والفيروسات أنهم ناقلات2. نشر الجينوم المن الأولى في عام 2010، المن البازلاء أسيرثوسيفون بيسوم3، معلما هاما في دراسة البيولوجيا أولاً بأول لأنه يوفر الموارد الجينية للتصدي للمسائل حول الحشرة تعديلات على أساليب حياة العاشبة، بما في ذلك تلك التي قد تؤدي إلى تحسين استراتيجيات تحكم4. ومنذ ذلك الوقت، تراكمت الموارد المجينية إضافية مع المنشور جينوم مشروح لفول الصويا المن glycines عافص5، والموارد المتاحة للعموم كامل الجينوم للأنواع الثلاثة-المن آخر (ميزوس سيرسي (الكرز الأسود أولاً بأول)، بيرسيك ميزوس (الخوخ-البطاطس أولاً بأول)، بادي رهوبالوسيفوم (المن الكرز الطيور-الشوفان)6. قيمة نوفو دي ترانسكريبتوميك الموارد متاحة كذلك لعدد من الأنواع الأخرى من المن (جوسيبي e.g.,Aphis (المن القطن)7، أفني سيتوبيون (الحبوب أولاً بأول)8، سينارا بينيتابولايفورميس (الصنوبر المن)9، نيري عافص (حشيشة اللبن-الدفلى المن)10).
كما جعلت المن مساهمات دائمة لفهمنا التفاعلات النبات-الحشرات وإيكولوجيا الحياة على النباتات11. منطقة واحدة حيث المن قد قدمت مساهمات مهمة خاصة في فهمنا للإيكولوجيا الكيميائية للتفاعلات النبات المضيف. آكلات الحشرات المتنوعة صريح التكييف للتغلب على دفاعات النبات، وبعضها حتى استمالة الدفاعات النباتية الخاصة يستفيد12،،من1314. على سبيل المثال، هو المن الدفلى حشيشة اللبن، نيري عافص، مشرق الأصفر، الغازية المن وجدت في المناطق المعتدلة والمدارية في جميع أنحاء العالم أن كولونيزيس على النباتات في الأسرة حشيشة اللبن (Apocynaceae). وقد تطورت النباتات في الأسرة دفليه الدفاعات الكيميائية المتنوعة، بما في ذلك مطاط حليبي وجليكوسيدات القلب المعروفة باسم كاردينوليديس، التي تربط الناقل الموجبة Na, K-ATPase وهي الردع الفعال لاختصاصي آكلات العشب15، 16-أخصائيين حشيشة اللبن التعبير عن مختلف وسائل المقاومة إلى كاردينوليديس، وبعض بشكل انتقائي أو سلبية تتراكم أو تعديل كاردينوليديس في أنسجتها كوسيلة لردع اﻻفتراس أو ل فوائد أخرى17. ويعتقد نيري (أ) لعزل كاردينوليديس بهذه الطريقة، على الرغم من أن آليات والمزايا الوظيفية تظل غير واضحة10،18.
ونظرا للموارد الجينية في متناول اليد، يوفر نيري (أ) نموذج تجريبية ممتازة لدراسة الآليات الجزيئية والوراثية التي تشارك في التفاعلات الإيكولوجية الكيماوي بين النباتات السامة المضيفة وعلى أخصائي آكلات العشب. تجدر الإشارة إلى أنه في حين أن بعض الدراسات أقرب نيري (أ) ركزت على تنحية كاردينوليديس19، منذ ذلك الوقت، قدمت دراسات نيري (أ) رؤى في مجموعة واسعة من المسائل الإيكولوجية والتطورية، بما في ذلك الهيكل الوراثي للحشرات الغازية20 والتفاعل بين التنظيم التصاعدي والتنازلي في كثافة عاشب21. نيري (أ) ومن ثم مرشح جيد كنموذج تجريبي لمجموعة واسعة لا سيما من دراسات التفاعلات الحشرات والنباتات. الحاسمة لنجاح أي دراسة مع نيري (أ) هي عناية ثقافة المن السكان، التي تشمل ثقافة النباتات التي تعتمد عليها المن، فضلا عن جيل بكفاءة عالية الجودة-أوميك البيانات. أن هدفنا توجيه القارئ من خلال على حد سواء. المذكورة أدناه طرق لتوليد والحفاظ على ثقافات النبات والمن في الدفيئة والمختبر والحمض النووي والجيش الملكي النيبالي الاستخراج، تحليل ساتل، نوفو دي الترنسكربيتوم الجمعية والتعليق التوضيحي، الترنسكربيتوم خلطات أعرب تحليل التعبير التفاضلية، والتحقق qPCR للجينات. وفي حين كتبت هذه الأساليب نيري (أ)، واستزراع عامة، والاستخراج، وأساليب التحليل يمكن أن تمتد إلى مجموعة متنوعة من أنواع المن.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد اعترف منذ وقت طويل أن أبوسيماتيك نيري (أ) يمكن أن توفر أفكاراً في الأنماط والآليات لمقاومة الدفاعات النباتية ولا سيما الكيميائية تنحية18،37. ظهرت مؤخرا عددا من الموارد الجينية نيري (أ)10، تتيح فرصاً جديدة للدراسات الجينومية الإيكولو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ميشيل القمر (جامعة فاندربيلت) للحصول على المساعدة مع التصوير الفوتوغرافي. جامعة فاندربيلت تقدم الدعم للسلطة الفلسطينية وسلب معتمد من قبل 1445197 دج.
Materials
| Sun Gro Fafard Germination Mix | Hummert International | 10-0952-2 | |
| Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix | Hummert International | 10-0951-2 | |
| 2x 4" Round Standard Pot | Anderson Pots | 1503 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0701 | |
| Trizol | ThermoFisher Scientific | 15596026 | |
| SuperScript® III First-Strand Synthesis kit | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4367659 |
References
- Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
- Dixon, A. F. G. . Aphid Ecology: An Optimization Approach. , (1985).
- Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313 (2010).
- Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
- Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
- Li, Z. -. Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180 (2013).
- Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
- Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
- Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
- Dixon, A. F. G. . Insect Herbivore-Host Dynamics. , (2005).
- Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
- Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
- Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
- Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
- Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect’s perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
- Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
- Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems – a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
- Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
- Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid ‘superclone’: extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524 (2011).
- Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
- Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
- Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
- Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, 279-285 (2016).
- The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
- Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
- Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31 (2014).
- Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
- Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
- Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
- Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
- Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417 (2010).
