Klassieke korte-vertraging Eyeblink Conditioning in één-jarige kinderen
Summary
Dit protocol beschrijft een eyeblink conditioning paradigma geschikt voor experimenten met een-jaar-oude zuigelingen. Commerciële of op maat gemaakte apparatuur kan worden gebruikt voor het leveren van de prikkels en gegevensverzameling en analyse moet worden verricht op de video-opnamen.
Abstract
Klassieke eyeblink conditioning (EBC) verwijst naar de geleerde associatie tussen een geconditioneerde stimulus (een auditieve Toon) en een unconditioned stimulus (een trekje van lucht naar het hoornvlies). Eyeblink conditionering is vaak experimenteel gebruikt voor de opsporing van afwijkingen in de cerebellaire-afhankelijke leren en geheugen, dat ten grondslag ligt aan dit soort associative leren. Terwijl experimenten bij volwassenen en oudere kinderen relatief eenvoudig zijn te beheren met behulp van commerciële apparatuur, is eyeblink conditionering bij zuigelingen meer uitdagende als gevolg van hun slechte naleving, waardoor de juiste positionering van de apparatuur moeilijk. Om te bereiken conditionering in een-jaar-oude zuigelingen, kan een op maat of een aangepast commercieel systeem worden gebruikt voor de lucht bladerdeeg naar de zuigeling hoornvlies. De belangrijkste uitdaging ligt in het succesvol opsporen en classificeren van de gedragsmatige reacties. Wij rapporteren dat geautomatiseerde knipperen detectiemethoden onbetrouwbaar in deze populatie, en dat experimenten conditioning moet worden geanalyseerd met behulp van frame-voor-frame analyse van aanvullende videocamera opnamen. Deze methode kan worden toegepast te bestuderen developmental veranderingen in eyeblink conditionering en te onderzoeken of dit paradigma kinderen met neurologische stoornissen detecteren kan.
Introduction
EBC is een vorm van klassieke conditionering, die wordt gebruikt bij het beoordelen van leren en geheugen bij mensen en andere dieren. De conventionele EBC paradigma verwijst naar een geleerde associatie tussen een onschuldig ‘geconditioneerde’ stimulus (een auditieve tone) met de ‘onvoorwaardelijke’ stimulus (een hoornvlies lucht trekje dat een reflexieve eyeblink, de unconditioned-reactie induceert). Associative leren is beoordeeld door de presentatie van de geconditioneerde stimulus en eyeblinks te classificeren, zoals airconditioning en unconditioned reacties-een stijging in het aantal geconditioneerde reacties na verloop van tijd, of over meer dan één sessie, kan duiden op associatieve leren plaatsvindt.
De eyeblink conditioning paradigma kan identificeren van individuen met associative leren bijzondere waardeverminderingen worden gebruikt. Vertraging conditioning-waar de geconditioneerde stimulus (CS) aanvangt vόόr maar overlapt de stimulus unconditioned (VS)-wordt beheerd door cerebellaire circuit1,2, en bij volwassenen en kinderen met neurologische stoornissen, wordt verstoord inclusief schizofrenie3, Autisme4,5, en foetaal alcohol spectrum disorder6,7. Vanuit het oogpunt van klinische onderzoeken eyeblink conditioning bij zuigelingen mogelijk ondersteuning voor eerdere opsporing en behandeling van deze neurologische aandoeningen. Echter, terwijl oudere kinderen een hoornvlies lucht bladerdeeg6,7,8 tolereren kunnen en kunnen een stabiele hoofd/ooghoogte voor de duur van het experiment worden bijgehouden, zuigelingen zijn minder compatibel en conventionele eyeblink detectie apparatuur en software is niet voldoende.
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om te onderzoeken van korte-vertraging eyeblink conditioning in één-jarige kinderen, die aangepast vanuit protocollen is eerder elders beschreven9,10,11. Dit protocol kan worden beheerd met behulp van een commerciële of op maat gemaakte systeem geschikt voor het leveren van een gecontroleerde trekje van lucht naar het hoornvlies. Echter, in plaats van commerciële eyeblink detectie software (bijvoorbeeldvan de San Diego Instrument EyeBlink Detection System, die signalen van een infrarood camera verwerkt), wij, en anderen9,10,11, raden frame-voor-frame analyse van video camera opnames op te sporen en eyeblink reacties in een-jaar-oude zuigelingen te classificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wijzigingen en probleemoplossing:
Commerciële of op maat gemaakte eyeblink conditioning systemen moet de prikkels voorleggen aan het onderwerp in een experimenteel gecontroleerde manier en kundig voor speurder de gedrags reacties. Hoewel dit is een niet-invasieve procedure, de technische vereisten voor het uitvoeren van deze experimenten in minder compatibel populaties (bijv, zuigelingen) is uitdagend. De hoofd-mount fysiek aansluiten in het oog is mogelijk voor dierproeven, zoals conditioning experimenten in schapen12,13. Oudere kinderen kunnen tolereren het dragen van een hoofdband met een bijgevoegde lucht-bladerdeeg levering unit6,7,8 en kunnen worden aangemoedigd om een constante ooghoogte televisie als een afleiding gebruiken. Hoewel naleving bij zeer jonge zuigelingen kan worden bereikt door conditionering tijdens slaap14, oudere zuigelingen naderen dan één jaar zijn over het algemeen gemakkelijk afgeleid, waardoor ze een unieke uitdagende bevolking. Ondanks de uitdagingen zijn eyeblink conditioning experimenten mogelijk voor sommige wakker, een-jaar-oude zuigelingen. Onze slagingspercentages zijn vergelijkbaar met die eerder gemeld in de literatuur (~ 40% – 50% compliance)9, met de kans op succes waarschijnlijk het gevolg van door de zuigeling temperament op de dag van het experiment.
Kritische stappen binnen het Protocol:
Het is raadzaam een verkrijgbare EBC set-up aan te passen, of met behulp van een op maat gemaakte lucht druk generator zoals eerder is beschreven voor jongere zuigelingen9,10,11. De eerste uitdaging is het handhaven van de lucht-bladerdeeg levering eenheid in de juiste positie gedurende het gehele experiment, waarbij een kleinere, bewerkt zendspoel. Oog veiligheid is een bijzondere zorg voor niet-conforme zuigelingen die proberen de zendspoel om zelf te verwijderen. Daarom, zuigelingen moeten worden nauwlettend te allen tijde. Een deel van de kinderen zullen niet toestaan dat het dragen van de hoofdband of ontvangen van de lucht bladerdeeg voor het oog (hier, ~ 35%), hoewel dit kan worden verbeterd door de zuigeling zachtjes af te leiden als dit is toegestaan door de experimentele protocol en als dit niet openlijk met kind interfereert gedrag. Voor de kinderen die het experiment voltooien, zijn lucht-bladerdeeg-alleen proeven essentieel om te bevestigen dat de zendspoel correct werd gepositioneerd als ontbreken of omkering van conditionering reacties kan worden veroorzaakt door slechte levering van de lucht bladerdeeg gedurende het gehele experiment.
Hoewel handmatige video-analyse tijdrovend is, zijn geautomatiseerde maatregelen van de zuigeling eyeblink reacties momenteel moeilijk te bereiken. Infrarood sensoren geleverd met commerciële EBC set-ups (gepositioneerd op de hoofdband grenzend aan de luchtbox bladerdeeg) Noteer de reflectiecoëfficiënt van moment tot moment van het hoornvlies op een 1-kHz sampling rate en knippert kunnen worden opgespoord door het meten van de verandering in de reflectie na het begin van de stimulus. Belangrijke wijzigingen ten opzichte van de basislijn reflectiecoëfficiënt blijkt dat een eyeblink heeft plaatsgevonden, en geautomatiseerde analyse kan worden gebruikt om te detecteren en te classificeren knipperen reacties. Echter, wij en anderen9,10,11 suggereren dat onderzoekers moeten niet vertrouwen op infrarood hoornvlies reflectiecoëfficiënt metingen voorzien van commerciële EBC set-ups te detecteren knippert bij één-jarige kinderen. Hoewel deze methode mogelijk geschikt voor volwassen deelnemers of oudere kinderen6,7, konden we niet betrouwbaar detecteren knippert in één-jarigen met behulp van deze methode. Hier, wordt te verwaarlozen verandering in de basislijn reflectiecoëfficiënt geconstateerd over de lengte van het verhoor tijdperk, die aangeeft dat de eyeblink niet wordt gedetecteerd door de infrarood sensor. Bovendien worden valse positieve pieken vaak waargenomen, die worden veroorzaakt door de zuigeling hoofdbewegingen die veranderen de positionering van de sensor. Piloot testen bij volwassenen suggereert dat de deelnemer zich concentreren moet op of iets boven de horizontale lijn van het zicht, met de luchtbox voor bladerdeeg gepositioneerd binnen 1-2 cm van het hoornvlies, met succes het detecteren van de eyeblinks-voorwaarden die niet kunnen worden gehandhaafd licht van de zuigeling. Daarnaast kan de grootte van de kleine interpalpebral horizontalis in zuigelingen verminderen hoornvlies reflectiecoëfficiënt, blink detection meer moeilijk dan bij volwassenen of oudere kinderen te maken.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden:
Ondanks de noodzaak voor handmatige videocamera analyse en de lagere temporele resolutie van een 60-Hz video in vergelijking met metingen van de reflectiecoëfficiënt van 1 kHz maken de verbeterde slagingspercentages van video-opnamen dit een superieure methode de infrarood sensor. Hoewel het hoornvlies lucht bladerdeeg wordt ook geleverd door de dezelfde zendspoel bijlage als een commerciële infrarood sensor, weergegeven stimulans bezorging als veerkrachtiger te plaatsen dan de infrarood sensor, zoals de lucht bladerdeeg sterkte kan worden aangepast als vereist. Dit vermijdt overmatige aanpassing van de hoofdband, die de neiging om de naleving van de zuigeling. Onderzoekers die kunnen bereiken hogere slagingspercentages met behulp van de infrarood sensor wellicht nog ondersteuning van de analyse van de videocamera. Voor de proeven waar er geen antwoord van de detecteerbare eyeblink opgenomen door de infrarood sensor is, video-opnames kunnen onderscheid maken tussen echte antwoorden of ongeldige proeven (dat wil zeggen, of het kind het bladerdeeg luchtbox droeg in de juiste positie, of deed ze niet knipperen, of of de infrarood sensor niet te detecteren het knipperen). Video-opnames zijn ook nodig om te bevestigen van vals-positieve resultaten, zoals bewegingen tijdens het proces kunnen ook produceren artefacten vermomd als knippert. Eye-tracking apparaat15,16 en elektromyografie9,10,14 van de Musculus orbicularis oculi zijn andere geautomatiseerde methoden voor blink detection die buiten het bestek van dit document vallen, Hoewel zonder visuele bevestiging van het bladerdeeg luchtbox positionering voor elk afzonderlijk experiment, deze methoden kans om te lijden van de dezelfde nadelen als de infrarood eyeblink detectie software hier beschreven zijn.
Eerder is gepubliceerde werk op oog-blink conditionering gericht op jongere zuigelingen, meestal 4-5 maanden van leeftijd; Dit werk wordt toegevoegd aan dit orgaan van literatuur door te beschrijven van technieken voor het gebruik met oudere zuigelingen (12 ± 1 maand oud) en de unieke uitdagingen die deze leeftijdsgroep presenteert. Andere auteurs hebben ook gebruikt voor video-analyse (alleen of in combinatie met elektromyografie) met zuigelingen9,10,11,14. De resultaten die hier gepresenteerd in overeenstemming zijn met deze eerdere bevindingen die video frame-voor-frame-analyse is de beste methode suggereren voor het opsporen van eyeblinks in zuigelingen, zoals elektromyografie zowel infrarood toezicht problematisch vanwege gezichts- en hoofd kunnen bewegingen bij zeer jonge kinderen. Dit werk ondersteunt ook de bevinding dat zuigelingen geconditioneerde reacties zelfs op zeer jonge leeftijd, ten minste voor een 650-ms vertraging interval9 ontwikkelen kunnen.
Toekomstige toepassingen:
Zoals een beperkt aantal studies hebben geprobeerd eyeblink conditioning experimenten met menselijke baby’s, moeten de parameters van de stimulans zorgvuldig worden overwogen in de toekomst experimenten. Conditionering geconstateerd zo spoedig 10 dagen van leeftijd17 en ten minste binnen de eerste maand van leven14, hoewel een lange onderlinge stimulans interval (bijvoorbeeld1.500 ms) lijkt te zijn succesvoller in deze zeer vroeg stadium van de kinderschoenen18 . Ter vergelijking, kinderen zes maanden van leeftijd naderen kunnen worden betrouwbaarder geconditioneerd met een korter interval10, hoewel minder succesvol dan in volwassenen19. Het 650-ms interval tussen de Toon en de lucht bladerdeeg voorgesteld voor één-jarige kinderen in dit protocol met succes kunnen induceren conditioning in 4 – of 5-maand-oude baby’s9,10,11, zo goed als in oudere kinderen6,7. Dit suggereert dat eyeblink conditionering is ontwikkelingsachterstand geregeld, met de optimale vertraging tussen de Toon en de lucht bladerdeeg minderen met zuigeling leeftijd10, hoewel extra experimenten aanpassing van dit protocol zijn vereist om te onderzoeken deze verdere parameters.
Beperkingen van deze techniek:
EBC kan lastig zijn om in te stellen en wellicht problemen oplossen in elke afzonderlijke situatie. Bepalen wanneer conditionering opgetreden is moeilijk te definiëren en best over meerdere proeven of sessies wordt waargenomen. Bijvoorbeeld, hebben andere studies gebruikt een willekeurige conditionering percentage van 40% binnen elk blok van 10 proeven om te definiëren van conditionering en ten opzichte van de wijzigingen tussen opeenvolgende experimentele sessies6,9,10, 11. Succesvolle voltooiing van het vereiste aantal proeven te observeren conditionering kan dus moeilijk te bereiken bij jonge kinderen.
Met betrekking tot de data-analyse, is een van de specifieke uitdagingen stimulus-opgeroepen knippert scheiden van spontane (endogene) knippert9. Het aantal spontane eyeblinks is verschillend tussen individuen maar kan worden beïnvloed door omgevingsfactoren zoals kamer vochtigheid, evenals gedrags Staten. Dubbele knippert optreden wanneer er twee volledige ooglid sluitingen in een zeer korte tijd (bijvoorbeeld, 400 ms)20, en het is mogelijk dat deze spontane knippert die zich op hetzelfde moment als een reflexive weerspiegelen (geconditioneerde of onvoorwaardelijke) eyeblink. We af en toe waargenomen dubbele knippert in onze gegevensverzameling, met behulp van dit protocol, wij en geregistreerde en de latentie om alleen het eerste knipperen. Echter het teruggooien van deze proeven kan verhogen van zekerheid dat de analyse is het vastleggen van stimulus-opgeroepen knippert alleen.
Onderzoekers moet ook om besluiten te nemen op het raam van de latency te definiëren een geconditioneerde of unconditioned antwoord, evenals of latentie om voor te stellen het begin knipperen of het Knipoogje piek (ooglid sluiting). We hebben hier conservatief een geconditioneerde antwoord gedefinieerd als een Knipoogje dat voorafgaand aan 650 ms in gepaarde of ongepaarde proeven, zekerheid pieken dat het knipperen wordt gestart vóór het intreden van lucht bladerdeeg in plaats van in reactie op het bladerdeeg lucht te bieden. Echter kan dit venster latency worden uitgebreid voor ongepaarde proeven waar geen lucht bladerdeeg wordt aangeboden, met name als piek om te definiëren van de latentie van de reactie met behulp van knipperen. Hier de belangrijk beginsel is dat alle instanties worden behandeld op dezelfde wijze, door alle onderzoekers, en dat dit criterium wordt bepaald vóór enige data analyse.
Kortom, kan frame-voor-frame videoanalyse bieden een betrouwbare en reproduceerbare methode voor de beoordeling van de klassieke EBC reacties bij jonge zuigelingen. Deze maatregelen voorzien een maatregel van het leren van gedrag, hoewel een veelomvattende beoordeling gegeven developmental is vereist voor de neurologische ontwikkeling volledig te karakteriseren in kinderschoenen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Nieuw-Zeelandse Optometric visie Research Foundation, het Bureau van de bevordering van de gezondheid, de Universiteit van Auckland faculteit onderzoek Ontwikkelingsfonds, en de Universiteit van Auckland School of Medicine PBRF te financieren.
Wij zijn dankbaar aan de twee optometrie studenten van de Universiteit van Auckland (Shannon Boy en Harpreet Singh) die voltooid de handmatige video analyse te onderzoeken van de overeenkomst in knipperen respons metingen.
Materials
| Eyeblink conditioning system | San Diego Instruments | Model #2325-0145-W | includes portable airpuff unit and infrared emitter/receiver mounted to adjustable headband; eyeblink stimulus and response detection software; PC interface |
| 4K Ultra HD action camera | RV77 | Model SJ9000 | micro SD/TF card recording 90fps at 720p |
References
- Freeman, J. H., Steinmetz, A. B. Neural circuitry and plasticity mechanisms underlying delay eyeblink conditioning. Learning & Memory. 18 (10), 666-677 (2011).
- Mccormick, D. A., et al. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
- Bolbecker, A. R., et al. Eye-blink conditioning deficits indicate temporal processing abnormalities in schizophrenia. Schizophrenia Research. 111 (1-3), 182-191 (2009).
- Sears, L. L., Finn, P. R., Steinmetz, J. E. Abnormal classical eye-blink conditioning in autism. Journal of Autism and Development Disorders. 24 (6), 737-751 (1994).
- Oristaglio, J., et al. Children with autism spectrum disorders show abnormal conditioned response timing on delay, but not trace, eyeblink conditioning. Neuroscience. 248, 708-718 (2013).
- Jacobson, S. W., et al. Impaired eyeblink conditioning in children with fetal alcohol syndrome. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (2), 365-372 (2008).
- Jacobson, S. W., et al. Impaired delay and trace eyeblink conditioning in school-age children with fetal alcohol syndrome. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (2), 250-264 (2011).
- Ohlrich, E. S., Ross, L. E. Acquisition and differential conditioning of the eyelid response in normal and retarded children. Journal of Experimental Child Psychology. 6 (2), 181-193 (1968).
- Ivkovich, D., Eckermann, C. O., Krasnegor, N. A., Stanton, M. E., Woodruff-Pak, D., Steinmetz, J. E. Using eyeblink conditioning to assess neurocognitive development. Eyeblink Classical Conditioning: Volume I. , 119-142 (2002).
- Klaflin, D. I., Stanton, M. E., Herbert, J., Greer, J., Eckerman, C. O. Effect of delay interval on classical eyeblink conditioning in 5 month old human infants. Developmental Psychobiology. 41 (4), 329-340 (2002).
- Ivkovich, D., Collins, K. L., Eckerman, C. O., Krasnegor, N. A., Stanton, M. E. Classical Delay Eyeblink Conditioning in 4- and 5-Month-Old Human Infants. Psychological Science. 10 (1), 4-8 (1999).
- Nation, K., et al. Video-based data acquisition system for use in eye blink classical conditioning procedures in sheep. Behavior Research Methods. , 1-14 (2016).
- Johnson, T. B., Stanton, M. E., Goodlett, C. R., Cudd, T. A. Eyeblink classical conditioning in the preweanling lamb. Behavioral Neuroscience. 122 (3), 722-729 (2008).
- Reeb-Sutherland, B. C., et al. One-month-old Human Infants Learn About the Social World While They Sleep. Developmental Science. 14 (5), 1134-1141 (2011).
- Kulke, L., Atkinson, J., Braddick, O. Automatic Detection of Attention Shifts in Infancy: Eye Tracking in the Fixation Shift Paradigm. PLoS One. 10 (12), e0142505 (2015).
- Meng, X., Uto, Y., Hashiya, K. Observing Third-Party Attentional Relationships Affects Infants’ Gaze Following: An Eye-Tracking Study. Frontiers in Psychology. 7, 2065 (2016).
- Naito, T., Lipsitt, L. P. Two attempts to condition eyelid responses in human infants. Journal of Experimental Child Psychology. 8 (2), 263-270 (1969).
- Little, A. H., Lipsitt, L. P., Rovee-Collier, C. Classical conditioning and retention of the infant’s eyelid response: effects of age and interstimulus interval. Journal of Experimental Child Psychology. 37 (3), 512-524 (1984).
- Hoffman, H. S., Cohen, M. E., Devido, C. J. A comparison of classical eyelid conditioning in adults and infants. Infant Behavior and Development. 8 (3), 247-254 (1985).
- Nakanishi, M., Mitsukura, Y., Wang, Y., Wang, Y. T., Jung, T. P. Online Voluntary Eye Blink Detection using Electrooculogram. IEICE Proceeding Series. , (2012).
