أزرق تولويدين تلطيخ أبواب جزءا لا يتجزأ من الراتنج للتقييم مورفولوجيا الأعصاب الطرفية
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتصور الهياكل الدقيقة للأعصاب المحيطية بالحصول على وتلوين الأجزاء 1-2 ميكرومتر مع تولويدين الأزرق
Abstract
الأعصاب المحيطية تمتد في جميع أنحاء الجسم، إينيرفاتينج الأنسجة المستهدفة مع محاور عصبية الحركية أو الحسية. نظراً للتوزيع على نطاق واسع، وكثيراً ما تلف الأعصاب الطرفية بسبب الصدمة أو المرض. كما وضعت أساليب واستراتيجيات لتقييم إصابات الأعصاب المحيطية في نماذج حيوانية، الدالة والتجدد، تحليل مورفوميتري للأعصاب الطرفية أصبح قياس نتائج محطة أساسية. تولويدين الأزرق تلطيخ العصب عبر المقاطع التي تم الحصول عليها من فروع العصب راتنج مضمن أسلوب استنساخه لعمليات التقييم النوعي والكمي للأعصاب المحيطية، وتمكين التصور مورفولوجيا عدد محاور عصبية ودرجة مييلينيشن. هذا الأسلوب، كما هو الحال مع العديد من أساليب نسيجية أخرى، يكون من الصعب تعلم وإتقان استخدام البروتوكولات المكتوبة القياسية. والغرض من هذا المنشور ذلك لإبراز البروتوكولات المكتوبة تولويدين الأزرق تلطيخ للأعصاب الطرفية مع بالفيديو للأسلوب، استخدام الأعصاب الوركي حصادها من الفئران. في هذا البروتوكول، يصف لنا في فيفو التثبيت بالاعصاب الطرفية ومجموعة من الأنسجة، وبعد انتهاء التثبيت مع 2% أكسيد الاوزميوم، تضمين للأعصاب في راتنج الإيبوكسي، وتقطيع أولتراميكروتومي للأعصاب بسمك 1-2μm. أقسام الأعصاب ثم نقلها إلى شريحة زجاجية والملون بالأزرق تولويدين، بعدها يتم كمياً ونوعيا قيموا. وترد أمثلة للمشاكل الأكثر شيوعاً، فضلا عن الخطوات اللازمة للتخفيف من هذه المسائل.
Introduction
الأعصاب المحيطية تمتد في جميع أنحاء الجسم، إينيرفاتينج الأنسجة المستهدفة مع محاور عصبية الحركية أو الحسية1. العيوب الأعصاب المحيطية الناجمة عن الاضطرابات الطبية والصدمة تمثل شاغلا رئيسيا لصحة العامة والآثار الاقتصادية الكبيرة2،3. وعلى الرغم من التقدم الذي تحقق في تقييم نتائج إصابات الأعصاب المحيطية وفهم العصب التجدد، الأساليب التقليدية مثل الأنسجة العصبية وتلطيخ تقنيات أداتين أساسيتين كمياً ونوعيا تقييم صحة العصب كقياس نتائج المحطة طرفية في نماذج حيوانية أو قصت الأنسجة البشرية. هذا هو غالباً ما يقترن القياسات الكهربية لوظيفة الأعصاب الطرفية، حيث يمكن أن تكشف عن مورفوميتري لماذا تجدد الأعصاب وظيفية أو لم يحدث.
أزرق تولويدين تلطيخ راتنج المضمنة أقسام شبه رقيقة الأعصاب الطرفية هو أسلوب متخصصة للتصوير myelinated الألياف العصبية، توفير جودة عالية وواضحة صور مفصلة للعصب هياكل4،5،6 . أزرق تولويدين وصمة عار ميتاتشروماتيك acidophilic، اكتشف ويليام هنري بيركن في7من 1856، وقد تم استخدامه في العديد من التطبيقات الطبية8. تولويدين الأعصاب الطرفية ملطخة باللون الأزرق المقاطع التي تم الحصول عليها من شرائح جزءا لا يتجزأ من الراتنج العصب يسمح لتصور واضح لهياكل العصب. ويمكن تعزيز التصور هيكل غمد المايلين باستخدام أكسيد الاوزميوم بعد انتهاء التثبيت4،9. أكسيد الازميوم هو سامة الأكسدة والدهون مثبت عامل يتفاعل مع سندات مزدوجة في الدهون، أسفر عن10من اﻷغماد المايلين الغنية بالدهون محددة بشكل صارخ. بيد أكسيد الاوزميوم السامة، ومكلفة وتتطلب من حضانة أطول من شرائح العصب، ولا يستخدم دائماً.
وقد وضعت أساليب بديلة لمعالجة وتلطيخ للتصور مورفولوجيا الأعصاب المحيطية؛ البارافين وتمزيقها المبردة، وتقطيع العصب جزءا لا يتجزأ من راتنج الإيبوكسي تليها تلطيخ مع أزرق تولويدين أو حل فينيلينيدياميني قد استخدمت لقياس التغيرات المورفولوجية للأعصاب المحيطية التجديد 11،12 . كل هذه الأساليب لديها مزايا والغلة البيانات الأساسية في العدد من محاور عصبية وسمك المايلين وقطر إكسون وقطر إكسون للألياف ميليناتيد القطر (ز-نسبة) 11،،من1314،15 .
الفرق الأساسي من الراتنج التضمين في هذا البروتوكول أنه يسهل الحصول على 1-2 ميكرومتر سمك المقاطع العرضية بسبب صلابة الراتنج مع الحفاظ على الصفات النسيجي للعصب. توفر هذه المقاطع رقيقة، بدلاً من 4-5 ميكرومترات سمك المقاطع التي تم الحصول عليها من البارافين التضمين، أقسام الأعصاب الطرفية مع دقة أعلى، مما يسمح لتحديد كمي myelination إكسون، مثل نسبة ز، التي لا يمكن أن تكون أكثر دقة التي تم الحصول عليها من أثخن الأبواب16. بينما تمزيقها المبردة التي يمكن استخدامها للحصول على الأجزاء 1-2 ميكرومتر، فقد خبرتنا أن من الأصعب الحصول على المقاطع دون تصدعات كبيرة عديدة. يمكن أن يسبب مثل هذه المقاطع متصدع عد غير دقيق لعدد محاور عصبية وجوانب مييلينيشن.
بالإضافة إلى أزرق تولويدين تلطيخ17، يمكن أيضا استخدام فضية تلطيخ الأسلوب18 و Masson’s trichrome المصبوغة4 لإظهار العصب محاور عصبية. ومع ذلك، استخدام الراتنج تضمين المقاطع العصب الوسيط الفئران الملون مع أما الهيماتوكسيلين ويوزين أو ماسون في اﻷغماد المايلين خافت أظهرت trichrome وهياكل غير المعترف بها، بينما تلطيخ تولويدين الأزرق وأظهرت صورة واضحة المايلين غمد ويمكن بسهولة تكون الكمية4. وعلى الرغم من بعض القيود، الأعصاب تولويدين الأزرق تلطيخ راتنج المضمنة الطرفية هو تقنية قيمة يمكن استخدامها عندما تكون الصور عالية الدقة للعصب مورفولوجيا مطلوباً.
العيب الرئيسي لتضمين الراتنج هو أنها تستغرق وقتاً طويلاً ولا تسمح إيمونوستينينج النسيج نفسه نظراً لصعوبة استرجاع مستضد بالمقارنة مع البارافين وتقنيات الأقسام المضمنة المجمدة. وهكذا، من غير الممكن عموما الاستفادة من الأنسجة نفسها إيمونوستينينج التي يتم معالجتها عن طريق تضمين الراتنج لتلطيخ تولويدين الأزرق. على الرغم من عدم المستخدمة هنا، إذا كان المطلوب هو إيمونوهيستوتشيميستري في الراتنج يسمح المضمنة أقسام، استخدام ميثاكريلات غليكول التضمين راتنجات immunohistochemistry المراد تنفيذها على أقسام الأنسجة، إلا أنها باهظة الثمن نسبيا19. هذا يمكن التخفيف إلى حد ما بقطع الأعصاب الطرفية إلى أجزاء منفصلة، وبعض لتضمين الراتنج وآخرون ل immunostaining مباشرة بعد التثبيت.
عملية تولويدين الأزرق تلطيخ راتنج مضمن الأعصاب المحيطية، كما مع تحليل آخر نسيجية، يمكن تقسيم إلى خمس مراحل، بما في ذلك التثبيت، الجفاف، والتضمين، وتمزيقها، وتلطيخ20. ونحن نهدف هنا إلى توفير بروتوكول ومبادئ توجيهية عملية لاستخدام الراتنج الملون فروع العصب الوركي الفئران المضمنة مع تولويدين الأزرق للحصول على صور ذات جودة عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
امتحانات هياكل المورفولوجية لإصابة الأعصاب المحيطية والتجديد مواضيع متكررة من دراسة13. في هذا البروتوكول، يصف لنا الخطوات للحصول على صور ذات جودة عالية للبيانات النسيجي كوانتيفيكيشنز استخدام أنسجة العصب الوركي الفئران جزءا لا يتجزأ من كتل الراتنج والملون باللون الأزرق تول?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن ثانكثي “جنكينز مرفق الفحص المجهري” في جامعة وايومنغ لمساعدتهم، وأعضاء المختبر البوشمان، روبالو كيلي وصحيح هايدن، أوسيمانجيانج وبو وسوباش دونغانا، للمساعدة في رعاية الحيوان. هذا المنشور تسنى “جائزة التنمية المؤسسية” (فكرة) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة “معاهد الصحة الوطنية في” إطار منحة # 2P20GM103432.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol’s iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. . A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O’Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
