Summary

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Published: October 05, 2018
doi:

Summary

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Abstract

Verilen hedef gen düzenleyici elemanlarının tanımlaması için bir hedef gen düzenleyici elemanlarının konumlandırma ve etkisi boyutları değişkenlik nedeniyle önemli bir teknik sorun teşkil etmektedir. Bazı bioinformatic tahmin varlığı ve proksimal korunmuş transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri kullanarak aktif gen ekspresyonu ile ilişkili epigenetik değişiklikler fonksiyonu ile ilerlemeler kaydedilmiştir. Kromatin conformation yakalama çalışmaları yeteneğimizi fiziksel kromatin kişiler dizileri arasında ve tüm bir genom içinde bile keşfetmek için devrim. Dairesel kromatin conformation yakalama (4 C-seq), yeni nesil sıralama ile birleştiğinde özellikle, belirli bir sıra için olası tüm fiziksel kromatin etkileşimler (bakış), ilgi keşfetmek için bir hedef gen veya bir düzenleyici gibi tasarlanmıştır geliştirici. Geçerli 4C-seq stratejileri doğrudan bakış açısı içinde sıra ama çok sayıda gerektiren ve aynı anda üniforma teknik sorunları önlemek için sıralı için farklı bakış açıları (görüntüleme) arama sonraki nesil sıralama platformları ile baz. Bu birimin deney birçok laboratuarlar için pratik olmayabilir. Burada, bir ek Restriksiyon enzimi Özet ve farklı sıra okuma büyük bir yakalama kolaylaştırmak ve olasılığını azaltmak için tasarlanmış qPCR tabanlı amplifikasyon adımları içermektedir 4 C-seq protokolü için değiştirilmiş bir yaklaşım raporu PCR önyargı, anılan sıraya göre. Bizim tarihinde 4C mükellef kromatin mimari değerlendirmek için standart moleküler biyoloji laboratuarında yöntemidir.

Introduction

Gen ekspresyonu için düzenleyici elemanlarının tanımlaması tarafından kapsamlı bir şekilde insan genomu1,%280’i için fonksiyonel etkinlik açıklamalı DNA ansiklopedi öğelerini (kodlama) proje kolaylaştırdı. Vivo transkripsiyon faktörü bağlama, DNaseI aşırı duyarlılık ve epigenetik histon ve tek hücre türleri olarak DNA metilasyonu değişiklikleri için sitelerin kimlik fonksiyonel analizleri aday düzenleyici açtı öğeler için hedef gen ekspresyonu. Bu bulgular ile silahlı, biz düzenleyici elemanlarının ve genler arasındaki işlevsel Birleştiricisi belirleme sorun ile karşı karşıya olan. Özellikle, belirli hedef gen ve onun enhancer(s) ilişkisi nedir? Kromatin conformation yakalama (3C) yöntemi doğrudan bir bölge ilgi ve etkileşim dizileri ile yakalanan olayların sabit kromatin3 aday arasında tanımlayıcı fiziksel ve büyük olasılıkla fonksiyonel, etkileşimler tarafından bu soru adresleri . Etkileşimleri kromatin anlayışımız olarak, ancak, bu önceden seçilmiş aday loci incelenmesi gen-artırıcı etkileşimleri tam bir anlayış sağlamak yetersiz olduğu açıktır. Örneğin, kodla insan genomu (44 loci ayarla % 1, pilot) küçük bir bölümünü incelemek için kullanılan yüksek üretilen iş kromozom conformation yakalama karbon kopya (5 C) yöntem ve karmaşık Birleştiricisi loci bildirdi. Genler ve arttırıcılar ile tanımlanan etkileşimleri birçoğu kilobases doğrusal alanı4uzaklıkta bulunan yüzlerce edildi 2 – 4 farklı etkileşen ortakları ortalama. Ayrıca, Li ve ark. Çiftli-bitiş etiketi sıralama (çim) göre kromatin etkileşimi analiz bütün-genom organizatörü etkileşimleri analiz ve RNA polimeraz II bağlayıcı siteleri % 65’i kromatin etkileşimleri dahil bulundu için kullanılır. Bu etkileşimler bazıları büyük, çok gen kompleksleri kilobases genomik mesafe ve içeren, ortalama olarak, yüzlerce spanning her58-9 genler sonuçlandı. Birlikte, bu bulgular kromatin etkileşimleri sorguya tarafsız bütün-genom yöntemleri ihtiyacını vurgulamak. Bu yöntemlerden bazıları Schmitt ve arkiçinde incelenir. 6.

Kromatin conformation yakalama çalışmaları için daha yeni yöntemler bilinmeyen dizileri faiz6bölge ile etkileşim keşfi yeni nesil (Hi-C ve 4 C-seq) sıralama etkinleştir ile birleştiğinde. Özellikle, yeni nesil sıralama (4C-seq) ile dairesel kromozom conformation yakalama yakalanan kromatin proksimal için gelen DNA sekanslama tarafından bir tarafsız şekilde7 ilgi bir dizi ile etkileşim loci tanımlamak için geliştirilmiştir 3B alanda ilgi bölgesi. Kısaca, kromatin Restriksiyon enzimi ile i ciddi ve daha sonra etkileşen loci (Şekil 1) biyolojik ilgili “düğüm” yakalamak için sulu şartlarda bakmaksızın onun yerli protein-DNA etkileşimleri korumak için sabittir. Çapraz bağlantılar böylece ek bölünme için kullanılabilir DNA ile ikinci bir Restriksiyon enzimi bırakarak protein kaldırmak için tersine çevrilir. Son ligasyonu etkileşen loci daha küçük daireler oluşturur. Astar ilgi sıralaması için daha sonra aşağı akım sonraki nesil sıralama tarafından takip circularized parçaları, bilinmeyen sıralarının güçlendirilmiş bir kütüphane oluşturmak için kullanılır.

Numune hazırlama üzerinde duruluyor, burada anlatılan Protokolü varolan 4 C-seq yöntemleri8,9,10,11,12iki önemli değişiklikler yapar. İlk olarak, ampirik olarak amplifikasyon en uygun sayısı 4 C-seq Kütüphane hazırlık adımları için döngüleri ve böylece kitaplıkları aşırı amplifikasyon dallanma PCR önyargı olasılığını açığının belirlemek için qPCR tabanlı yöntemi kullanır. İkinci olarak, bu bir ek kısıtlama Özet adım bir çaba doğru Bankası-tarafından sıralama enstrüman arama engel ve dolayısıyla, benzersiz, bilgilendirici sırası her okuma en üst düzeye çıkarır bilinen “yem” dizileri tekdüzelik azaltmak için kullanılır. Diğer iletişim kuralları bu sorun birçok (12-15)8 4 C-seq kitaplıklar farklı yem dizileri ve/veya kısıtlama siteleri, diğer laboratuvarlar tarafından ulaşılabilir olmayabilir deneyler hacmi ile havuzu tarafından aşmak. Burada sunulan değişiklikler izin ver deneyler, az sayıda örnekleri ve/veya dizin ve bir tek şeride havuzlu çoğaltır.

Protocol

1. Restriksiyon enzimi seçimi Bir bölge ilgi tanımlamak (Örn., gen organizatörü, tek nükleotit polimorfizmi (SNP), artırıcı) ve biyoteknoloji bilgi (NCBI) için Ulusal Merkezi gibi depoları DNA dizisi elde. Bu faiz, sıra içinde hangi yapışkan uçlar (DNA termini çıkıntılar ile) sonra sindirim üretmek uygun ve faaliyetlerini tarafından inhibe değil ilk Restriksiyon enzimi sindirim için (RE1) aday enzimleri (REs) tanımlamak KSY metilasyonu.Not: Veri çözümlenmesi R…

Representative Results

Birincil insan Lenfositi 2-3 atılan yenidoğan foreskins izole edildi, havuza alınan ve kültürlü takıma KSFM 30 µg/mL ile sığır hipofiz özü, 0,26 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü ve 0.09 mM kalsiyum klorür (CaCl2 ) 37 ° c, % 5 karbon dioksit. Hücreleri iki şişe ayrılmış ve bir şişeye CaCl2 ek tarafından Proliferasyona üzerinden 72 h. 107 hücreler her için 1,2 mM son bir konsantrasyon için Ayrıştırılan ve n…

Discussion

4C sonuçları önceden bilinmeyen düzenleyici elemanlarının tanımlayabilirsiniz kromatin etkileşimleri ve/veya bir belirli biyolojik bağlamda24,25,26yılında önemli hedef genleri ortaya potansiyeline sahip. Ancak, teknik engellerin Bu deneylerden elde edilen veriler sınırlayabilir. 4 C protokolleri şablonunda aşırı amplifikasyon kaynaklanan PCR önyargı olasıdır. Bu iletişim kuralı döngüleri amplifikasyon e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser NIAMS (R01AR065523) tarafından desteklenmiştir.

Materials

HindIII NEB R0104S
CviQI NEB R0639S
DNA oligonucleotide primers IDT To be designed by the reader
50 mL conical centrifuge tubes Fisher Scientific 06-443-19
1.7 mL microcentrifuge tubes MidSci AVSS1700
Phosphate buffered saline Thermo Fisher 14190-136
Formaldehyde, methanol free Electron Microscopy Sciences 15710
Nutator VWR 15172-203
Glycine JT Baker 4059-00
Benchtop centrifuge
Refrigerated microcentrifuge
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED2SS
20% SDS solution Sigma-Aldrich 05030
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
Glass slides Fisher Scientific 12-550-143
Cover slips VWR 16004-094
Light microscope
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
Shaking heat block
2M Tris-HCl Quality Biological 351-048-101
Proteinase K NEB P8107S
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) Sigma-Aldrich P2069
Sodium acetate Sigma-Aldrich M5661
20 mg/mL glycogen Thermo Fisher R0561
Ethanol Fisher Scientific 04-355-223
Nuclease-free water Fisher Scientific MT-46-000-CM
qPCR cycler Thermo Fisher 4453536
qPCR plates Thermo Fisher 4309849
Thermocycler Thermo Fisher 4375786
PCR strip tubes MidSci AVSST-FL
1M Magnesium chloride Quality Biological 351-033-721
Dithiothreotol Sigma-Aldrich 43815
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Agarose Sigma-Aldrich A6013
RNase A Thermo Fisher EN0531
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
MinElute PCR Purification kit Qiagen 28004
Spectrophotometer
Expand Long Template PCR System Sigma-Aldrich 11681834001
dNTP mix Thermo Fisher R0191
SYBR Green I Sigma-Aldrich S9430
ROX BioRad 172-5858
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation System Promega M8221
SYBR Safe Thermo Fisher S33102
Taq Polymerase NEB M0267S
UltraSieve Agarose IBI Scientific IB70054
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704

References

  1. Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
  3. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
  6. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  7. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
  8. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  9. Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, (2012).
  10. Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
  11. Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
  12. Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
  13. Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
  14. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  15. Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
  16. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
  20. Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
  21. Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
  22. Williams, R. L., et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
  23. McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
  24. Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
  25. Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
  26. Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).

Play Video

Cite This Article
Brettmann, E. A., Oh, I. Y., de Guzman Strong, C. High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). J. Vis. Exp. (140), e58030, doi:10.3791/58030 (2018).

View Video