זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)
Summary
הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.
Abstract
זיהוי רכיבי רגולטוריות עבור גן יעד נתון מהווה אתגר טכני משמעותי בשל ההשתנות בגדלים מיצוב ותוצאה של האלמנטים רגולטוריות גן המטרה. התקדמות נעשתה עם התחזית bioinformatic על קיומו פונקציה של proximal שינויים epigenetic המשויך ביטוי גנים מופעל באמצעות אתרי קישור פקטור שעתוק ההכפלה. כרומטין קונפורמציה לכידת מחקרים מהפכה ביכולת שלנו לגלות את הקשר הפיזי כרומטין בין רצפים, אפילו במרחק של הגנום כולו. כרומטין מעגלית קונפורמציה לכידת יחד עם הדור הבא רצפי (4C-seq), בפרט, מיועד לגלות את האינטראקציות כרומטין הפיזי כל האפשריות עבור רצף נתון עניין (התצפית), כגון גן המטרה או רגולציה-תקינה משפר. אסטרטגיות 4C-seq הנוכחית ישירות רצף של תוך נקודת התצפית אבל דורשים רבים, נקודות מבט מגוונות בו-זמנית שנקבע כדי למנוע את האתגרים הטכניים של מדים לבסס מתקשר (הדמיה) עם פלטפורמות רצף ‘ הדור הבא ‘. אמצעי אחסון זה של ניסויים לא יכול להיות פרקטי עבור מעבדות רבות. כאן, אנחנו מדווחים בגישה שונה פרוטוקול 4C-seq המשלבת תקציר של אנזים הגבלה נוספים וגם הגברה מבוססת qPCR צעדים שנועדו להקל על לכידה גדול הקריאות רצף מגוונות או להמתיק את הפוטנציאל PCR הטיה, בהתאמה. שיטה 4C ששונה שלנו היא נוטה? המעבדה לביולוגיה מולקולרית סטנדרטי להערכת אדריכלות כרומטין.
Introduction
כבר בהנחייתם של זיהוי רכיבי הרגולציה על ביטוי גנים הפרויקט האנציקלופדיה של ה-DNA אלמנטים (קידוד) באופן מקיף מבואר פעילות פונקציונלית עבור 80% של הגנום האנושי1,2. הזיהוי של האתרים ויוו איגוד פקטור שעתוק, רגישות יתר DNaseI, ואת היסטון epigenetic שינויים מתילציה DNA סוגי תאים בודדים סלל את הדרך הניתוחים פונקציונלי של המועמד רגולטוריות רכיבים של ביטוי גנים היעד. חמושים עם ממצאים אלה, אנו מתמודדים עם האתגר של קביעת את מסופר פונקציונלי בין אלמנטים רגולטוריות גנים. באופן ספציפי, מהו הקשר בין גן יעד נתון enhancer(s) שלה? שיטת הלכידה (3 ג) קונפורמציה כרומטין מטפל ישירות שאלה זו על ידי זיהוי פיזי, וסביר פונקציונליים, האינטראקציות בין אזור עניין לבין המועמד אינטראקציה רצפים דרך אירועים שנתפסו בכרומטין קבוע3 . כפי הבנתנו כרומטין אינטראקציות גדל, עם זאת, ברור כי החקירה של המועמדים שנבחרו מראש לוקוסים אינה מספיקה לספק הבנה מלאה של ג’ין-enhancer אינטראקציות. לדוגמה, קדד השתמש בשיטת עותק מוספר (5 ג) לכידת תפוקה גבוהה קונפורמציה כרומוזומלית לבחון חלק קטן של הגנום האנושי (1%, פיילוט של לוקוסים 44) ודיווח מסופר מורכבים של לוקוסים. גנים ומוצרי טיפוח טבעיים עם אינטראקציות מזוהה בממוצע 2-4 שותפים אינטראקציה שונים, רבים מהם היו מאות kilobases משם, מרחב לינארי4. יתרה מזאת, Li ואח. משמש כרומטין ניתוח האינטראקציה לפי מדגמים מזווגים-End תג רצף (דשא) כדי לנתח את כל הגנום מקדם אינטראקציות ומצא כי 65% של RNA פולימראז II איגוד אתרים היו מעורבים באינטראקציות כרומטין. חלק אינטראקציות אלה גרמו קומפלקסים גדולים, רב הגן משתרע על פני מאות kilobases של מרחק גנומית, המכיל, בממוצע, 8-9 גנים כל5. יחד, ממצאים אלה מדגישות את הצורך שיטות הגנום כולו לא משוחד חקירת האינטראקציות כרומטין. חלק משיטות אלה נבדקות שמיט ואח. 6.
שיטות חדשות יותר ללימודי לכידת קונפורמציה כרומטין יחד עם הדור הבא רצף (Hi-C ו- 4C-seq) לאפשר הגילוי של רצפי לא ידועה אינטראקציה עם אזור של ריבית6. באופן ספציפי, לכידת קונפורמציה כרומוזום מעגלי עם הדור הבא רצפי (4C-seq) פותחה כדי לזהות לוקוסים אינטראקציה עם רצף של עניין לא משוחדת באופן7 על-ידי קביעת רצף ה-DNA של מקורב ל שנתפסו כרומטין אזור עניין במרחב תלת-ממדי. בקצרה, כרומטין קבוע כדי לשמור על אינטראקציות חלבון-DNA המקורי שלה, ביקע עם אנזים ההגבלה ולאחר מכן מאתרים בתנאים שתדללו ללכוד ביולוגית רלוונטית “קשרים” של אינטראקציה לוקוסים (איור 1). הקישורים קרוס מתבטלות כדי להסיר את החלבון, ובכך משאיר ה-DNA זמינים עבור ביקוע חלבונים נוספים עם אנזים ההגבלה השנייה. מצדו הסופי יוצר עיגולים קטנים של לוקוסים אינטראקציה. תחל רצף של עניין משמשות לאחר מכן ליצור ספריה מוגבר של רצפי לא ידוע מן השברים circularized, ואחריו רצף הדור הבא במורד הזרם.
פרוטוקול המובאים כאן, אשר מתמקדת הכנת הדוגמא, הופך את שני שינויים עיקריים ל קיימים 4C-seq שיטות8,9,10,11,12. ראשית, היא משתמשת שיטה המבוססת על qPCR מדעית לקבוע המספר האופטימלי של הגברה מחזורים עבור שלבי הכנה ספריית 4C-seq, ובכך מפחית את הסיכון של הפוטנציאל של הטיה PCR הנובעות הגברה יתר של ספריות. שנית, היא משתמשת צעד תקציר הגבלה נוספת במאמץ להפחית האחידות של רצפים “פיתיון” ידוע מעכבת בסיס-טלפון מדויק על ידי המכשיר רצף, ומכאן, ממקסם את רצף ייחודי, מקיף ב כל קריאה. פרוטוקולים אחרים לעקוף בעיה זו על-ידי איגוד רבים (12-15),8 4 C-seq ספריות עם פיתיון שונים רצפים ו/או הגבלת אתרים, נפח של ניסויים אשר לא ניתן להשגה על ידי מעבדות אחרות. השינויים המוצגים כאן מאפשרים מספר קטן של ניסויים, דוגמאות, ו/או משכפל באינדקס, איחדו לתוך נתיב אחד.
Protocol
Representative Results
Discussion
תוצאות 4C יש פוטנציאל לחשיפת אינטראקציות כרומטין לזיהוי רכיבי הרגולציה לא מוכרת ו/או היעד גנים חשובים בהקשר ביולוגי מסוים24,25,26. עם זאת, מכשולים טכניים עלולה להגביל את הנתונים המתקבלים ניסויים אלה. הטיה PCR הנובעות הגברה יתר של תבנית ב- 4 C פרו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIAMS (R01AR065523).
Materials
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
References
- Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, (2012).
- Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
- Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
- Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
- Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
- Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
- Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
- Williams, R. L., et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
- McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
- Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
- Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
- Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).
