Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

Die Identifizierung regulatorischer Elemente für die Genexpression wurde durch die Enzyklopädie von DNA-Elemente (ENCODE) Projekt erleichtert, die funktionelle Aktivität für 80 % des menschlichen Genoms^1,2umfassend kommentiert. Die Identifizierung der Standorte für in Vivo Transkription Faktor Bindung, DNaseI Überempfindlichkeit und epigenetischen Histon und DNA-Methylierungänderungen in einzelnen Zelltypen ebnete den Weg für die Funktionsanalysen des Kandidaten regulatorischen Elemente für Ziel-gen-Expression. Bewaffnet mit diesen Erkenntnissen, stehen wir vor der Herausforderung, zur Bestimmung der funktionellen Interkonnektivität zwischen regulatorische Elemente und Gene. Speziell, was die Beziehung zwischen einem bestimmten Zielgen und seine Enhancer(s) ist? Die Chromatin Konformation Capture (3C)-Methode-Adressen direkt diese Frage durch identifizierende körperliche und wahrscheinlich funktional, Interaktionen zwischen einer Region of Interest und Kandidat Interaktion Sequenzen durch aufgezeichneten Ereignisse in festen Chromatin³ . Da unser Verständnis von Chromatin Interaktionen zugenommen hat, ist es jedoch klar, dass die Untersuchung der vorausgewählten Kandidaten Loci nicht ausreicht, um ein vollständiges Verständnis der Gen-Enhancer Interaktionen zur Verfügung zu stellen. Zum Beispiel ENCODE Hochdurchsatz-chromosomalen Konformation Capture-Kopie (5C)-Methode verwendet, um einen kleinen Teil des menschlichen Genoms (1 %, pilot set 44 Loci) untersuchen und komplexe Vernetzung der Loci berichtet. Gene und Geschmacksverstärker mit identifizierten Interaktionen durchschnittlich 2 – 4 verschiedenen Interaktionspartnern, von die viele Hunderte von Kilobases entfernt in linearen Raum⁴waren. Darüber hinaus Li Et Al. Chromatin-Interaktions-Analyse durch Paired-End Tag Sequenzierung (ChIA-PET) zur Vollständiggenom Promotor Interaktionen zu analysieren und festgestellt, dass 65 % der RNA-Polymerase II Bindungsstellen an Chromatin Interaktionen beteiligt waren. Einige dieser Interaktionen führte zu großen, Multi-gen komplexe umfasst hunderte von Kilobases der genomischen Distanz und mit durchschnittlich 8-9 Gene jeweils⁵. Zusammen, unterstreichen diese Ergebnisse die Notwendigkeit für unvoreingenommene Vollständiggenom Methoden zur Abfrage von Chromatin Interaktionen. Einige dieser Methoden sind im Schmitt Et al.überprüft. ⁶.

Neuere Methoden zur Chromatin Konformation erfassen Studien gepaart mit Next-Generation Sequenzierung (Hi-C und 4C-Seq) ermöglichen die Entdeckung des unbekannten Sequenzen, die Interaktion mit einer Region von Interesse⁶. Kreisförmigen Chromosom Konformation Aufnahme mit Next Generation Sequencing (4C-Seq) wurde speziell für Loci, die Interaktion mit einer Abfolge von Interesse an eine unvoreingenommene Weise⁷ durch Sequenzierung von DNA aus aufgenommenen Chromatin proximal zu identifizieren die Region des Interesses im 3D-Raum. Kurz gesagt, ist Chromatin befestigt bewahren seine native Protein-DNA-Wechselwirkungen, mit einem Restriktionsenzym gespalten und anschließend ligiert verdünnte Bedingungen biologisch relevante “Verwicklungen” interagierenden Loci (Abbildung 1) zu erfassen. Die Querverbindungen sind umgekehrt, um das Protein, wodurch die DNA für zusätzliche Spaltung mit einem zweiten Restriktionsenzym entfernt. Eine endgültige Verbindung erzeugt kleinere Kreise der interagierenden Loci. Primer an die Reihenfolge des Interesses werden dann verwendet, um eine verstärkte Bibliothek von unbekannten Sequenzen aus circularized Fragmente, gefolgt von nachgelagerte Sequenzierung der nächsten Generation zu generieren.

Das Protokoll hier vorgestellten, dessen Schwerpunkt Probenvorbereitung macht zwei wichtige Änderungen an bestehenden 4C-Seq Methoden^8,9,10,11,12. Zunächst wird eine qPCR basierende Methode um empirisch zu bestimmen, die optimale Anzahl der Verstärkung Zyklen für 4C-Seq Bibliothek Vorbereitungsschritte und mindert somit das Potenzial für PCR-Bias aus Überverstärkung Bibliotheken. Zweitens wird einen zusätzliche Einschränkung Digest Schritt in dem Bemühen um die Einheitlichkeit der bekannten “Köder” Sequenzen zu reduzieren, die behindert genaue Basis-Aufruf durch das Instrument der Sequenzierung und somit maximiert die einzigartigen, informative Reihenfolge bei jedem Lesevorgang. Andere Protokolle umgehen dieses Problem durch die Bündelung von vielen (12-15)⁸ 4 C-Seq Bibliotheken mit verschiedenen Köder Sequenzen bzw. Restriktionsschnittstellen, ein Volumen von Experimente, die von anderen Labors nicht erreicht werden kann. Die hier vorgestellten Änderungen erlauben eine kleine Anzahl von Experimenten, Proben, und/oder repliziert werden indiziert und gebündelt in einer einzigen Spur.