Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) ist ein fest gefügten Organismus verbreitet als Modell für die Untersuchung der Krankheit sowie für präklinische Tests von therapeutische Hypothesen^1,2,3. Diese Tiere haben eine kurze Generationszeit, sind leicht zu verarbeiten, zeigen eine hohe Fortpflanzungsrate, low-cost und genetische Manipulationen durch Mikroinjektion von DNA in Embryonen⁴leicht zugänglich sind. Durch die zunehmende Entwicklung neuartiger transgener und gen Bearbeitung Technologien wie Zinkfinger-Nukleasen (ZFN)⁵, TAL-wie Effektor Nukleasen (TALENs)^6,7, und die gruppierten regelmäßig dazwischen kurz Palindromische wiederholt (CRISPR) / CRISPR-assoziierten 9 (Cas9) System⁸, dem Zebrafisch wird balanciert, um das Verständnis der verschiedenen pathologischen Bedingungen wesentlich zu verbessern. Diese Technologien wurden verwendet, um gezielte Knockouts in beiden somatische erstellen und Keimbahnzellen im Zebrafisch, effizient erzeugt genetisch modifiziert Tiere⁸. Jüngste Beispiele in der Literatur sind die erfolgreiche Entwicklung von genetischen Modellen von Epilepsie und Stoffwechselstörungen im Zebrafisch^3,9,10,11,12 .

Mit den Fortschritten im Zebrafish Genom-Bearbeitung ist schnelle und zuverlässige Genotypisierung eine unbestreitbare Bandbreitenbegrenzung Schritt geworden. Identifizierung von spezifischen DNA-Mutationen angrenzend an den vorhergesagten Erbgut Bearbeitung Zielstandort ist eine wichtige Etappe des Protokolls. Traditionell, sind Genotypisierung Techniken von Fin Clipping in der Regel nur bei Jugendlichen oder Erwachsenen Zebrafisch. Aber der Zeitaufwand erhöhen Zebrafisch bis zum Erwachsenenalter (> 2 Monate) Fortschritte in der Forschung erheblich verzögert. In vielen Fällen kann durch den Knockout der wesentlichen Gene (z. B. in der Krankheit Modellierung) oder Gain-of-Function-Mutationen führen zu schädlichen phänotypischen Auswirkungen Erwachsenenalter erreicht werden. Darüber hinaus mehrere Assays erfordern, Bündelung von Larven, z. B. in RNA oder Metaboliten Extraktion und beinhalten damit vorherige Identifizierung der Genotypen, die schwierig sein kann, wenn nur post-Hoc Genotyping Techniken verfügbar sind. Diese genannten Beispiele unterstreichen die Bedeutung der Larven Genotypisierung Techniken die zur gleichen Zeit präzise und vollständige Genesung und die normale Entwicklung der Larven zu ermöglichen. Frühen Stadium Zebrafisch Genotypisierung scheinen derzeit nicht am meisten benutzt sein; Dies spiegelt sich durch aktuelle Publikationen der Krankheitsmodelle in denen Larven Genotypen über Post-Mortem-Genotypisierung anstatt Genotypisierung vor der Ausführung des Experiments^12,13,14identifiziert werden. In diesem Papier ist eine Larven Fin Clip Strategie vorgestellt, mit dem Ziel, vorher festgelegten Genotypisierung Verfahren zu verbessern.

In der Vergangenheit Leben Strategien beschäftigen Proteinase K-Verdauung, Genotyp Zebrafisch, die Larven zu Variablen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Effizienz¹⁵geführt haben. Obwohl mehr vor kurzem mikroskopische Schweif Biopsie Technik zur Verfügung gestellt viel versprechende Ergebnisse¹⁶veröffentlicht, waren wir und andere Gruppen nicht in der Lage, die hohe Effizienz und DNA Wiederherstellung berichtet von den Autoren zu reproduzieren. Ein schwerer Rückschlag des Protokolls von Wilkinson Et Al. beschrieben ¹⁶ kann die Übertragung des Gewebes Heck mit dem PCR-Rohr. Aufgrund seiner mikroskopischen Größe ist es hart, um sicherzustellen, dass die Flosse wurde ordnungsgemäß gesammelt und durch pipettieren verzichtet. Um diese Barriere zu begegnen, haben wir eine verbesserte Protokoll für die Genotypisierung zahlreicher live zebrafischlarven mit fast 100 % Wirkungsgrad⁹entwickelt. Mit einer Microscalpel, die Fin Schwanzspitze entfernt und auf ein Stück Filterpapier gelegt. Das Stück Filterpapier mit dem Gewebe kann leicht visualisiert und in ein PCR-Röhrchen korrekt platziert. Genomische DNA-Extraktion erfolgt dann, gefolgt von PCR-Amplifikation der Region von Interesse zum Genotyp der Probe. Die Vorteile dieser Methode sind eine hohe Effizienz der PCR, einer niedrige false-positive-Rate und eine niedrige Sterblichkeitsrate. Darüber hinaus ist die Genotypisierung einer großen Anzahl von Embryonen möglich unter Verwendung dieses Protokolls. Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht Fin-Clipping von Hunderten von Larven innerhalb von 2-3 Stunden mit diesem Ansatz und korrekte Identifizierung der genotypisiert Fisch und Schweif Regeneration innerhalb von zwei Tagen.