O uso do Mouse Splenocytes para avaliar a influência do patógeno associado padrão Molecular na expressão gênica de relógio

O pulso de disparo mestre em mamíferos, que coordena as oscilações de 24h para quase todos os aspectos da fisiologia e comportamento, está localizado dentro do núcleo supraquiasmático (SCN) do hipotálamo^1,2. Além de processos biológicos a nível de regulação, o pulso de disparo mestre também sincroniza periféricos relógios celulares em todo o corpo,^3,4,5. Enquanto as máquinas de relógio molecular consiste de pelo menos três loops de feedback transcriptional-translacional interligadas, o núcleo é composto do período (Per1-3), prevenção (Cry1-2), Bmal1, e relógio genes^6,7. Além de manter a altura exata do relógio molecular núcleo, alguns produtos de genes do relógio auxiliares (por exemplo, Rev-erbα e Dbp) também regulam a expressão de genes não-tempo, ou seja, clock genes controlados (CCGs)^{6 , 7}.

Funcionais relógios moleculares têm sido descritos em vários tecidos imune (por exemplo, baço e linfonodos)⁸ e células (por exemplo, B células, as células dendríticas, macrófagos)^8,9. Estas células detectam e respondem a padrões moleculares associados patógeno (PAMPs), componentes microbianos conservadas, via receptores de reconhecimento imune inata como receptores Toll-like (TLRs)¹⁰. Até à data, têm sido descritos 13 TLRs funcionais, que reconhecem constituintes microbianos, como componentes da parede celular bacteriana, flagelar proteínas e ácidos nucleicos microbial¹⁰. O PAMP, lipopolissacarídeo (LPS), um componente da parede celular de bactérias Gram-negativas, reconhecido por TLR4, foi mostrado para alterar o ritmo circadiano nos níveis de organismos e moleculares. Por exemplo, na vivo desafio de LPS induzido atrasos fótica-como fase medido pela atividade em ratos¹¹ e levou à expressão do gene relógio reduzida no SCN e no fígado, conforme determinado pela hibridação in situ e PCR quantitativo, respectivamente, em ratos,¹². Depois de um desafio na vivo com LPS, análise de leucócitos do sangue periférico humano¹³ e tecido adiposo subcutâneo¹⁴ revelou expressão alterada de vários genes de relógio, medido através de qPCR. Por último, ex vivo desafios LPS de macrófagos humanos e macrófagos peritoneais de rato, também levados a alteraram a expressão relógio medida pelo qPCR¹⁴.

Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a influência dos PAMPs LPS, ODN1826 (oligonucleotídeos sintéticos contendo unmethylated motivos CpG) e matou o calor Listeria monocytogenes (HKLM), reconhecido por TLR4 e TLR9 TLR2, respectivamente, na expressão gênica de relógio molecular em splenocytes de rato. O protocolo inclui esplenectomia rato, isolamento de splenocyte e desafio, RNA extração, síntese do cDNA e qPCR para avaliar a expressão de vários genes do relógio. Este protocolo permite a aquisição atempada de um grande número de células do sistema imunológico com muito pouco animal ou manipulação celular, que pode então ser desafiado ex vivo com diversos PAMPs. O relógio molecular tem sido mostrado para modular a vários aspectos da resposta imune^8,15,16, portanto, interrupção do relógio molecular provavelmente iria prejudicar a adequada variação dependente do tempo da resposta imune. Além disso, uma vez que as perturbações do ritmo circadiano podem levar a graves patologias^17,18,19,20, pode ser de interesse para os investigadores desafiar splenocytes com uma ampla gama de moléculas e avaliar sua influência sobre o relógio.