時計遺伝子の発現に対する病原体関連分子パターンの影響を評価するためにマウスの脾細胞の使用
Summary
このプロトコルでは、マウスの脾細胞を使用して分子時計遺伝子発現を変更、病原体関連分子パターンを発見する手法について説明します。
Abstract
遺伝子発現への動作は、概日リズムは、生理学のほぼすべての側面を調節します。ここでは、病原体関連分子パターン (PAMPs) リポ多糖 (LPS)、ODN1826、熱殺されたリステリア菌とマウス脾細胞に挑戦し、概日リズムの分子の影響を検証する手法を提案します。時計。以前は、研究はさまざまなモデル (例えばマウス、ラットおよび人間) の品揃えから体内と体外のアプローチを使用して分子時計に LPS の影響を調べることに焦点を当てています。このプロトコルでは、分離と定量的 PCR によって時計遺伝子発現後挑戦を評価する方法論と同様に、脾細胞の挑戦をについて説明します。このアプローチは、だけでなく時計の表現を変えることができると同様に他の分子が、分子時計に微生物成分の影響を評価するために使用することができます。このアプローチは、時計式に影響を与える種緑化トール様受容体相互作用の分子機構をいじめる離れて利用できます。
Introduction
生理学および行動のほぼすべての側面の 24 h 振動を調整、哺乳類で、マスターのクロックは視床下部1,2の視交叉上核 (SCN) 内にあります。個体レベルでの生物学的プロセスを制御する、に加えてマスター時計はまた体3,4,5を通じて末梢細胞時計を同期します。コアは、期間(Per1 3)、クリプト(Cry1 2)、 Bmal1で構成されています一方、分子時計の機械は少なくとも 3 つの連動転写翻訳フィード バック ループから成っている、時計遺伝子6,7.コア分子時計の正確なタイミングを維持する以外にもいくつかの補助的な時計遺伝子産物 (例えば、試とDbp) はまた非時計遺伝子の発現を調節する、すなわち、時計被制御遺伝子 (CCGs)6,7。
機能分子時計は、様々 な免疫組織 (例えば、脾臓およびリンパ節)8と細胞 (例えば、 B 細胞、樹状細胞、マクロファージ)8,9に記載されています。これらの細胞は検出し、病原体関連分子パターン (PAMPs)、Toll 様受容体 (Tlr)10などの自然免疫認識受容体を介して、保存された微生物のコンポーネントに対応します。これまで、細菌の細胞壁構成成分、べん毛タンパク質は、微生物の核酸10など微生物の成分を認識する、13 の機能的な Tlr が記載されています。種緑化、リポ多糖 (LPS)、TLR4、によって認識されるグラム陰性菌の細胞壁の成分は、生物・分子レベルでの概日リズムを変更する示されています。たとえば、組合の生体内で挑戦の閃光のような位相遅延マウス11の活動によって測定されると SCN と肝臓の in situハイブリダイゼーションおよび量的な PCR によって決定される減らされた時計遺伝子発現につながったそれぞれのラットの12を実行します。組合の指定する生体内で挑戦後、ひと末梢血白血球13と皮下脂肪14の分析は、qPCR を介して測定としていくつかの時計遺伝子の発現の変化を明らかにしました。最後に、ヒトのマクロファージともにつながったマウス腹腔マクロファージの LPS 挑戦前のヴィヴォ時計式 qPCR14によって測定されるように変更。
ここでは、ODN1826 (を含む総合的なオリゴヌクレオチド非メチル化 CpG モチーフ)、PAMPs LPS の影響を評価するためのプロトコルについて述べると熱殺されたリステリア菌(HKLM)、TLR4、TLR9、TLR2、認識にそれぞれ、マウス脾細胞における分子時計遺伝子発現。マウス脾臓摘出術、卵白アルブミンの分離とチャレンジ、RNA 抽出、cDNA 合成、qPCR いくつか時計遺伝子の発現を評価するために、プロトコルが含まれます。このプロトコルは、非常に小さな動物に免疫細胞の数が多いのタイムリーな取得またはすることができますし、携帯電話の操作は前のヴィヴォ様々 な PAMPs と挑戦します。免疫応答8,15,16のさまざまな側面を調節する分子時計が示されている、したがって、分子時計の破壊の適切な時間に依存した変動損なう可能性が高く、免疫応答。さらに、概日リズムの混乱は深刻な病態17,18,,1920につながることができます、のでそれがあります脾細胞の広い範囲に挑戦する研究者にとっての分子時計への影響を評価します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、定量化し、遺伝子の発現を決定する際に使用されている RNA の純度を評価する微量分光光度計を使用できます。核酸は 260 で紫外線を吸収する nm、蛋白質は通常 280 で光を吸収する nm、RNA 抽出プロシージャ (例えばフェノール) 中に使用される他の潜在的な汚染物質が 230 で検出可能な nm。したがって、吸光度 260/280 (、) の比を評価することにより nm (蛋白質に RNA) ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業によって支えられた教員研究費ハートフォード大学の教養と科学学部長のオフィスから。
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O’Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- . Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
