Het gebruik van de muis Splenocytes om te beoordelen van de pathogeen-geassocieerde moleculaire patroon invloed op klok genexpressie

De master klok in zoogdieren, die 24u oscillaties voor bijna alle aspecten van de Fysiologie en gedrag regisseert, is gelegen in de kern (SCN) van de suprachiasmatic van de hypothalamus^1,2. Naast het reguleren van biologische processen op een organisch niveau, synchroniseert de master klok ook perifere cellulaire klokken in heel het lichaam^3,4,5. Terwijl de moleculaire klok machine uit ten minste drie elkaar grijpende transcriptionele-translationeel feedbacklussen bestaat, de kern bestaat uit de periode (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, en klok genen^6,7. Naast het behoud van de precieze timing van de kern moleculaire klok, sommige bijkomende klok genproducten (bijvoorbeeld Rev-erbα en Dbp) regelen ook expressie van genen die niet-klok, dat wil zeggen, klok gecontroleerde genen (CCGs)^{6 , 7}.

Functionele moleculaire klokken zijn beschreven in de diverse immuun weefsels (bijvoorbeeld, milt en lymfklieren)⁸ en cellen (bijvoorbeeld B cellen, dendritische cellen, macrofagen)^8,9. Deze cellen detecteren en inspelen op de pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), geconserveerde microbiële componenten, via receptoren van het aangeboren immuun erkenning zoals Toll-like receptoren (TLRs)¹⁰. Tot op heden, zijn 13 functionele TLRs beschreven, die microbiële bestanddelen zoals bacteriële celwand onderdelen, flagellar eiwitten en nucleïnezuren microbiële¹⁰herkennen. De PAMP, lipopolysaccharide (LPS), een onderdeel van de celwand van gram-negatieve bacteriën herkend door TLR4, heeft aangetoond dat het circadiane ritmen op zowel organisch en moleculaire niveau wijzigen. Bijvoorbeeld, in vivo uitdaging van LPS geïnduceerde fotische-achtige fase vertragingen zoals gemeten door activiteit in muizen¹¹ en heeft geleid tot verminderde klok genexpressie in de SCN en de lever in situ hybridisatie en kwantitatieve PCR, volgens respectievelijk in ratten¹². Na een in vivo uitdaging met LP’s bleek de analyse van perifere bloed leukocyten¹³ en onderhuids vetweefsel¹⁴ veranderde expressie van verschillende klok genen zoals gemeten via qPCR. Tot slot, ex vivo LPS uitdagingen van menselijke macrofagen en muis peritoneale macrofagen, ook geleid tot gewijzigd klok expressie zoals gemeten door qPCR¹⁴.

Hier beschrijven we een protocol voor de beoordeling van de invloed van de PAMPs LP’s, ODN1826 (synthetische oligonucleotides met unmethylated apr motieven), en warmte-gedood Listeria monocytogenes (HKLM), erkend door TLR4, TLR9 en TLR2, respectievelijk op moleculaire klok genexpressie in muis splenocytes. Het protocol bevat muis splenectomie, splenocyte isolatie en uitdaging, RNA extractie, cDNA synthese en qPCR om te beoordelen van de expressie van genen die verschillende klok. Dit protocol zorgt voor de tijdige verwerving van een groot aantal immuuncellen met zeer weinig dier of cellulaire manipulatie, die vervolgens kan worden uitgedaagd ex vivo met verschillende PAMPs. De moleculaire klok is aangetoond dat het moduleren van de verschillende aspecten van de immuunrespons^8,15,16, verstoring van de moleculaire klok zou daarom waarschijnlijk afbreuk doen aan de correcte tijd-afhankelijke variant van de immuunrespons. Bovendien, aangezien onderbrekingen van de circadiane ritmen tot ernstige pathologieën^{17,18,19,20 leiden kunnen}, kan het interessant zijn voor onderzoekers aan te vechten van splenocytes met een breed scala aan moleculen en hun invloed op de klok te beoordelen.