Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi
Summary
Biz oksijen tüketimi ve Drosophila melanogaster larva ve yetişkin Beynindeki hücre dışı asitleştirme ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bir metabolik analyzer adapte ve en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı ile kullanılmaktadır. Mikro-doku bağlar bu protokolü kritik bileşenidir ve tasarlanmış ve bunların kullanımı bu analizi için özel olarak yaratılmıştır.
Abstract
Bu iletişim kuralı Drosophila melanogaster larva ve yetişkin beyin metabolizmasında ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bütün organları metabolizmasında miktarının primer hücre ve hücre hatları analiz ederken yakalanamayan enerji kullanımı bir doku düzeyinde anlayış sağlar. Bu analiz ex vivoolmakla birlikte, ölçüm bir dokuda bir fonksiyonu gerçekleştirmek için birlikte çalışan özel hücreler bir dizi için izin verir ve daha yakından vivo içinde organ modelleri. Metabolik yeniden programlama neoplazi ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıklarda gözlenmiştir. Bu iletişim kuralı bir ticari olarak mevcut metabolik Çözümleyicisi’ni kullanarak nörolojik hastalık modelleri metabolizmasında D. melanogaster toplumun Soruşturmama yardım etmek için geliştirilmiştir. Metabolik Çözümleyicisi’ndeki tüm beyin metabolizma ölçme beyin geometri nedeniyle zordur. Bu analiz örnekleri bir 96-şey tabak dibinde kalmasını gerektirir. Hücre örnekleri ve doku yumruklar hücre plaka yüzeyine bağlı veya küresel kaplamalar, sırasıyla kullanmak. Ancak, küresel, üç boyutlu şekle D. melanogaster beyin doku plakasına kalarak engeller. Bu iletişim kuralı Çözümleyicisi’nin iki katı hal sensör sonda gelen metabolik ölçümleri hala izin verirken beynin herhangi bir hareket engelleyerek bu sorunu kaçınmanızı sağlar özel olarak tasarlanmış ve imal edilmiş bir mikro-doku kısıtlama gerektirir. Oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları tekrarlanabilir ve metabolik inhibitörleri ile tedavi için hassas. Örnek boyutu kısıtlama tarafından oluşturulan odası aşmaması koşuluyla küçük bir optimizasyon ile bu iletişim kuralı tüm doku ve/veya modeli sistem, ile kullanmak için adapte edilebilir. Bazal metabolik ölçüm ve analiz mitokondrial inhibitörleri ile tedavi sonrası bu protokolde açıklanan iken, enerji kaynağı tercih ve yetiştirme ortamı gibi sayısız deneysel koşullar sorguya.
Introduction
Metabolik yeniden programlama Glioblastoma Multiforme (GBM), Huntington hastalığı ve büyük depresif bozukluğu (MDD)1,2,3de dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıklarda tespit edilmiştir. Metabolizma tedavi stratejileri odak olduğunda, temel metabolik araştırma araçları Gelişmiş. Ancak, bu yöntemlerin çoğu hücre satırları ve primer hücre çalışmaya veya daha büyük doku sonrası fiksasyon veya – dondurucu analiz etmek için tasarlanmıştır. Bazı yaklaşımlar diğerleri kromatografi kütle spektrometresi4 aynı amaç için birlikte kullanan daha maliyetli ve karmaşık analiz kullanılan iken belirli metabolitleri, basitçe ölçmek için kiti yararlanmıştır. Büyük metabolik manzara anlamak için metabolik5,6 ve metabolik akı analiz profil oluşturma (MFA)7 büyük ölçekli proteomik ve genomik çalışmalar tamamlayacak şekilde ortaya çıktı. MFA bunun üzerine etiketli metabolitleri izleme zaman içinde izin vererek genişletir profil oluşturma metabolitleri bir hücre veya doku bir noktada bir nicel temsil zaman içinde sağlar. İkincisi nasıl enerji kaynakları farklı bir hücre veya bir hastalık durumu8ne zaman dokusunda kullanıldığında ortaya yararlı olmuştur. Ancak, bu yöntemleri genel olarak metabolizma hızı ölçümü dahil etmeyin.
Küçük model sistemleri genel olarak metabolik durumunu sorgulamak için Clark elektrot9 ve dolaylı Kalorimetre10, gibi geleneksel yöntemleri edilebilir oksijen tüketimi ölçmek için kullanılan veya stop akışı basınçlırespirometri için yapılandırılmış oksijen ve karbondioksit konsantrasyonu, sırasıyla ölçmek. Bu teknikler, doğru bir şekilde metabolik organizma düzeyinde yeniden programlama okuma içgörü sağlarken bazı kısıtlamalara sahiptir. Clark elektrot kullanımı teknik olarak zor olabilir ve yüksek üretilen iş çalışmaları için tasarlanmamıştır. Dur akışı respirometer hücre ve dokulara tahlil için gerekli hassasiyeti ile çalışamaz. Birkaç yıl önce özellikle bu küçük uygulamalar11için yeni bir teknoloji geliştirildi. Bu aletleri başlangıçta oksijen tüketimi ve hücre satırları ve primer hücre bir 24 – veya 96-iyi biçimde ekstraselüler asitleştirme ölçmek için tasarlanmıştır. Kurulum ve veri çıkış kolaylığı bu yöntemi alternatif geleneksel yaklaşımlar olarak kurulmuş. Bu metodoloji hücreler için güçlü bir araçtır ve son gelişmeler doku yumruklar12,13,14ölçüm için izin vermiş. Ancak, bu deneyleri içinde kullanılan yöntemleri tüm organ sistemleri küçük modellemek ölçümü için izin vermez.
Metabolik hastalık modelleri analizini sık sık özel işlev aynı doku içinde ikamet eden hücreler arasındaki etkileşimi içerir. Örneğin, Gliyal hücreler nöronlar tarafından kullanılan metabolitleri üretmek. Bu metabolik etkileşimler için nöronal hayatta kalma15gereklidir. Bu gibi sorular soruşturma için avantajlı küçük model sistemlerdir. Hücre tipleri, çeşitli içeren bütün bir organ metabolizma ölçmek için çalışmalar enerji kullanımı içinde vivoanlamak için ekleyecektir. Son zamanlarda, Becker ve ark. oksijen tüketimi bütün sinek kafa16ölçme yöntemi bildirdi. Kafasına bir şey 24-şey hücre plaka birlikte bir dizi havuzu tarafından oksijen tüketimi okuma metabolik bir Çözümleyicisi’ni kullanarak elde edilmiştir. Bu kolayca bedenden ayrılmış, iyi başlar için çalışırken büyük bir miktar için bu yöntemi disseke gerektiğinden, larva beyin gibi organlarda için kullanmak çok daha zor. Bu nedenle, oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme okuma hassasiyeti artar, bir 96-şey hücre plaka kullanan bir yöntem tek bir bütün larva beyin tahlil için geliştirilmiştir.
Bu çalışmada kullanılan metabolik analyzer bir 96-şey hücre tabak kuyu dibinde kalmasını ölçülen örnek gerektirir. Hücreleri ve görece düz dokular için bu bir sorun değildir; Ancak, D. melanogaster larva ve yetişkin beyin geleneksel levha kaplama protokolleri kullanarak mümkün değildir. Beyin küresel üç boyutlu şeklini güvenilir bir şekilde plaka yüzeyine uygun olmaz ve yapmak bu kez onları düzgün kuyuda yere çalışılırken bozulmuş. Bir kritik protokolünün bir parçası olarak bu yeni tasarım ve geliştirme beyin metabolizma ölçümleri ile engel olmadan bulunması için küçük bir oda sağlayan mikro-doku bağlar17 var. Oluşturulan odası yaklaşık de içinde 0.016 yüksekliği ve kolayca birçok D. melanogaster beyin tutmak için yeterli alan sağlar. Bağlar için bir inert polimer yüzüğü ekli naylon mesh oluşur ve daha fazla ele alınacak Temsilcisi sonuçları. Bu bağlar kullanarak disseke beyin metabolik ölçüm için hazırlamak için gereken süreyi en aza indirir. Ölçüm işlemi en iyi duruma getirme sabit, tekrarlanabilir oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları altı ölçüm döngüleri (25 dk) sonra oluşturur. Beyni 2 h, metabolik analyzer kartuş ilaç teslim bağlantı noktaları enjeksiyonları therapeutics, inhibitörleri veya diğer tedaviler ile sağlayan en az bu koşullar altında metabolik olarak aktif kalır. Bu iletişim kuralı da diğer doku ve küçük model sistemleri18için kolayca adapte edilebilir.
Aşağıda ayrıntılı protokolü ile mitokondrial stres istediğinde bir bütün Drosophila larva beyin oksijen tüketiminde tahlil açıklar. Beyin stres, oligomycin ATP sentaz19etkisizleştirmek için eklenir. Bazal okuma dan oksijen tüketiminde azalma, beyinde ATP bağlı olarak solunum miktarı ölçümü gösterir. Daha fazla oksijen tüketimi tedaviler Rotenon20 ve antimycin bir21sonra düşüşler, elektron taşıma zinciri kompleksleri inhibitörleri ı ve III, sırasıyla, belirtmek mitokondrial Sigara oksijen tüketim miktarı beyin. Bu tahlil bir örnek bir sinek beyinde nasıl mitokondrial solunum karşılaştırıldığında ve nasıl bu protokolü değişen genotip metabolizmasında karşılaştırmak için kullanılabilir olduğunu. Ancak, bu iletişim kuralı sadece bazal oksijen tüketimi ve daha ayrıntılı çalışmalar belirli enerji kullanımı veya substrat kullanımı hipotezler soruşturma tasarım olarak ekstrasellüler asitleştirme fiyatlar, de ölçmek için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, D. melanogaster larva ve yetişkin beyin ex vivo metabolik analizi için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bazal koşullar altında nasıl metabolik olarak aktif beyin olduğunu ve bir doku mitokondrial karşı glycolytic solunum daha bağımlı hale gelmiştir olup olmadığını belirlemek için oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları gösterir, sırasıyla11.
Beyin inhibitörleri veya tedavi edici ilaçlar ile tedavi daha fazla dokunun metabolik durumu hakkında bilgi sağlar. Metabolik yüzeylerde Warburg etkisi22 veya glutaminolysis23araştırmak için glutamin için test etmek için glikoz gibi belirli metabolitleri bağımlılıkları belirlemek için de eklenebilir — metabolik yeniden programlama içinde her iki ortak. Uzun vadeli çalışmalar, larva veya sinekler enjeksiyon bağlantı noktalarını kullanmak yerine uyuşturucu da beslenen ve beyin aralıklarla veya bağlı olarak deneysel tasarım son noktada denetlesinler. Bu yöntem için çeşitli uygulamalar getirilebilir.
Bu yöntem beyin yerine getirilmiş ancak diğer larva18 ve yetişkin dokuları analiz etmek için kullanılabilir. Ayrıca, diğer küçük model sistemleri tüm organizmalar18 veya doku ölçmek için bu yöntemi kullanabilir. Bu yöntem diğer sistemler için en iyi duruma getirme için tek organ, doku veya organizma boyutunu kısıtlamadır. Mikro-doku kısıtlama tarafından oluşturulan odası için tahlil çalışan boyut engeldir. Metabolik çıktı beyin veya test edilen doku için çok düşüktür ve örnek boyutu bir kısıtlaması değil, örnekleri havuzu tahlil ölçümleri ve duyarlılığı artırmak için kullanılabilir. Diğer uygulamalar için bu iletişim kuralını değiştirme yalnızca küçük en iyi duruma getirmeleri 1) uygun ölçü birimi seçimi de dahil olmak üzere, gerektiren ve döngüsü numaraları ve zamanlama ve 2) belirlemede etkili tedavi konsantrasyonlarda doku için karıştırın. Ölçü ve karıştırma kez metabolik Çözümleyicisi tarafından her döngüsü sırasında ölçülen izleme oksijen konsantrasyonu tarafından belirlendi. Bu çalışma tamamlandıktan sonra O2 genel bakış penceresinde Y2 eksen düğmesini seçerek görüntülenebilir. Her döngüsü sırasında karıştırma sırasında ilk oksijen konsantrasyonu dönüş ardından doku’nın oksijen tüketimi sırasında ölçülen süreyi yansıtan bir açılan oksijen konsantrasyonu olmalıdır. Bu desen görülmektedir kadar ölçü ve mix kez test edilmelidir. Bu yöntemi kullanarak, diğer böcek beyinler incelenmiştir. Bu beyin burada kullanılan ancak hala doku kısıtlama tarafından oluşturulan odası sığması sinek akıldan çok daha büyük. OCR okuma bu beyin üzerinden 400 pmol / dk (veri gösterilmez) yüksek. Bu çalışmalar yanı sıra bütün-fly oksijen tüketimi18,24, ölçme diğer çalışmalar ile hizalamak OCR oranları sonuçlarından D. melanogaster beyin oksijen sınırlı değildi öneririz. D. melanogaster beyin ve diğer organizmalar dokulardan için bu yöntemi uygulayarak dört kritik adımlar için özel dikkat gerektirir.
Başarılı bir şekilde biyolojik olarak uygun ve tekrarlanabilir ölçümler elde etmek için takip edilmesi gereken Protokolü’nün kritik adımlar vardır. İlk olarak, bir mikro-doku kısıtlama kullanımı bu yöntem için gereklidir. Bu bağlar özellikleri ve listelenen malzemeleri kullanarak üretim esastır. Malzemeler nedeniyle etkisiz kimyasal bileşimi ve yeteneklerini karıştırma adımları olmadan hava kabarcıkları oluşturulması sırasında uygun ortam değişimi izin için seçildi. İkinci olarak, zamanında bir diseksiyon ve plaka hazırlık doku metabolik çıkışını en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Kısa diseksiyon kez değil önemli ölçüde zarar beyin. Diğer çalışmalar düzgün bir perfüzyon depolanmış olsa diseksiyon odası sonra25sinek beyin gün saat süre hayatta tutulabilir olduğunu göstermiştir. Ancak, uzun bir süre önce tahlil için tahlil medyada oturan beyin bırakılırsa Şekil 3B ve 3D, görüldüğü gibi oksijen Tüketim oranları azalmıştır. Tahlil sırasında örnekleri her döngüsü sırasında karıştırma bir adım tabi. Bu karıştırma sadece kimyasal bileşikler enjeksiyonları ile yardımcı olur ancak aynı zamanda medya recirculate ve oksijen sağlamak için görür. Onlar medya tezgah üstüne kuluçka daha metabolik olarak aktif bu ölçü-mix döngüleri sırasında daha uzun süre kalmak mümkün beyinlerdir. Bu nedenle, larva beyin diseksiyon bu tahlil ayarlamak başlamadan önce hakim. Bu tahlil kurma çözümlediğinizde genotip az sayıda bir zamanda beyin sayısını en aza indirmek için gerekli ve kuyu faydalanır. Bu gecikmeler anatomi ve tahlil ölçümler arasındaki engeller. Üçüncü olarak, istikrarlı bir sıcaklık sürdürmek fizyolojik ilgili koşullarda metabolik oranları analiz etmek için gereklidir. Yüksek tahlil sıcaklıklar düşük oksijen Tüketim oranları (Şekil 3 c) tarafından gözlenen doku ölüme neden olabilir. Sinekler farklı bir sıcaklıkta deneysel amaçlı yetiştirilen Eğer ölçümler bu sıcaklıkta da yapılmalıdır. Tahlil farklı bir sıcaklıkta yapılacaktır diseksiyonlarının büyük olasılıkla oda sıcaklığında gerçekleştirilir iken, kaplama ve ölçülü beyin tahlil çalıştırmadan önce 15dk için gerekli sıcaklığında inkübe. Son olarak, kuyu sonrası tahlil doku konumlandırma ölçümleri etkilenen belirlemek için kritik olduğunu gözlemleyerek. Bazen, bu plaka diseksiyon mikroskop altında gözlemleyerek sonra her iki doku kaybı veya mispositioning, nedeniyle veri analizi nerede beyin iyi Merkez dışında kaydı ve sıkışmış çıkarılabilir bir aykırı iyi olacak altında polimer yüzük gözü kör. Kısıtlama kuyuya düzgün sağlanmadığını ve karıştırma döngüsü sırasında rahatsız oldu Eğer doku kaybolabilir. Eğer onlar analizinden dışlanan değil de bu olayların sık sık, olur iken, onlar oranı değerleri önemli ölçüde düşürür.
Bütün doku metabolik akı izleme oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme tarafından ölçümü nasıl metabolizma genetik manzara veya diğer deneysel koşullar tarafından değiştirilmez anlamak için biyolojik olarak uygun bir yöntem sağlar. Bu yöntem tek bir metabolik değişiklikleri algılamak için hassas dur akış basınçlırespirometri veya dolaylı Kalorimetre kullanarak mümkün değildir D. melanogaster beyin. Bu da oksijen tüketimi ölçmek için Clark elektrot kullanarak daha az teknik olarak davet ediyor. Bu iletişim kuralı bir avantajı iyi başına bir bütün beyin analiz etmek için yeteneğidir. 96-şey biçimi daha duyarlı okumaları için izin verir ve böylece, birden fazla genotip tahlil gerekli örnekleri daha az sayıda nedeniyle bir anda denetlesinler. Doku metabolizmasında ölçme hala zorlu ve dikkatle gerektirir iken yetiştirilen ve senkronize hayvanlar, bu iletişim kuralı hızlı, nispeten basit bir yöntem açıklanır ve d içinde çok sayıda metabolik hassasiyetleri analiz potansiyeline sahiptir melanogaster larva ve yetişkin beyin.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bloomington Drosophila hisse senedi Merkezi’nden (NIH P40OD018637) elde edilen hisse senetleri bu çalışmada kullanılmıştır. Bu yayında bildirilen Araştırma Biyomedikal araştırma Excellence üzerinden ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri grant numarası altında Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir) ağ tarafından desteklenmiştir P20GM103430 ve Rhode Island Vakfı tarafından. Yazar J. suları ve P. Snodgrass-kemer bu protokolü gelişmekte olan desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.
Materials
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
References
- Cai, H., et al. Metabolic dysfunction in Alzheimer’s disease and related neurodegenerative disorders. Current Alzheimer Research. 9 (1), 5-17 (2012).
- Zhao, S., et al. Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha. Science. 324 (5924), 261-265 (2009).
- Brody, A. L., et al. Brain metabolic changes in major depressive disorder from pre- to post-treatment with paroxetine. Psychiatry Research. 91 (3), 127-139 (1999).
- Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
- Dona, A. C., et al. A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal. 14, 135-153 (2016).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Zamboni, N., Fendt, S. -. M., Rühl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4 (6), 878-892 (2009).
- Duckwall, C. S., Murphy, T. A., Young, J. D. Mapping cancer cell metabolism with(13)C flux analysis: Recent progress and future challenges. Journal of Carcinogenesis. 12, 13 (2013).
- Clark, L. C., et al. Continuous recording of blood oxygen tensions by polarography. Journal of Applied Physiology. 6 (3), 189-193 (1953).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. Spatial Epidemiology: Methods and Applications. , 87-103 (2000).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Dunham-Snary, K. J., Sandel, M. W., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W. A method for assessing mitochondrial bioenergetics in whole white adipose tissues. Redox Biology. 2 (1), 656-660 (2014).
- Fan, Y. -. Y., Davidson, L. A., Callaway, E. S., Wright, G. A., Safe, S., Chapkin, R. S. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (1), G1-G9 (2015).
- Lee, H., et al. Increased mitochondrial activity in renal proximal tubule cells from young spontaneously hypertensive rats. Kidney International. 85 (3), 561-569 (2014).
- Volkenhoff, A., et al. Glial glycolysis is essential for neuronal survival in drosophila. Cell Metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).
- Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., De Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Tipping, M., Waters, J. Method and device for restraining contents of a cell plate. United States patent. , (2017).
- Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of Neuroscience Methods. 296, 32-43 (2018).
- Lardy, H. A., Johnson, D., McMurray, W. C. Antibiotics as tools for metabolic studies. I. A survey of toxic antibiotics in respiratory, phosphorylative and glycolytic systems. Archives of Biochemistry and Biophysics. 78 (2), 587-597 (1958).
- Turrens, J. F., Boveris, A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochemical Journal. 191, 421-427 (1980).
- Potter, V. R., Reif, A. E. Inhibition of an electron transport component by antimycin A. The Journal of Biological Chemistry. 194 (1), 287-297 (1952).
- Warburg, O. On the Origin of Cancer Cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Yang, L., Venneti, S., Nagrath, D. Glutaminolysis: A Hallmark of Cancer Metabolism. Annual Review of Biomedical Engineering. 19 (1), 163-194 (2017).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. The Journal of Experimental Biology. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (37), e1936 (2010).
