Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster
Summary
Presentamos un protocolo para la medición de consumo de oxígeno y la acidificación extracelular en el cerebro de larvas y adultos de Drosophila melanogaster . Se utiliza un analizador metabólico con un protocolo adaptado y optimizado. Micro-tejido restricciones son un componente fundamental de este protocolo y fueron diseñadas y creadas específicamente para su uso en este análisis.
Abstract
Este protocolo describe un método para medir el metabolismo en el cerebro de larvas y adultos de Drosophila melanogaster . Cuantificación de metabolismo en órganos enteros proporciona un conocimiento de tejido nivel de utilización de la energía que no puede ser captada cuando se analizan líneas celulares y células primarias. Si bien este análisis es ex vivo, permite la medición de una serie de células especializadas que trabajan juntos para realizar una función en un tejido y modelos más de cerca el órgano en vivo . La reprogramación metabólica se ha observado en muchas enfermedades neurológicas, incluyendo neoplasias y enfermedades neurodegenerativas. Este protocolo fue desarrollado para ayudar a la investigación de la comunidad de D. melanogaster de metabolismo en modelos de enfermedad neurológica utilizando un analizador metabólico comercialmente disponible. Medición de metabolismo del cerebro entero en el analizador metabólico es difícil debido a la geometría del cerebro. Este analizador requiere muestras para permanecer en la parte inferior de una placa de 96 pocillos. Muestras de células y tejidos punzonados pueden adherirse a la superficie de la placa celular o utilizar placas de esferoide, respectivamente. Sin embargo, la forma esférica, tridimensional del cerebro de D. melanogaster impide que el tejido adherido a la placa. Este protocolo requiere una restricción de micro-tejido especialmente diseñada y fabricada que evita este problema evitando cualquier movimiento del cerebro mientras sigue permitiendo las mediciones metabólicas de dos sondas de sensor de estado sólido del analizador. Consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular son reproducibles y sensibles al tratamiento con inhibidores metabólicos. Con una optimización menor, este protocolo puede ser adaptado para su uso con cualquier tejido entero o modelo de sistema, siempre que el tamaño de la muestra no excede la cámara generada por el sistema de seguridad. Mientras que dentro de este protocolo se describen las mediciones metabólicas basales y un análisis después de un tratamiento con los inhibidores mitocondriales, innumerables condiciones experimentales, tales como preferencia de fuente de energía y medio ambiente de crianza, podrían ser interrogadas.
Introduction
La reprogramación metabólica ha sido identificado en muchas enfermedades neurológicas, incluyendo Glioblastoma Multiforme (GBM), enfermedad de Huntington y desorden depresivo importante (MDD)1,2,3. Como metabolismo se convierte en el foco de las estrategias terapéuticas, herramientas para la investigación metabólica básica han avanzado. Sin embargo, la mayoría de estos métodos fueron diseñada para el estudio de líneas celulares y células primarias o analizar grandes tejidos posteriores a la fijación o – congelación. Algunos enfoques han dependido de los kits a medida simplista metabolitos específicos, mientras que otros han utilizado más costosos y complejos análisis utilizando cromatografía en combinación con la espectrometría de masas4 para el mismo objetivo. Para entender el paisaje metabólico mayor,5,6 y el análisis de flujo metabólico de perfiles metabólicos (MFA)7 surgió para complementar los estudios de Genómica proteómica a gran escala. Perfiles proporciona una representación cuantitativa de los metabolitos de una célula o tejido en un punto en el tiempo, mientras que la AMF se amplía sobre esto por que permite el seguimiento de los metabolitos marcados en el tiempo. Esta última ha sido útil en revelar cómo las fuentes de energía se utilizan diferentemente en una célula o tejido en un estado de enfermedad8. Sin embargo, estos métodos incluyen la medición de la tasa metabólica en general.
Para interrogar el estado metabólico general de los sistemas de modelo pequeño, métodos tradicionales, como el electrodo de Clark9 y10de la calorimetría indirecta, pueden ser utilizados para medir el consumo de oxígeno o configurados para parada de respirometría de flujo, a medir la concentración de dióxido de carbono y oxígeno respectivamente. Estas técnicas, ofreciendo con precisión conocer la lectura de reprogramación metabólica a nivel de organismo, tienen limitaciones. El uso del electrodo de Clark puede ser técnicamente difícil y no está diseñado para estudios de alto rendimiento. El respirómetro de flujo de parada no puede funcionar con la sensibilidad necesaria para análisis de células o tejidos. Hace varios años, la nueva tecnología fue desarrollada específicamente para estas pequeñas aplicaciones11. Estos instrumentos fueron diseñados inicialmente para medir el consumo de oxígeno y la acidificación extracelular de líneas celulares y células primarias en un formato de 24 o 96 pocillos. La simplicidad de la configuración y datos de salida había establecido este método como alternativa a los enfoques tradicionales. Esta metodología es una herramienta poderosa para las células, y los avances recientes han permitido la medición de tejido golpes12,13,14. Sin embargo, los métodos utilizados en estos ensayos no permiten la medición de órganos completos de sistemas modelo pequeño.
El análisis metabólico de modelos de la enfermedad a menudo implica la interacción entre las células de función especializada que se encuentra en el mismo tejido. Por ejemplo, las células gliales producen metabolitos utilizados por las neuronas. Estas interacciones metabólicas son necesarias para la supervivencia neuronal15. Sistemas modelo pequeño son ventajosos para investigar preguntas como éstas. Estudios para medir el metabolismo de un órgano entero, que contiene una variedad de tipos celulares, se sumará a la comprensión de la utilización de energía en vivo. Becker et al informó recientemente, un método para medir el consumo de oxígeno en toda mosca cabezas16. Poniendo un número de cabezas juntos en un pocillo de una placa de 24 pocillos celular, las lecturas de consumo de oxígeno fueron obtenidas usando un analizador metabólico. Aunque esto funciona bien para las cabezas, que se separan fácilmente del cuerpo, es mucho más difícil para órganos como el cerebro de larvas, ya que una gran cantidad necesita ser disecado para este método. Por lo tanto, se desarrolló un método utilizando una placa de 96 pocillos de la célula, que aumenta la sensibilidad de las lecturas de acidificación extracelular y consumo de oxígeno, para ensayo un solo cerebro entero larval.
El analizador metabólico utilizado en este estudio requiere que la muestra se mide para permanecer en el fondo del pozo de una placa celular de 96 pozos. Para las células y tejidos relativamente planos, esto no es un reto; sin embargo, para D. melanogaster cerebros de larvas y adultos, no es posible usando protocolos de capa de placa tradicional. La forma tridimensional esférica de los cerebros no fiable se adhiere a la superficie de la placa, y los que lo hacen a menudo están dañados al intentar colocarlos correctamente en el pozo. Una parte crítica de este nuevo protocolo es el diseño y desarrollo de micro-tejido restricciones17 que proporcionar un compartimiento pequeño para el cerebro a residir en sin interferir con las mediciones metabólicas. La cámara generada es de aproximadamente 0,016 en altura y ofrece suficiente espacio para contener fácilmente muchos cerebros de D. melanogaster . Las restricciones consisten en malla de nylon unido a un anillo de polímero inerte y se discutirá más en los Resultados de representante. Usando estas restricciones minimiza el tiempo necesario para preparar la medición metabólica cerebros disecados. Optimizar el proceso de medición genera acidificación extracelular tarifas y consumo de oxígeno constante, reproducible después de seis ciclos de medición (de 25 min). Los cerebros siguen siendo metabólicamente activos bajo estas condiciones durante un mínimo de 2 h, que permite inyecciones de terapéutica, los inhibidores u otros tratamientos a través de los puertos de la entrega de la droga de analizador metabólico cartucho. Este protocolo también puede ser fácilmente adaptado para otros tejidos y sistemas de modelo pequeño18.
El protocolo que se detalla a continuación describe cómo analizar el consumo de oxígeno en un todo cerebro larvas de Drosophila cuando con estrés mitocondrial. Al estrés del cerebro, oligomycin se agrega al inhibir la sintasa de ATP19. La disminución en el consumo de oxígeno basal lecturas muestra una medida de la cantidad de ATP dependiendo de la respiración en el cerebro. Otras disminuciones en el consumo de oxígeno después de tratamientos con rotenona20 y antimycin A21, inhibidores de los complejos de la cadena de transporte de electrones I y III, respectivamente, indican la cantidad de consumo de oxígeno no mitocondrial en el cerebro. Este ensayo es un ejemplo de respiración mitocondrial como en un cerebro de mosca puede compararse y cómo este protocolo se puede utilizar para comparar el metabolismo en diferentes genotipos. Sin embargo, este protocolo puede ser adaptado para medir consumo de oxígeno basal simplemente y tipos de acidificación extracelular, así como en cuanto a diseño más elaborados estudios investigando la utilización de la energía específica o hipótesis de utilización de sustrato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se describe un método novedoso para el análisis metabólico de cerebros de larvas y adultos de D. melanogaster ex vivo . Bajo condiciones basales, el consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular indican cómo metabólicamente activo el cerebro es y puede determinar si un tejido se ha vuelto más dependiente mitocondrial frente a glucolisis respiración, respectivamente11.
Tratamiento de los cerebros con inhibidores o medicamentos puede proporcionar más información sobre el estado metabólico del tejido. También se pueden añadir sustratos metabólicos para determinar las dependencias de metabolitos específicos, como la glucosa para comprobar el efecto de Warburg22 o glutamina para investigar glutaminolysis23, ambos comunes en reprogramación metabólica. Estudios a largo plazo, larvas o moscas podrían también ser alimentadas con drogas en vez de usar puertos de inyección y cerebros podrían ensayarse en intervalos o en el punto final, dependiendo del diseño experimental. Este método se puede optimizar para numerosas aplicaciones.
Este método ha sido optimizado para cerebros pero puede ser utilizado para analizar otras larvas18 y tejidos adultos. Además, otros sistemas modelo pequeño pueden utilizar este método para medir todo organismos18 o los tejidos. La única limitación para la optimización de este método para otros sistemas es el tamaño del órgano, tejido u organismo. La cámara creada por la retención de micro-tejido es la barrera de tamaño para ejecutar el ensayo. Si la salida metabólica es demasiado baja para el cerebro o el tejido sometido a prueba, y el tamaño de muestra no es una restricción, agrupación de muestras puede utilizarse para aumentar las medidas de análisis y sensibilidad. Modificar este protocolo para otras aplicaciones sólo necesitan optimizaciones menores, incluyendo: 1) elección de la medida adecuada y mezclar números de ciclo y tiempo y 2) determinación de las concentraciones de tratamiento eficaz para el tejido. La medida y tiempos de mezcla se determinaron mediante el control concentración de oxígeno medida por el analizador metabólico durante cada ciclo. Esto puede verse seleccionando O2 en el botón de eje Y2 en la ventana de resumen después de terminar la carrera. Durante cada ciclo, debe haber una concentración de oxígeno de sobreponer lo que refleja el consumo de oxígeno del tejido durante el tiempo medido, seguido por un retorno a la concentración de oxígeno inicial durante el ciclo de mezcla. Deben analizarse los tiempos de medida y mezcla hasta que este patrón se observa. Usando este método, se han estudiado otros cerebros insectos. Estos cerebros eran más grandes que los cerebros de moscas utilizado aquí, pero aún encaja dentro de la cámara generada por la retención de tejido. La lectura OCR de estos cerebros era tan alta como 400 pmol/min (datos no mostrados). Los resultados de estos estudios, así como las tasas de la OCR que se alinean con otros estudios de medición de oxígeno toda marcha consumo18,24, sugieren que los cerebros de D. melanogaster no eran oxígeno limitado. Para D. melanogaster cerebros y tejidos de otros organismos, aplicando este método exige una atención especial a cuatro pasos críticos.
Para alcanzar con éxito mediciones reproducibles y biológicamente relevantes, hay pasos críticos del protocolo que debe seguirse. En primer lugar, el uso de un micro-tejido de sujeción se requiere para este método. Estas restricciones utilizando las especificaciones y materiales listados de fabricación es esencial. Los materiales fueron seleccionados debido a su composición química inerte y su capacidad para permitir el intercambio adecuado de los medios de comunicación durante las etapas de mezcla sin la creación de burbujas de aire. En segundo lugar, una preparación oportuna de la disección y la placa es necesaria para maximizar la producción metabólica del tejido. Tiempos cortos disección no deben deterioran significativamente el cerebro. Otros estudios han demostrado que cerebros de mosca pueden mantener vivos a horas o días después de disección si se almacena correctamente en una perfusión cámara25. Sin embargo, como se ve en la figura 3B y 3D, si los cerebros se quedan sentado en medio de ensayo durante largos períodos de tiempo antes de la prueba, se disminuyen las tasas de consumo de oxígeno. Durante el ensayo, las muestras se someten a un paso de la mezcla durante cada ciclo. Esta mezcla no sólo ayuda con las inyecciones de compuestos químicos sino también actúa para recircular los medios de comunicación y proporcionar oxígeno. Los cerebros son capaces de permanecer metabólicamente activos durante períodos más largos durante estos ciclos de medida-mix que incubando en los medios de comunicación en la mesa. Por lo tanto, la disección del cerebro larval debe ser dominada antes de comenzar a configurar este ensayo. Cuando la configuración de este ensayo, analizar un pequeño número de genotipos a la vez, minimizar el número de cerebros necesarios y pozos utilizaron. Esto evitará retrasos entre la disección y las mediciones de ensayo. En tercer lugar, mantener una temperatura estable es necesaria para analizar las tasas metabólicas en condiciones fisiológicamente relevantes. Temperaturas de ensayo mayor pueden causar muerte del tejido, observada por menores tasas de consumo de oxígeno (figura 3). Si de moscas se crían a temperaturas diferentes para fines experimentales, las mediciones deben realizarse en esta temperatura. Mientras que las disecciones más probable es que se realizará a temperatura ambiente, si el ensayo se llevará a cabo a una temperatura diferente, los cerebros plateados y restringidos deben incubarse a la temperatura requerida durante 15 min antes de ejecutar el ensayo. Por último, observar el análisis posterior de pozos es fundamental para determinar si la colocación de tejido afectados las mediciones. En ocasiones, habrá un outlier bien que, después de observar la placa con el microscopio de disección, se puede eliminar desde el análisis de los datos debido a cualquier pérdida de tejido o deformación, donde el cerebro se ha deslizado fuera del centro del pozo y se pega debajo del anillo de polímero de la moderación. Tejido puede perder si la restricción no fue asegurada correctamente al pozo y fue perturbada durante los ciclos de mezcla. Mientras que ninguno de estos eventos sucede a menudo, si no son excluidos del análisis, se bajan los valores de tasa sustancialmente.
La medición de flujo metabólico tejido conjunto de monitoreo de consumo de oxígeno y la acidificación extracelular proporciona un método biológico relevante para la comprensión de cómo metabolismo está alterado por el paisaje genético u otras condiciones experimentales. Este método es lo suficientemente sensible para detectar cambios metabólicos en un solo cerebro de D. melanogaster , que no es posible mediante respirometría de flujo de parada o calorimetría indirecta. También es menos técnicamente difícil que utilizando un electrodo de Clark para medir consumo de oxígeno. Una ventaja adicional de este protocolo es la capacidad de analizar un cerebro entero por pozo. El formato de 96 pocillos permite lecturas más sensibles, y por lo tanto, más de un genotipo puede ensayarse en un momento por el menor número de muestras necesarias por ensayo. Medición de metabolismo en el tejido es todavía un reto y requiere cuidadosamente criados y animales sincronizados, este protocolo describe un método rápido y relativamente simple y tiene el potencial para analizar numerosos sensibilidad metabólica en D. melanogaster cerebros de larvarios y adultos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Las acciones de la Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018637) fueron utilizadas en este estudio. La investigación en esta publicación fue apoyada por la red institucional desarrollo Award (IDeA) para la excelencia en la investigación biomédica desde el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud, bajo el número de concesión P20GM103430 y por la Fundación de Rhode Island. Autores agradecen las aguas J. y correa Snodgrass P. por su apoyo en el desarrollo de este protocolo.
Materials
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
References
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