Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros
Summary
Apresentamos um protocolo para medição de consumo de oxigênio e a acidificação extracelular nos cérebros de larvas e adultos de Drosophila melanogaster . Um analisador metabólico é utilizado com um protocolo adaptado e otimizado. Microtecido restrições são uma componente essencial do presente protocolo e foram concebidas e criadas especificamente para a sua utilização nesta análise.
Abstract
Este protocolo descreve um método para medir o metabolismo nos cérebros de larvas e adultos de Drosophila melanogaster . Quantificar o metabolismo em órgãos inteiros fornece uma compreensão de tecidos-nível de utilização de energia que não pode ser capturada ao analisar as células primárias e linhagens celulares. Enquanto esta análise é ex vivo, permite a medição de uma série de células especializadas que trabalham em conjunto para executar uma função em um tecido e modelos mais pròxima o órgão na vivo . Reprogramação metabólica tem sido observada em muitas doenças neurológicas, incluindo a neoplasia e doenças neurodegenerativas. Este protocolo foi desenvolvido para auxiliar a investigação da Comunidade d. melanogaster do metabolismo em modelos de doença neurológica, usando um analisador metabólico comercialmente disponível. Medir o metabolismo do cérebro inteiro no analisador metabólico é um desafio devido a geometria do cérebro. Este analisador requer amostras para permanecer na parte inferior de uma placa de 96 poços. Amostras de células e tecido socos podem aderir à superfície da placa de celular ou utilizar placas de esferoide, respectivamente. No entanto, a forma esférica, tridimensional do cérebro d. melanogaster impede que o tecido aderindo à placa. Este protocolo requer um apoio de microtecido especialmente projetado e manufacturado que contorna este problema, impedindo qualquer movimento do cérebro enquanto ainda permitindo medições metabólicas de duas sondas de sensor de estado sólido do analisador. Consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular são reprodutíveis e sensível a um tratamento com inibidores metabólicos. Com uma pequena otimização, este protocolo pode ser adaptado para uso com qualquer tecido inteiro e/ou sistema de modelo, desde que o tamanho da amostra não deve exceder a câmara gerada pelo apoio de. Enquanto medições metabólicas basais e uma análise após um tratamento com inibidores mitocondriais são descritos neste protocolo, inúmeras condições experimentais, tais como a preferência de fonte de energia e ambiente de criação, podem ser interrogadas.
Introduction
Reprogramação metabólica foi identificada em muitas doenças neurológicas, incluindo Glioblastoma Multiforme (GBM), doença de Huntington e transtorno depressivo maior (MDD)1,2,3. Como o metabolismo torna-se o foco das estratégias terapêuticas, ferramentas de pesquisa metabólica básica tem avançado. No entanto, a maioria desses métodos foram projetada para estudar linhas de células e as células primárias ou analisar tecidos maiores pós- fixação ou – congelação. Algumas abordagens têm confiado em kits para medir simplista metabolitos específicos, enquanto outros têm utilizado mais dispendiosas e complexas análises utilizando cromatografia em combinação com a espectrometria de massa4 , para o mesmo objetivo. Para entender a maior paisagem metabólica, metabólica, criação de perfis de5,6 e análise do fluxo metabólico (AMF)7 surgiu para complementar a proteómica em grande escala e estudos genômicos. Perfil fornece uma representação quantitativa de metabolitos numa célula ou tecido em um ponto no tempo, enquanto AMF expande-se sobre isto, permitindo o rastreamento de metabolitos rotulados ao longo do tempo. Este último tem sido útil em revelar como fontes de energia são utilizadas de forma diferente em uma célula ou tecido quando em um estado de doença8. No entanto, estes métodos não incluem a medição da taxa metabólica total.
Para interrogar o estado metabólico geral dos sistemas modelo de pequeno porte, os métodos tradicionais, tais como o Clark eletrodo9 e calorimetria indireta10, podem ser usados para medir o consumo de oxigênio ou configurados para respirometria fluxo de paragem, a medir o oxigênio e a concentração de dióxido de carbono, respectivamente. Estas técnicas, ao mesmo tempo com precisão, fornecendo uma visão para a leitura de reprogramação metabólica a nível do organismo, têm limitações. O uso do eletrodo Clark pode ser tecnicamente desafiador e não foi projetado para estudos de alta produtividade. O respirometer fluxo de parada não pode funcionar com a sensibilidade necessária para o ensaio das células ou tecidos. Há vários anos, a nova tecnologia foi desenvolvida especificamente para estes menores aplicações11. Estes instrumentos foram inicialmente projetados para medir o consumo de oxigênio e a acidificação extracelular de linhagens celulares e as células primárias em um formato 24 – ou 96-bem. A simplicidade de configuração e dados saída estabelecido este método como uma alternativa para as abordagens tradicionais. Esta metodologia é uma ferramenta poderosa para as células, e avanços recentes permitiram que a medição de tecido socos12,13,14. No entanto, os métodos utilizados nestes ensaios não permitem a medição de órgãos inteiros de sistemas modelo pequeno.
A análise metabólica dos modelos de doença, muitas vezes, envolve a interação entre as células de função especializada que residem dentro do mesmo tecido. Por exemplo, células gliais produzem metabolitos utilizados pelos neurônios. Essas interações metabólicas são necessárias para a sobrevivência neuronal15. Sistemas modelo de pequeno porte são vantajosos para investigar questões como estas. Estudos para medir o metabolismo de um órgão inteiro, contendo uma variedade de tipos de células, irão adicionar para a compreensão da utilização de energia em vivo. Recentemente, Becker et al relataram um método de medição do consumo de oxigênio em cabeças todo voar16. Por reunir um número de cabeças juntos em um poço de uma placa de 24 células, as leituras de consumo de oxigênio foram obtidas utilizando um analisador metabólico. Enquanto isso funciona bem para a cabeça, que é facilmente separada do corpo, é muito mais difícil de usar para órgãos como cérebro larval, porque precisa de uma grande quantidade para serem dissecados para este método. Portanto, um método utilizando uma placa de células 96 poços, o que aumenta a sensibilidade do consumo de oxigênio e leituras de acidificação do extracelular, foi desenvolvido para um único cérebro inteiro larval de ensaios.
O analisador metabólico utilizado neste estudo requer a amostra que está sendo medida para permanecer no fundo do poço de uma placa de células 96 poços. Para as células e tecidos relativamente planos, este não é um desafio; no entanto, para cérebros de larvas e adultos de d. melanogaster , não é possível usando protocolos de revestimento tradicional prato. A forma tridimensional esférica dos cérebros não aderirão confiável para a superfície da placa, e aqueles que o fazem muitas vezes são danificadas durante a tentativa de colocá-los corretamente no poço. Uma parte crítica do presente protocolo novo é a concepção e desenvolvimento de microtecido restrições17 que fornecem uma pequena câmara para o cérebro residir em sem interferir com as medições metabólicas. A câmara gerada é aproximadamente 0.016 em de altura e oferece espaço suficiente para armazenar facilmente muitos cérebros de d. melanogaster . Os apoios consistem em malha de nylon, ligada a um anel de polímero inerte e serão discutidos mais nos Resultados do representante. Usar essas amarras minimiza o tempo necessário para preparar o cérebro dissecado para a medição metabólica. Otimizar o processo de medição gera consumo de oxigênio estável, reprodutível e taxas de acidificação do extracelular após seis ciclos de medição (de 25 min). O cérebro permanecem metabolicamente ativo nestas condições durante um período mínimo de 2 h, que permite injeções de terapêutica, inibidores ou outros tratamentos através dos portos de entrega de droga de cartucho analisador metabólico. Este protocolo também pode ser facilmente adaptado para outros tecidos e de sistemas de pequeno modelo18.
O protocolo detalhado abaixo descreve como a ensaiar o consumo de oxigênio em um drosófila larval cérebro inteiro quando desafiados com stress mitocondrial. Para ressaltar o cérebro, oligomicina é adicionada ao inibir a ATP sintase19. A diminuição do consumo de oxigênio de leituras basais mostra uma medida da quantidade de ATP, dependendo da respiração no cérebro. Mais diminui o consumo de oxigênio após tratamentos com rotenona20 e antimycin um21, inibidores dos complexos da cadeia de transporte de elétrons I e III, respectivamente, indicam a quantidade de consumo de oxigênio não-mitocondrial na cérebro. Este ensaio é um exemplo de respiração como mitocondrial em uma mosca cérebro pode ser comparado e como este protocolo pode ser usado para comparar o metabolismo em diferentes genótipos. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para medir o consumo de oxigênio simplesmente basal e taxas acidificação do extracelular, bem como quanto projetar mais elaborados estudos investigando a utilização de energia específica ou hipóteses de utilização de substrato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, um novo método para a análise metabólica de d. melanogaster cérebros larval e adulto ex vivo é descrito. Em condições basais, consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular indicam como metabolicamente ativas no cérebro é e pode determinar se um tecido tornou-se mais dependente mitocondrial contra glicolítico respiração, respectivamente11.
Tratar o cérebro com inibidores ou drogas terapêuticas pode fornecer mais informações sobre o status metabólico do tecido. Substratos metabólicos também podem ser adicionados para determinar as dependências em metabolitos específicos, como a glicose para testar o efeito de Warburg22 ou glutamina para investigar glutaminolysis23— ambos comum em reprogramação metabólica. Para estudos de longo prazo, as larvas ou moscas também poderiam ser alimentadas drogas em vez de usar os portos de injeção, e cérebro poderia ser analisado em intervalos ou no ponto final, dependendo do projeto experimental. Este método pode ser otimizado para numerosas aplicações.
Este método foi otimizado para o cérebro, mas pode ser usado para analisar outros larval18 e tecidos adultos. Além disso, outros sistemas modelo pequeno podem usar esse método para medir todo organismos18 ou tecidos. A única limitação para otimizar esse método para outros sistemas é o tamanho do órgão, tecido ou organismo. A câmara criada por apoio de microtecido é a barreira do tamanho para execução do ensaio. Se a saída metabólica é demasiado baixa para o cérebro ou o tecido a ser testado, e o tamanho da amostra não é uma restrição, pool de amostras pode ser usado para aumentar a sensibilidade e medidas de ensaio. Modificar este protocolo para outras aplicações só deve exigir pequenas otimizações, incluindo 1) escolher a medida adequada e misture números de ciclo e sincronismo e 2) determinar as concentrações de tratamento eficaz para o tecido. A medida e mistura vezes foram determinados pela monitorização concentração oxigênio medida pelo analisador metabólico durante cada ciclo. Isto pode ser visto, selecionando O2 no botão eixo Y2 na janela de visão geral, após a conclusão da corrida. Durante cada ciclo, deve haver uma concentração de oxigênio drop-in refletindo o consumo de oxigênio do tecido durante o tempo medido, seguido por um retorno à concentração inicial de oxigênio durante o ciclo de mistura. Os tempos de medida e mistura devem ser testados até que este padrão é observado. Usando este método, foram estudados outros cérebros de insetos. Estes cérebros eram maiores do que o cérebro voar usado aqui, mas ainda cabe dentro da câmara gerada pelo apoio de tecido. As leituras de OCR destes cérebros eram tão altas quanto 400 pmol/min (dados não mostrados). Os resultados destes estudos, bem como taxas de OCR que alinharem com outros estudos de medição de oxigênio todo-mosca consumo18,24, sugerem que o cérebro de d. melanogaster não oxigênio limitado. Para cérebros de d. melanogaster e tecidos de outros organismos, aplicar este método requer uma atenção especial às quatro etapas críticas.
Para conseguir com sucesso medições reproduzíveis e biologicamente relevantes, existem passos críticos do protocolo que deve ser seguido. Primeiro, o uso de uma retenção de microtecido é necessário para este método. Estas restrições usando as especificações e materiais listados de fabricação é essencial. Os materiais foram selecionados devido à sua composição química inerte e sua capacidade de permitir a troca de mídia adequada durante as etapas de mistura sem a criação de bolhas de ar. Em segundo lugar, uma preparação atempada de dissecção e a placa é necessária para maximizar a saída metabólica do tecido. Vezes curto dissecação não devem comprometer significativamente o cérebro. Outros estudos têm mostrado que voar cérebros podem ser mantidos vivos por horas e dias após dissecação se devidamente armazenada em uma perfusão de câmara25. No entanto, como visto na Figura 3B e 3D, se cérebros ficam sentados em meios de ensaio por longos períodos de tempo antes do ensaio, as taxas de consumo de oxigênio são menor. Durante o ensaio, amostras passam por uma etapa de mistura durante cada ciclo. Esta mistura não só ajuda com as injeções de compostos químicos, mas também actua para recircular os meios de comunicação e fornecer oxigênio. O cérebro é capaz de ficar metabolicamente ativas por períodos mais longos durante esses ciclos de medida-mistura do que eles iria ser incubando na mídia sobre a bancada. Portanto, a dissecação de cérebros larvas deve ser dominada antes de começar a configurar este ensaio. Quando configurar este ensaio, analisar um pequeno número de genótipos ao mesmo tempo, para minimizar o número de cérebros necessários e poços utilizaram. Isto evitará atrasos entre a dissecação e as medições de ensaio. Em terceiro lugar, manter uma temperatura estável é necessário analisar as taxas metabólicas em condições fisiologicamente relevantes. Temperaturas de ensaio aumento podem causar a morte do tecido, observada por baixas taxas de consumo de oxigênio (Figura 3). Se moscas são criadas em uma temperatura diferente para fins experimentais, as medições devem também efectuar a esta temperatura. Enquanto as dissecções mais provável serão realizadas à temperatura ambiente, se o ensaio será realizado a uma temperatura diferente, o cérebro chapeado e contido deve ser incubado à temperatura pretendida por 15 min antes de executar o ensaio. Por último, observando-se o pós-ensaio poços é fundamental para determinar se posicionando o tecido afetado as medições. Ocasionalmente, haverá um outlier bem que, depois de observar a placa sob o microscópio de dissecação, pode ser eliminado a partir da análise de dados devido a qualquer perda de tecido ou bloqueios, onde o cérebro caiu fora do centro do poço e é preso sob o anel de polímero da restrição. Tecido pode ser perdido se a contenção não foi protegida corretamente ao poço e foi perturbada durante os ciclos de misturando. Enquanto nenhum destes eventos acontece muitas vezes, se não são excluídas da análise, eles irão diminuir substancialmente os valores de taxa.
A medição de fluxo metabólico de todo tecido pelo monitoramento de consumo de oxigênio e a acidificação do extracelular fornece um método biologicamente relevante para a compreensão de como o metabolismo é alterado pela paisagem genética ou outras condições experimentais. Este método é suficientemente sensível para detectar alterações metabólicas em um único cérebro d. melanogaster , que não é possível usando o fluxo de paragem respirometria ou calorimetria indireta. É também menos tecnicamente desafiador do que usando um eletrodo de Clark para medir o consumo de oxigênio. Uma vantagem adicional do presente protocolo é a capacidade de analisar um cérebro inteiro por bem. O formato de 96 poços permite leituras mais sensíveis, e assim, mais de um genótipo pode ser analisado em um momento devido ao menor número de amostras necessárias por ensaio. Enquanto medindo o metabolismo no tecido é ainda um desafio e requer cuidadosamente criados e animais sincronizados, este protocolo descreve um método rápido e relativamente simplista e tem o potencial de analisar inúmeras sensibilidades metabólicas em D. melanogaster cérebros larvas e adultos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estoques, obtidos a partir do centro de estoque de Drosophila Bloomington (NIH P40OD018637) foram utilizados neste estudo. A pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pela rede institucional desenvolvimento Award (IDeA) de excelência em pesquisa biomédica do Instituto Nacional de General Medical Ciências, dos institutos nacionais de saúde, sob número de concessão P20GM103430 e pela Fundação de Rhode Island. Autores agradecer J. águas e P. Snodgrass-correia pelo apoio no desenvolvimento deste protocolo.
Materials
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
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