Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto
Summary
Vi presentiamo un protocollo per misurare il consumo di ossigeno e l’acidificazione extracellulare nei cervelli di larve e adulti di Drosophila melanogaster . Un analizzatore metabolico è utilizzato con un protocollo adattato e ottimizzato. Vincoli di micro-tessuto sono una componente fondamentale del presente protocollo e progettate e create appositamente per il loro uso in questa analisi.
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo per misurare il metabolismo nel cervello di Drosophila melanogaster larvale e adulto. Quantificazione del metabolismo in organi interi fornisce una comprensione a livello del tessuto di utilizzazione di energia che non può essere catturato quando si analizzano le cellule primarie e linee cellulari. Mentre questa analisi è ex vivo, esso consente la misurazione da un numero di cellule specializzate che lavorano insieme per eseguire una funzione in un tessuto e modelli più da vicino l’organo in vivo . Riprogrammazione metabolico è stato osservato in molte malattie neurologiche, compreso neoplasia e malattie neurodegenerative. Questo protocollo è stato sviluppato per assistere l’indagine della Comunità d. melanogaster del metabolismo nei modelli di malattia neurologica usando un analizzatore metabolico commercialmente disponibile. Misurazione del metabolismo del cervello intero nell’analizzatore metabolico è impegnativo a causa della geometria del cervello. Questo analizzatore richiede campioni di rimanere nella parte inferiore di una piastra a 96 pozzetti. Campioni di cellule e tessuti pugni possono aderire alla superficie della piastra cellulare o utilizzare piastre sferoide, rispettivamente. Tuttavia, la forma sferica, tridimensionale dei cervelli di d. melanogaster impedisce il tessuto di aderire alla piastra. Questo protocollo richiede una moderazione di micro-tessuto appositamente progettato e fabbricato che aggira questo problema impedendo qualsiasi movimento del cervello pur consentendo misurazioni metaboliche da due sonde sensore a stato solido dell’analizzatore. Consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare sono riproducibili e sensibili ad un trattamento con inibitori metabolici. Con una minore ottimizzazione, questo protocollo può essere adattato per l’uso con qualsiasi tessuto intero e/o sistema modello, purché la dimensione del campione non superi la camera generata dal sistema di ritenuta. Mentre misure metaboliche basale e un’analisi dopo un trattamento con inibitori mitocondriali sono descritte all’interno di questo protocollo, innumerevoli condizioni sperimentali, come preferenza di fonte di energia e ambiente di allevamento, potranno essere interrogate.
Introduction
Riprogrammazione metabolica è stata identificata in molte malattie neurologiche, compreso il Glioblastoma Multiforme (GBM), malattia di Huntington e disturbo depressivo maggiore (MDD)1,2,3. Come metabolismo diventa il fulcro delle strategie terapeutiche, strumenti per la ricerca di base metabolica hanno avanzato. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono stata progettata per lo studio di linee cellulari e cellule primarie o per analizzare più grandi tessuti post-fissazione o – congelamento. Alcuni approcci hanno contato sui kit per misurare semplicisticamente specifici metaboliti, mentre altri hanno utilizzato più costose e complesse analisi che utilizza cromatografia in combinazione con spettrometria di massa4 per lo stesso obiettivo. Per capire il più grande paesaggio metabolico, metabolica profilatura5,6 e analisi di cambiamento continuo metabolico (MFA)7 è emerso per completare la proteomica su larga scala e studi genomici. Profilatura fornisce una rappresentazione quantitativa di metaboliti in una cella o un tessuto ad un certo punto nel tempo, mentre MFA si espande su questo consentendo il monitoraggio dei metaboliti identificati nel corso del tempo. Quest’ultimo è stato utile nel rivelare come fonti di energia vengono utilizzate in modo diverso in una cella o un tessuto quando in una malattia statale8. Tuttavia, questi metodi non includono la misurazione del tasso metabolico in generale.
Per interrogare lo stato metabolico nel complesso dei sistemi modello piccolo, i metodi tradizionali, come l’ elettrodo di Clark9 e la calorimetria indiretta10, possono essere utilizzati per misurare il consumo di ossigeno o configurati per fermata manometrica di flusso, per misura dell’ossigeno e la concentrazione di biossido di carbonio, rispettivamente. Queste tecniche, fornendo con precisione spaccato la lettura della riprogrammazione metabolica a livello di organismo, hanno limitazioni. L’uso dell’elettrodo di Clark può essere tecnicamente impegnativo e non è progettato per gli studi di alto-rendimento. Il respirometro flusso fermata non può funzionare con la sensibilità necessaria per analisi di cellule o tessuti. Diversi anni fa, nuova tecnologia è stata sviluppata appositamente per queste applicazioni più piccole11. Questi strumenti sono stati inizialmente progettati per misurare il consumo di ossigeno e l’acidificazione extracellulare di linee cellulari e cellule primarie in un formato di 24 o 96 pozzetti. La semplicità dell’output set-up e dati stabilito questo metodo come alternativa agli approcci tradizionali. Questa metodologia è uno strumento potente per le cellule e gli avanzamenti recenti hanno permesso per la misurazione del tessuto punzoni12,13,14. Tuttavia, i metodi utilizzati in questi esperimenti non consentono la misurazione di organi interi da sistemi modello piccolo.
L’analisi metabolica dei modelli di malattia coinvolge spesso l’interazione tra cellule di funzione specializzata che risiedono all’interno del tessuto stesso. Ad esempio, le cellule gliali producono metaboliti utilizzati dai neuroni. Queste interazioni metaboliche sono necessari per la sopravvivenza neuronale15. Sistemi modello piccolo sono vantaggiosi per indagare questioni come queste. Studi per misurare il metabolismo di un intero organo, che contiene una varietà di tipi cellulari, aggiungerà alla comprensione dell’energia l’utilizzo in vivo. Recentemente, Becker et al ha segnalato un metodo di misurazione del consumo di ossigeno in tutta Mosca teste16. Unendo un numero di teste insieme in un pozzetto di una piastra di cella 24 pozzetti, letture di consumo di ossigeno sono state ottenute utilizzando un analizzatore metabolico. Mentre questo funziona bene per teste, che sono facilmente separate dal corpo, è molto più difficile da usare per organi quali cervello larvale, perché una grande quantità deve essere sezionato per questo metodo. Di conseguenza, un metodo che utilizza una piastra a 96 pozzetti delle cellule, che aumenta la sensibilità del consumo di ossigeno e letture di acidificazione extracellulare, è stato sviluppato per analizzare un singolo cervello intero larvale.
L’analizzatore metabolico utilizzato in questo studio richiede il campione da misurare per rimanere nella parte inferiore del pozzo di una piastra a 96 pozzetti delle cellule. Per cellule e tessuti relativamente piatte, questa non è una sfida; Tuttavia, per i cervelli larvali e adulti di d. melanogaster , non è possibile utilizzando protocolli di rivestimento del piatto tradizionale. La forma sferica tridimensionale dei cervelli in modo affidabile non aderisca alla superficie della placca, e quelli che lo fanno sono spesso danneggiati durante il tentativo di inserirli correttamente nel pozzo. Una parte fondamentale di questo nuovo protocollo è la progettazione e lo sviluppo di micro-tessuto vincoli17 che forniscono una piccola camera per il cervello a risiedere in senza interferire con le misurazioni metaboliche. La camera generata è circa 0,016 in altezza e offre spazio sufficiente per contenere facilmente molti cervelli di d. melanogaster . I vincoli sono costituiti da maglia di nylon attaccata un anello di polimero inerte e sarà discusso ulteriormente nei Risultati di rappresentante. Utilizzando questi vincoli riduce al minimo il tempo necessario per preparare i cervelli sezionati per la misurazione metabolica. Ottimizzare la procedura di misurazione genera il consumo di ossigeno costante, riproducibile e tassi di acidificazione extracellulare dopo sei cicli di misura (di 25 min). I cervelli rimangono metabolicamente attivi in queste condizioni per un minimo di 2 h, che consente di utilizzare iniezioni di terapeutica, inibitori o altri trattamenti tramite l’analizzatore metabolico cartuccia droga consegna porte. Questo protocollo può anche essere facilmente adattato per altri tessuti e piccolo modello sistemi18.
Il protocollo descritto di seguito viene descritto come analizzare il consumo di ossigeno in un intero cervello larvale della drosofila quando sfidato con sforzo mitocondriale. Per sottolineare il cervello, oligomycin è aggiunto per inibire la ATP sintasi19. La diminuzione nel consumo di ossigeno da letture basale Mostra una misura della quantità di ATP, a seconda di respirazione nel cervello. Ulteriori diminuzioni del consumo di ossigeno dopo trattamenti con rotenone20 e antimycin A21, inibitori dei complessi della catena di trasporto degli elettroni, I e III, rispettivamente, indicano la quantità di consumo di ossigeno non mitocondriale nella cervello. Questo test è un esempio di respirazione come mitocondriale in un cervello Vola potrebbe essere confrontato e come questo protocollo può essere usato per confrontare il metabolismo in diversi genotipi. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per misurare il consumo di ossigeno semplicemente basale e tassi di acidificazione extracellulare, nonché progettare più elaborati studi che studiano l’utilizzo dell’energia specifica o ipotesi di utilizzazione del substrato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, un nuovo metodo per l’analisi metabolica di d. melanogaster cervelli larvale e adulto ex vivo è descritto. In condizioni basali, consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare indicano come metabolicamente attiva il cervello è e può determinare se un tessuto è diventato più dipendente dalla respirazione mitocondriale rispetto a glicolitico rispettivamente11.
Trattando i cervelli con inibitori o farmaci terapeutici può fornire ulteriori informazioni sullo stato metabolico del tessuto. Substrati metabolici possono anche essere aggiunto per determinare le dipendenze su specifici metaboliti, come il glucosio per verificare il Warburg effetto22 o glutamina per indagare glutaminolysis23— sia comune nella riprogrammazione metabolica. Per studi a lungo termine, larve o mosche potrebbero anche essere somministrati farmaci invece di utilizzare porte di iniezione e cervelli potrebbero essere dosati a intervalli o nel punto finale, a seconda del design sperimentale. Questo metodo può essere ottimizzato per numerose applicazioni.
Questo metodo è stato ottimizzato per il cervello, ma può essere utilizzato per analizzare altri larvale18 e tessuti adulti. Inoltre, altri sistemi di piccolo modello possono utilizzare questo metodo per misurare tutto organismi18 o tessuti. L’unica limitazione di questo metodo per altri sistemi di ottimizzazione è la dimensione dell’organismo, tessuto o organo. La camera di creato da sistema di ritenuta di micro-tessuto è la barriera di dimensioni per l’esecuzione del dosaggio. Se l’output metabolica è troppo basso per il cervello o del tessuto in fase di test, e la dimensione del campione non è un vincolo, pool di campioni può essere utilizzato per aumentare le misure di analisi e sensibilità. Modifica questo protocollo per altre applicazioni deve solo richiedere ottimizzazioni minori, tra cui 1) scegliere la misura adatta e mescolare ciclo numeri e tempi e 2) determinare le concentrazioni di trattamento efficace per il tessuto. La misura e tempi di miscelazione sono state determinate mediante il monitoraggio concentrazione di ossigeno misurata dall’analizzatore metabolico durante ogni ciclo. Questo può essere visto selezionando O2 nel pulsante asse Y2 nella finestra panoramica dopo che viene completata l’esecuzione. Durante ogni ciclo, dovrebbe esserci una concentrazione di ossigeno di drop-in che riflette il consumo di ossigeno del tessuto durante il tempo misurato, seguito da un ritorno alla concentrazione iniziale di ossigeno durante il ciclo di miscelazione. I tempi di misura e mix dovrebbero essere testati fino a quando questo modello è osservato. Utilizzando questo metodo, sono stati studiati altri cervelli dell’insetto. Questi cervelli sono stati più grandi cervelli volare qui usato ma ancora in forma all’interno della camera generata dal sistema di ritenuta del tessuto. Le letture di OCR da questi cervelli erano alte come 400 pmol/min (dati non mostrati). I risultati di questi studi, come pure i tassi di OCR che si allineano con altri studi misura intera-fly ossigeno consumo18,24, suggeriscono che i cervelli di d. melanogaster non erano ossigeno limitato. Per entrambi i cervelli di d. melanogaster e tessuti da altri organismi, l’applicazione di questo metodo richiede una particolare attenzione a quattro passaggi critici.
Per raggiungere con successo misure riproducibili e biologicamente rilevanti, ci sono passaggi critici del protocollo che deve essere seguita. In primo luogo, l’uso di un sistema di ritenuta del micro-tessuto è richiesto per questo metodo. Queste restrizioni utilizzando le specifiche e i materiali elencati di produzione è essenziale. I materiali sono stati selezionati a causa della loro composizione chimica inerte e la loro capacità per consentire lo scambio di supporto corretto durante le fasi di miscelazione senza la creazione di bolle d’aria. In secondo luogo, per massimizzare l’output metabolica del tessuto è necessaria una tempestiva preparazione di dissezione e piastra. Tempi brevi dissezione non dovrebbero alterare significativamente il cervello. Altri studi hanno indicato che cervelli volare possono essere mantenuti vivi per ore o giorni dopo dissezione se correttamente conservato in un’aspersione camera25. Tuttavia, come visto in Figura 3B e 3D, se cervelli sono rimasto seduto nei media di dosaggio per lunghi periodi di tempo prima del dosaggio, sono diminuiti i tassi di consumo di ossigeno. Durante il test i campioni subiscono un miscelazione passo durante ogni ciclo. Questa miscelazione non solo aiuta con le iniezioni di composti chimici, ma agisce anche per ricircolare i media e fornire ossigeno. I cervelli sono in grado di rimanere metabolicamente attivo per periodi più lunghi durante questi cicli di misura-mix di essi sarebbe essere incubando nei media sulla parte superiore del banco. Pertanto, la dissezione del cervello larvale dovrebbe essere padroneggiata prima di iniziare a impostare la pagina di questo saggio. Quando questo test, che istituisce un piccolo numero di genotipi di analizzare contemporaneamente, per ridurre al minimo il numero dei cervelli necessari e pozzi utilizzati. Questo consentirà di evitare ritardi tra la dissezione e le misurazioni di dosaggio. In terzo luogo, mantenere una temperatura stabile è necessaria per analizzare i tassi metabolici in condizioni fisiologicamente rilevanti. Temperature aumentato dosaggio possono causare la morte del tessuto, osservato da più bassi tassi di consumo di ossigeno (Figura 3). Se le mosche sono allevati ad una temperatura diversa per scopi sperimentali, le misure dovrebbero essere effettuate anche a questa temperatura. Mentre le dissezioni probabilmente verranno eseguite a temperatura ambiente, se l’analisi sarà condotta ad una temperatura diversa, i cervelli placcati e sobri vanno incubati a temperatura richiesta per 15 min prima di eseguire il test. Infine, osservando post-l’analisi pozzi è fondamentale per determinare se il posizionamento del tessuto interessato le misurazioni. Occasionalmente, ci sarà un valore erratico di ben che, dopo aver osservato la piastra sotto il microscopio per dissezione, possa essere eliminato dall’analisi dei dati a causa di una perdita di tessuto o mispositioning, in cui il cervello è scivolato fuori dal centro del pozzo ed è bloccato sotto l’anello in polimero del sistema di ritenuta. Tessuto può essere perso se il sistema di ritenuta non è fissato bene al pozzo ed è stato disturbato durante i cicli di miscelazione. Mentre nessuno di questi eventi non accade spesso, se non vengono esclusi dall’analisi, essi si abbassa sostanzialmente i valori della frequenza.
La misura del cambiamento continuo metabolico del intero-tessuto di monitoraggio consumo di ossigeno e l’acidificazione extracellulare fornisce un metodo biologicamente rilevante per la comprensione di come il metabolismo è alterato da panorama genetico o altre condizioni sperimentali. Questo metodo è abbastanza sensibile per rilevare cambiamenti metabolici in un unico cervello di d. melanogaster , che non è possibile utilizzare stop-flow manometrica o calorimetria indiretta. Inoltre è tecnicamente meno difficile rispetto all’utilizzo di un elettrodo di Clark per misurare il consumo di ossigeno. Un ulteriore vantaggio di questo protocollo è la capacità di analizzare un intero cervello per pozzetto. Il formato di 96 pozzetti consente letture più sensibile, e così, più di un genotipo può essere analizzato in un momento a causa del numero ridotto di campioni richiesti per test. Mentre la misurazione del metabolismo nel tessuto è comunque impegnativo e richiede attentamente allevati e sincronizzati animali, questo protocollo descrive un metodo veloce, relativamente semplice ed ha il potenziale di analizzare numerose sensibilità metabolica in D. melanogaster cervelli larvali e adulti.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Titoli ottenuti da Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018637) sono stati utilizzati in questo studio. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dalla rete istituzionale Development Award (IDeA) per eccellenza di ricerca biomedica dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto concessione numero P20GM103430 e dalla Fondazione Rhode Island. Autori ringraziano J. Waters e P. Snodgrass-cintura per il loro supporto nello sviluppo di questo protocollo.
Materials
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
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