Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen
Summary
Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.
Abstract
Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van het metabolisme in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Kwantificeren van de metabolisme in hele organen biedt een weefsel-niveau begrip van energie gebruik die niet kan worden vastgelegd bij het analyseren van primaire cellen en cellijnen. Terwijl deze analyse ex vivo is, het staat voor de meting van een aantal gespecialiseerde cellen werken samen om het uitvoeren van een functie in een weefsel en nauwer het orgel in vivo modellen. Metabole herprogrammering is waargenomen in veel neurologische ziekten, waaronder neoplasie, en neurodegeneratieve ziekten. Dit protocol werd ontwikkeld ter ondersteuning van de Gemeenschap van de D. melanogaster onderzoek naar metabolisme in neurologische ziekte modellen met behulp van een commercieel beschikbare metabole analyzer. Meten van metabolisme van hele hersenen in de metabole analyzer is een uitdaging als gevolg van de geometrie van de hersenen. Deze analyzer vereist monsters te blijven op de bodem van een 96-wells-plaat. Celsteekproeven en weefsel stempels kunnen houden aan het oppervlak van de plaat van de cel of gebruiken sferoïde platen, respectievelijk. Echter, de sferische, driedimensionale vorm van D. melanogaster hersenen verhindert het weefsel vast te houden aan de plaat. Dit protocol vereist een speciaal ontworpen en vervaardigde micro-weefsel terughoudendheid die dit probleem omzeilt door te voorkomen dat elke beweging van de hersenen terwijl nog steeds metabole metingen uit van de analyzer twee solid-state sensor sondes. Zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven zijn reproduceerbaar en gevoelig zijn voor een behandeling met metabole remmers. Met een kleine optimalisatie, kan dit protocol worden aangepast voor gebruik met elke hele weefsel en/of modelsysteem, mits de grootte van de steekproef niet groter is dan de kamer die is gegenereerd door de terughoudendheid. Terwijl basale metabole metingen en een analyse na een behandeling met mitochondriale remmers worden beschreven in dit protocol, kunnen talloze experimentele omstandigheden, zoals energie bron voorkeur en fokken milieu, worden ondervraagd.
Introduction
Metabole herprogrammering is geconstateerd in veel neurologische ziekten, met inbegrip van Glioblastoma Multiforme (GBM), de ziekte van Huntington en grote depressieve stoornis (MDD)1,2,3. Metabolisme naarmate de focus van therapeutische strategieën, geavanceerde hulpmiddelen voor metabole basisonderzoek. Echter werden de meeste van deze methoden ontworpen om cellijnen en primaire cellen te studeren of te analyseren van grotere weefsels na fixatie of -bevriezing. Aantal benaderingen hebben vertrouwd op kits te simplistisch meten van specifieke metabolieten, terwijl anderen meer dure en complexe analyses met behulp van chromatografie in combinatie met massaspectrometrie4 voor hetzelfde doel hebben gebruikt. Om te begrijpen van de groter metabole landschap, metabole profilering van5,6 en metabole flux-analyse (MFA)7 ontstaan ter aanvulling van de grootschalige proteomic en genomische studies. Profilering biedt een kwantitatieve aanduiding van metabolieten in een cel of een weefsel op een gegeven moment in de tijd, terwijl MFA dit breidt doordat het volgen van gelabelde metabolieten na verloop van tijd. De laatste nuttig geweest in onthullen hoe energiebronnen anders worden gebruikt in een cel of een weefsel bij een ziekte staat8. Deze methoden omvatten echter geen de meting van de totale stofwisseling.
Als u wilt de totale metabole toestand van de kleine modelsystemen ondervragen, kunnen traditionele methoden, zoals de Clark-elektrode9 en indirecte calorimetrie10, worden gebruikt voor het meten van zuurstofverbruik of geconfigureerd voor stop stroom respirometrie, te meten van zuurstof en kooldioxide concentratie, respectievelijk. Deze technieken, hebben terwijl het nauwkeurig inzicht bijbrengen in de uitlezing van metabole herprogrammering op het niveau organisme, beperkingen. Het gebruik van de Clark-elektrode kan technisch uitdagende en is niet ontworpen voor high-throughput onderzoek. De stop stroom respirometer functioneren niet met de gevoeligheid moet gehaltebepaling van cellen of weefsels. Enkele jaren geleden, werd nieuwe technologie speciaal ontwikkeld voor deze kleinere toepassingen11. Deze instrumenten waren in eerste instantie bedoeld voor het meten van het zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring van cellijnen en primaire cellen in een 24 – of 96-Wells-indeling. De eenvoud van de set-up en gegevens output opgericht deze methode als een alternatief voor de traditionele benaderingen. Deze methodologie is een krachtig hulpmiddel voor cellen, en recente vooruitgang hebben toegestaan voor het meten van weefsel stoten12,13,14. De methoden die zijn gebruikt in deze onderzoeken laat echter niet voor de meting van hele organen van kleine modelsystemen.
De metabole analyse van ziekte modellen vereist vaak de interactie tussen cellen van gespecialiseerde functie woonachtig binnen de dezelfde weefsel. Bijvoorbeeld produceren gliale cellen metabolieten gebruikt door de neuronen. Deze metabole interacties zijn vereist voor de neuronale overleven15. Kleine modelsystemen zijn voordelig voor het onderzoeken van vragen als deze. Studies voor het meten van het metabolisme van een hele orgel, met allerlei soorten cellen, zal toevoegen aan het begrip van de energie-gebruik in vivo. Becker et al. rapporteerde onlangs, een methode voor het meten van het zuurstofverbruik in hele vliegen hoofden16. Door het bundelen van een aantal hoofden samen in een put van een 24-well cel plaat, werden zuurstof verbruik lezingen verkregen met behulp van een metabole analyzer. Terwijl dit goed voor de hoofden, die gemakkelijk gescheiden van het lichaam werkt zijn, is het veel moeilijker te gebruiken voor organen zoals larvale hersenen, omdat een grote hoeveelheid moet worden ontleed voor deze methode. Daarom werd een methode met behulp van een 96-Wells cel plaat, die de gevoeligheid van het zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring lezingen verhoogt, ontwikkeld om de gehaltebepaling van een enkel geheel larvale hersenen.
De metabole analyzer gebruikt in deze studie vereist het monster wordt gemeten om te blijven op de bodem van de put van een 96-Wells cel plaat. Voor relatief vlakke weefsels en cellen is dit niet een uitdaging; voor D. melanogaster larvale en volwassen hersenen is het echter niet mogelijk met behulp van traditionele plaat coating protocollen. De driedimensionale bolvorm van de hersenen zal niet op betrouwbare wijze voldoen aan het oppervlak van de plaat, en degenen die wel zijn vaak beschadigd tijdens een poging om hen goed te plaatsen in de put. Een cruciaal onderdeel van dit nieuwe protocol is het ontwerp en de ontwikkeling van micro-weefsel beperkingen17 waarmee een kleine kamer voor de hersenen om in te verblijven zonder interferentie met de metabole metingen. De kamer die gegenereerd is ongeveer 0.016 in in hoogte en biedt voldoende ruimte, zodat het gemakkelijk houden veel D. melanogaster hersenen. De beperkingen bestaan uit nylon mesh gekoppeld aan een ring van inerte polymeren en zal verder worden besproken in de Resultaten van de vertegenwoordiger. Met behulp van deze beperkingen minimaliseert de benodigde tijd voor het bereiden van ontleed hersenen voor de metabole meting. Optimaliseren van de meetprocedure genereert gestage, reproduceerbare zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven na zes cycli van de meting (van 25 min). De hersenen blijven metabolisch actief onder deze omstandigheden voor een minimum van 2 h, waarmee injecties van therapeutiek, remmers of andere behandelingen via de metabole analyzer cartridge drug-uitvoerpoorten. Dit protocol kan ook gemakkelijk aan te passen voor andere weefsels en kleine model systemen18worden.
Het protocol dat hieronder wordt beschreven hoe het zuurstofverbruik in een hele Drosophila larvale hersenen wanneer uitgedaagd met mitochondriale stress-test. Om te benadrukken de hersenen, wordt oligomycin toegevoegd voor de remming van de ATP-synthase19. De daling van zuurstofverbruik van basale lezingen toont een meting van de hoeveelheid ATP-afhankelijk van ademhaling in de hersenen. Verdere dalingen in het zuurstofverbruik na behandelingen met rotenon20 en antimycin een21, remmers van elektronentransport ketencomplexen I en III, respectievelijk, geeft de hoeveelheid niet-mitochondriale zuurstofverbruik in de hersenen. Deze test is een voorbeeld van hoe mitochondriale ademhaling in een vlieg hersenen vergeleken kan worden en hoe dit protocol kan worden gebruikt voor het vergelijken van het metabolisme in verschillende genotypen. Dit protocol kan echter worden aangepast om gewoon basale zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven, evenals over de uitgebreidere ontwerpstudies onderzoek naar specifieke energie gebruik of substraat gebruik hypothesen te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier, wordt een nieuwe methode voor de metabole analyse van D. melanogaster larvale en volwassen hersenen ex vivo beschreven. Onder basale omstandigheden geven zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven hoe metabolisch actief de hersenen is en kunt bepalen of een weefsel afhankelijker van mitochondriale versus glycolytic ademhaling geworden, respectievelijk11.
Behandeling van de hersenen met remmers of therapeutische drugs kan verdere informatie verstrekken over de metabole status van het weefsel. Metabole substraten kunnen ook worden toegevoegd aan het bepalen van de afhankelijkheden van specifieke metabolieten, zoals glucose te testen voor het Warburg effect22 of glutamine te onderzoeken glutaminolysis23— beide common in metabole herprogrammering. Langetermijnstudies, larven of vliegen kunnen ook worden gevoed drugs in plaats van met behulp van injectie poorten en hersenen kunnen worden bepaald met regelmaat of het eindpunt, afhankelijk van de proefopzet. Deze methode kan worden geoptimaliseerd voor tal van toepassingen.
Deze methode is geoptimaliseerd voor de hersenen, maar kan worden gebruikt om andere larvale18 en volwassen weefsels te analyseren. Bovendien kunnen andere kleine modelsystemen gebruiken deze methode voor het meten van de hele organismen18 of weefsels. De enige beperking voor het optimaliseren van deze methode voor andere systemen is de grootte van het orgaan, weefsel of organisme. De kamer die is gemaakt door de terughoudendheid van de micro-weefsel is de barrière van de grootte tot het uitvoeren van de test. Als de metabole output is te laag voor de hersenen of het weefsel wordt getest, en de grootte van de steekproef niet een beperking is, kan bundeling van monsters worden gebruikt om de assay metingen en de gevoeligheid te verhogen. Wijziging van dit protocol voor andere toepassingen moet alleen kleine optimalisaties, waaronder 1) het kiezen van de passende maatregelen vereist en meng cyclus getallen en timing, en 2) bepalen van de effectieve behandeling concentraties voor het weefsel. De maatregel en mengen tijden werden vastgesteld door de monitoring zuurstofconcentratie gemeten door de metabole analyzer tijdens elke cyclus. Dit kan worden bekeken door het selecteren van O2 in de Y2 as-knop in het overzichtsvenster na de run voltooid is. Tijdens elke cyclus, moet er een drop-in zuurstofconcentratie als gevolg van het weefsel van zuurstofverbruik gedurende de gemeten tijd, gevolgd door een terugkeer naar de oorspronkelijke zuurstofconcentratie tijdens het mengen cyclus. De maatregel en mix tijden moeten worden getest, totdat dit patroon wordt waargenomen. Met behulp van deze methode, zijn andere insecten hersenen bestudeerd. Deze hersenen waren groter dan de vliegen hersenen hier gebruikt maar nog binnen de zaal gegenereerd door het weefsel terughoudendheid past. De OCR-lezingen van deze hersenen waren maar liefst 400 pmol/min (gegevens niet worden weergegeven). De resultaten van deze studies, alsook de tarieven van de OCR die uitlijnen met andere studies meten geheel-fly zuurstof verbruik18,24, suggereren dat de D. melanogaster hersenen geen zuurstof beperkt waren. Voor zowel D. melanogaster hersenen en weefsels van andere organismen vereist toepassing van deze methode speciale aandacht voor vier kritische stappen.
Om te slagen reproduceerbaar zijn en biologisch relevante metingen, zijn er kritische stappen van het protocol dat moet worden gevolgd. Ten eerste, het gebruik van een micro-weefsel bevestigingssysteem is vereist voor deze methode. Deze beperkingen met behulp van de specificaties en de opgenomen grondstoffen productie is van essentieel belang. De materialen werden gekozen vanwege hun inerte chemische samenstelling, en hun vermogen om de juiste media uitwisseling mogelijk te maken tijdens het mengen stappen zonder de totstandbrenging van luchtbellen. Ten tweede, een tijdige voorbereiding van de dissectie en plaat is vereist voor het maximaliseren van de metabole output van het weefsel. Korte dissectie keer moeten aanzienlijk geen afbreuk doen aan de hersenen. Andere studies hebben aangetoond dat vliegen hersenen worden in leven voor uren tot dagen gehouden kunnen na dissectie als correct opgeslagen in een perfusie kamer25. Echter, zoals te zien in figuur 3B en 3D, als hersenen blijven zitten in assay media voor lange perioden voorafgaand aan de test, zijn de zuurstof verbruik daalde. Tijdens de test ondergaan monsters een mengen stap tijdens elke cyclus. Dit mengen niet alleen helpt met de injecties van chemische stoffen, maar ook om te recirculate van de media en zuurstof. De hersenen kunnen metabolisch actief voor langere perioden tijdens deze maatregel-mix-cycli dan zij zou worden aan het broeden in de media op de top van de Bank te blijven. Daarom moet de dissectie van larvale hersenen voordat u begint aan het instellen van deze test worden beheerst. Wanneer het opzetten van deze bepaling, een klein aantal genotypen analyseren op een moment, tot een minimum beperken van het aantal hersenen nodig en putten gebruikt. Dit voorkomt vertragingen tussen de ontleden en de assay-metingen. Ten derde, behoud van een stabiele temperatuur is vereist voor het analyseren van de stofwisseling in fysiologisch relevante voorwaarden. Verhoogde assay temperaturen kunnen leiden tot weefsel dood, waargenomen door lagere zuurstof verbruik (Figuur 3 c). Als vliegen worden gefokt op een verschillende temperatuur voor experimentele doeleinden, moeten ook de metingen worden uitgevoerd op deze temperatuur. Terwijl dissecties zal waarschijnlijk worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, als de bepaling bij een verschillende temperatuur zal plaatsvinden, moeten de vergulde en ingetogen hersenen worden geïncubeerd op de vereiste temperatuur gedurende 15 minuten staan voordat u de test uitvoert. Tot slot, observeren de putten na bepaling is van cruciaal belang om te bepalen als de metingen weefsel positionering beïnvloed. Soms zal er een uitschieter goed dat, na het observeren van de plaat onder de ontleden Microscoop, kan worden geëlimineerd uit de data-analyse als gevolg van een verlies van weefsel of mispositioning, waar de hersenen heeft gleed uit het midden van de put en zit vast onder de polymeer-ring van de beperking. Weefsel kan verloren gaan als de terughoudendheid was niet goed beveiligd aan het putje en werd verstoord tijdens het mengen cycli. Terwijl geen van deze gebeurtenissen vaak, gebeurt als ze niet worden uitgesloten van de analyse, zal ze de waarden van de snelheid aanzienlijk lager.
De meting van de metabole flux geheel-weefsel door toezicht zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring biedt een biologisch relevante methode om inzicht te krijgen hoe metabolisme door de genetische landschap of andere experimentele omstandigheden wordt gewijzigd. Deze methode is gevoelig genoeg voor het detecteren van metabole veranderingen in één D. melanogaster hersenen, die is niet mogelijk met behulp van stop-flow respirometrie of indirecte calorimetrie. Het is ook minder technisch uitdagend dan het gebruik van een Clark-elektrode voor het meten van zuurstofverbruik. Een bijkomend voordeel van dit protocol is de mogelijkheid om te analyseren een hele hersenen per putje. De 96-Wells-formaat zorgt voor meer gevoelige lezingen, en dus meer dan één genotype kan worden vehiculumcontrolegroep tegelijk vanwege het kleinere aantal monsters per bepaling. Terwijl het meten van metabolisme in weefsel nog uitdagend is en zorgvuldig vereist gefokt en gesynchroniseerde dieren, dit protocol beschrijft een snelle, relatief simplistische methode, en heeft het potentieel om het analyseren van talrijke metabole gevoeligheden in overleden melanogaster larven en de volwassen hersenen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aandelen verkregen van de Bloomington Drosophila voorraad Center (NIH P40OD018637) werden gebruikt in deze studie. Het onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de institutionele Development Award (idee) netwerk voor biomedische Research Excellence van de National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder grant nummer P20GM103430, en door de Stichting van Rhode Island. Auteurs bedanken J. wateren en P. Snodgrass-riem voor hun steun bij de ontwikkeling van dit protocol.
Materials
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
References
- Cai, H., et al. Metabolic dysfunction in Alzheimer’s disease and related neurodegenerative disorders. Current Alzheimer Research. 9 (1), 5-17 (2012).
- Zhao, S., et al. Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha. Science. 324 (5924), 261-265 (2009).
- Brody, A. L., et al. Brain metabolic changes in major depressive disorder from pre- to post-treatment with paroxetine. Psychiatry Research. 91 (3), 127-139 (1999).
- Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
- Dona, A. C., et al. A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal. 14, 135-153 (2016).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Zamboni, N., Fendt, S. -. M., Rühl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4 (6), 878-892 (2009).
- Duckwall, C. S., Murphy, T. A., Young, J. D. Mapping cancer cell metabolism with(13)C flux analysis: Recent progress and future challenges. Journal of Carcinogenesis. 12, 13 (2013).
- Clark, L. C., et al. Continuous recording of blood oxygen tensions by polarography. Journal of Applied Physiology. 6 (3), 189-193 (1953).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. Spatial Epidemiology: Methods and Applications. , 87-103 (2000).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Dunham-Snary, K. J., Sandel, M. W., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W. A method for assessing mitochondrial bioenergetics in whole white adipose tissues. Redox Biology. 2 (1), 656-660 (2014).
- Fan, Y. -. Y., Davidson, L. A., Callaway, E. S., Wright, G. A., Safe, S., Chapkin, R. S. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (1), G1-G9 (2015).
- Lee, H., et al. Increased mitochondrial activity in renal proximal tubule cells from young spontaneously hypertensive rats. Kidney International. 85 (3), 561-569 (2014).
- Volkenhoff, A., et al. Glial glycolysis is essential for neuronal survival in drosophila. Cell Metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).
- Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., De Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Tipping, M., Waters, J. Method and device for restraining contents of a cell plate. United States patent. , (2017).
- Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of Neuroscience Methods. 296, 32-43 (2018).
- Lardy, H. A., Johnson, D., McMurray, W. C. Antibiotics as tools for metabolic studies. I. A survey of toxic antibiotics in respiratory, phosphorylative and glycolytic systems. Archives of Biochemistry and Biophysics. 78 (2), 587-597 (1958).
- Turrens, J. F., Boveris, A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochemical Journal. 191, 421-427 (1980).
- Potter, V. R., Reif, A. E. Inhibition of an electron transport component by antimycin A. The Journal of Biological Chemistry. 194 (1), 287-297 (1952).
- Warburg, O. On the Origin of Cancer Cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Yang, L., Venneti, S., Nagrath, D. Glutaminolysis: A Hallmark of Cancer Metabolism. Annual Review of Biomedical Engineering. 19 (1), 163-194 (2017).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. The Journal of Experimental Biology. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (37), e1936 (2010).
