Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri
Summary
Embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases tek hücreli RNA sıralama tarafından takip endokrin hücrelerden yalıtım için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, analizleri sağlar pankreatik endokrin lineage gelişimi, heterojen ve transcriptomic dinamikleri hücre.
Abstract
Adacıklar içinde kümelenir, pankreatik endokrin hücreleri kan glikoz istikrar ve enerji metabolizmasını düzenler. Adacıkları, insülin salgılayan β hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde ortak endokrin ataları embriyonik evre sırasında farklı. Olgunlaşmamış endokrin hücreleri hücre proliferasyonu ile genişletin ve gelişimsel bir uzun postnatal dönemde olgun. Ancak, bu işlemlerin altında yatan mekanizmaları açıkça tanımlı değil. Tek hücreli RNA-sıralama farklı hücre popülasyonlarının ve izleme hücre lineage farklılaşma yollar karakterizasyonu için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, tek hücreli RNA-sıralama izole pankreas β hücre embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases için bir yöntemi açıklanmaktadır.
Introduction
Pankreas memelilerde yaşamsal metabolik bir organdır. Pankreas endokrin ve ekzokrin bölmeleri oluşur. Pankreatik endokrin hücreleri insülin üreten hücrelerin β ve glukagon üreten α hücreleri de dahil olmak üzere, birlikte adacıkları of Langerhans küme ve coordinately sistemik glikoz homeostazı düzenler. Disfonksiyon endokrin hücreleri sonuçlar diyabet mellitus, dünya çapında bir önemli halk sağlığı sorunu haline gelmiştir.
Endokrin pankreas hücreleri Ngn3 elde edilen+ ataları embriyogenez1sırasında. Daha sonra perinatal dönemde endokrin hücreleri için formu olgunlaşmamış adacıkları çoğalırlar. Bu olgunlaşmamış hücreleri devam geliştirmek ve yavaş yavaş zengin kan glikoz homeostazı yetişkin2düzenleyen skarların haline olgun adacıkları haline gelir.
Transkripsiyon faktörleri bir grup, β hücre farklılaşması düzenleyen tespit rağmen β hücrelerinin hassas olgunlaşma yolu hala belli değil. Ayrıca, β hücre olgunlaşma süreci de hücre sayı genişleme3,4 düzenlenmesi ve hücresel heterojenite5,6nesil içerir. Ancak, düzenleyici mekanizmaları bu süreçlerin de incelenmiştir değil.
Tek hücreli RNA-sıralama hücre altgrupları profil ve hücre lineage gelişim yolları7iz güçlü bir yaklaşımdır. Bu teknoloji, pankreas adacık geliştirme sırasında meydana gelen olayları tek hücre düzeyi8‘ de deşifre anahtar yararlanarak. Tek hücreli RNA-sıralama protokolleri arasında geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk ve daha düşük maliyet9standart reaktifler kullanımı tam uzunlukta cDNA nesil akıllı-seq2 sağlar. Akıllı-seq2 sıralama10için bir cDNA Kütüphanesi oluşturmak için yaklaşık iki gün alır.
Burada, floresans aktif hücre (FACS) sıralama kullanarak bir yöntem pancreases, fetal floresans etiketli β hücrelerinden yetişkin Ins1-RFP transgenik fareler11, yalıtım için önerdiğimiz ve transcriptomic performans analizleri tek hücre düzeyi, akıllı-seq2 teknolojisiyle (Şekil 1). Bu iletişim kuralı tüm pankreatik endokrin hücre tiplerinin normal, patolojik ve yaşlanma Birleşik Devletleri transcriptomes analiz etmek için genişletilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için tek hücreli ifade profilleri pankreas β hücrelerinin eğitim için etkili ve kullanımı kolay bir yöntemi gösterdi. Bu yöntem embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases endokrin hücrelerden izole etmek ve tek hücreli transcriptomic analizleri gerçekleştirmek için kullanılabilir.
En önemli adım tek β hücrelerinin yalıtım iyi durumda değil. Tam derin pancreases daha iyi sonraki sindirim için cevap. Genellikle dorsal pankreasta oluşur, yetersiz perfüzy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Ulusal Merkezi Protein Bilimler, Pekin (Pekin Üniversitesi) ve Pekin-Tsinghua Merkezi için hayat bilgisi Computing Platform için teşekkür ederim. Bu eser Bakanlığı Bilim ve teknoloji Çin (2015CB942800), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31521004, 31471358 ve 31522036) ve Pekin-Tsinghua Merkezi’nden Yaşam Bilimleri için c-R.X. için finansman tarafından desteklenen
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
References
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
- Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
- Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- . FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
- Hadley, W. . ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).
- . gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016)
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).
