Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato
Summary
Nós descrevemos um método para o isolamento de células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal, seguidos por sequenciação do ARN de célula única. Esse método permite que as análises do desenvolvimento de linhagem endócrina do pâncreas, heterogeneidade e transcriptomic dinâmica de células.
Abstract
Células endócrinas no pâncreas, que são agrupadas em Ilhéus, regulam a estabilidade de glicose do sangue e metabolismo energético. Os tipos de células distintas em Ilhéus, incluindo células secretoras de insulina β, são diferenciados de progenitores endócrinas comuns durante a fase embrionária. Células endócrinas imaturas expandir através da proliferação celular e amadurecem durante um período de tempo pós-natal do desenvolvimento. No entanto, os mecanismos subjacentes a esses processos não estão claramente definidos. A sequenciação do ARN-célula única é uma abordagem promissora para a caracterização das populações de células distintas e vias de diferenciação de linhagem de célula rastreamento. Aqui, descrevemos um método para a célula única-a sequenciação do ARN de células β do pâncreas isolado de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal.
Introduction
O pâncreas é um órgão vital metabólico em mamíferos. O pâncreas é composto por compartimentos endócrinos e exócrinas. Células endócrinas no pâncreas, incluindo células β produtoras de insulina e glucagon-produzindo células α, cluster juntos em ilhotas de Langerhans e coordenada regulam a homeostase de glicose sistémica. Disfunção das células endócrinas resulta em diabetes mellitus, que se tornou uma questão de saúde pública em todo o mundo.
Células endócrinas do pâncreas são derivadas de Ngn3+ progenitores durante a embriogênese1. Mais tarde, durante o período perinatal, as células endócrinas proliferaram para Ilhéus imaturo de formulário. Estas células imaturas continuam a desenvolver e tornar-se progressivamente ilhotas maduras, que se tornam ricamente vascularizadas regular homeostase de glicose do sangue em adultos2.
Embora foi identificado um grupo de fatores de transcrição que regulam a diferenciação de células β, o caminho exato de maturação das células β é ainda incerto. Além disso, o processo de maturação de células β envolve também o Regulamento da cela número expansão3,4 e a geração de heterogeneidade celular5,6. No entanto, os mecanismos de regulação desses processos não foram bem estudados.
A sequenciação do ARN-célula única é uma abordagem poderosa que pode perfil subpopulações de células e rastrear celular linhagem caminhos do desenvolvimento7. Aproveitando esta tecnologia, a chave de eventos que ocorrem durante o desenvolvimento de ilhotas pancreáticas podem ser decifrados a célula única nível8. Entre os protocolos de célula única-a sequenciação do ARN, Smart-seq2 permite a geração de cDNA completo com sensibilidade melhorada e precisão e a utilização de reagentes padrão no menor custo9. Inteligente-seq2 leva cerca de dois dias para construir uma biblioteca de cDNA para sequenciamento10.
Aqui, propomos um método para o isolamento de células β fluorescência-etiquetada dos pancreases de fetal adulto Ins1-RFP11ratos transgénicos, usando fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e o desempenho de transcriptomic analisa na nível de célula única, usando a tecnologia Smart-seq2 (Figura 1). Este protocolo pode ser estendido para analisar a transcriptomes de todos os tipos de célula endócrina do pâncreas em Estados normais, patológicos e envelhecimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, temos demonstrado um método eficaz e fácil de usar para estudar os perfis de expressão de célula única das células β do pâncreas. Esse método pode ser usado para isolar células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal e realizar análises de transcriptomic de célula única.
O passo mais crítico é o isolamento das células β único em boas condições. Totalmente perfundidos pancreases respondem melhor à digestão subsequente. Insuficiente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o centro nacional para Ciências da proteína, Beijing (Peking University) e do centro de Pequim-Tsinghua para a plataforma de computação de Ciências da vida. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia da China (2015CB942800), Nacional Natural Science Foundation da China (31521004, 31471358 e 31522036) e financiamento de Pequim-Tsinghua centro para Ciências da vida para R.X.-C.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
References
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