マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析
Summary
単一細胞 RNA シーケンス続いて胎生期、新生児および生後の膵臓内分泌細胞の単離方法について述べる。この方法により、分析、膵内分泌系統の開発の細胞の不均一性とトランスクリプトームのダイナミクス。
Abstract
ランゲルハンス島におけるクラスター化されて、膵臓の内分泌細胞は、血液グルコースの安定性とエネルギー代謝を調節します。Β 細胞のインスリン分泌を含む島の明瞭な細胞の種類は萌芽期の段階の間に一般的な内分泌前駆細胞と区別されます。未熟な内分泌細胞は細胞増殖を介して展開し、長い生後発達期間中に成熟します。しかし、これらのプロセスの基になるメカニズムは明確には定義されていません。単一細胞の RNA シーケンスは、異なる細胞集団およびトレース細胞系統分化経路の評価の有望なアプローチです。ここでは、胎生期、新生児および生後の膵臓から分離膵 β 細胞の単一細胞の RNA シーケンスの手法について述べる。
Introduction
膵臓は、哺乳類の重要な新陳代謝器官です。膵臓は、内分泌と外分泌のコンパートメントで構成されます。インスリン産生 β 細胞と α 細胞のグルカゴン産生などを含む膵の内分泌細胞はランゲルハンス島で一緒にクラスターし、協調全身グルコース恒常性を調節します。内分泌細胞の機能不全は、世界中の主要な公衆衛生問題となっている糖尿病の結果します。
膵内分泌細胞由来 Ngn3+前駆細胞胚1中。その後、周産期、内分泌細胞はフォーム未熟な小島に増殖します。これらの未熟な細胞は、開発し、大人2血液グルコースの恒常性を調節する血管になる豊かな成熟した小島を徐々 にしていきます。
Β 細胞の分化を制御する転写因子群が確認されていますが、β 細胞の成熟の正確な経路はまだはっきりしません。また、β 細胞の成熟過程にはセル数拡張3,4の規制と細胞異質性5,6世代も行われます。しかし、これらのプロセスの制御機構がよく研究されていません。
単一細胞の RNA シーケンスは、細胞の亜集団をプロファイルおよびセル血統発達経路7をトレースできるようにする強力なアプローチです。この技術では、単一セルのレベル8で膵島の開発中に発生するイベントを解読するキーを利用してください。単一細胞の RNA シーケンス プロトコルの中では、スマート seq2 は、感度の向上と精度、低コスト9時標準試薬の使用と完全長 cDNA の生成を可能です。スマート seq2 はシーケンス10の cDNA ライブラリを組み立てるに約 2 日かかります。
ここでは、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用してアダルト Ins1 RFP トランスジェニック マウス11、胎児の膵臓からの蛍光標識 β 細胞の分離法を提案し、トランスクリプトームのパフォーマンス解析で、スマート seq2 技術 (図 1) を使用して単一細胞レベル。このプロトコルは、通常、病理学的およびエージングの状態であらゆる膵内分泌細胞のトランスクリプトームを解析する拡張できます。
Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の北京大学によって承認されています。 1. 膵臓分離 E17.5 (萌芽期日 17.5) 胚。 日 0.5 膣のプラグが表示されたら時間点に基づく推定します。 CO2管理によって妊娠マウスを犠牲に。70% アルコールで腹部の毛皮をスプレーします。 肋骨に性器拡張か…
Representative Results
胎生期、新生児および生後のマウスから切除した膵臓 (図 2 a と2 b)。生後 18 日目より古いマウス消化効果は異なります; 灌流の程度したがって、注射は膵島の分離のための最も重要なステップ (図 2-2Eと表 6)。できるだけコラゲナーゼは、このステップの間に膵臓を埋める?…
Discussion
このプロトコルでは、膵 β 細胞の単一細胞発現プロファイルを勉強するための効果的かつ簡単に使用できる方法を示した。このメソッドは、胎生期、新生児および生後の膵臓から内分泌細胞を分離し、単一細胞トランスクリプトーム解析が実行される可能性があります。
最も重要なステップは、良い状態の単一の β 細胞の分離です。完全に灌流膵臓より後続の消化に対…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ライフ サイエンス コンピューティング プラットフォームを北京清華センター北京 (北京大学) 蛋白質科学のための国民の中心を感謝いたします。この作品は、省科学と中国の技術 (2015CB942800)、国家自然科学基金、中国の (31521004、31471358、および 31522036) と c. 高橋にライフ サイエンス北京清華センターからの資金によって支えられました。
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
References
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Cite This Article
Li, L., Yu, X., Zhang, Y., Feng, Y., Qiu, W., Xu, C. Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells. J. Vis. Exp. (139), e58000, doi:10.3791/58000 (2018).