Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר
Summary
אנו מתארים שיטה בידודו של תאים האנדוקרינית הלבלב עובריים, neonatal ופוסט ואחריו רצפי RNA בתא יחיד. שיטה זו מאפשרת ניתוח של השושלת האנדוקרינית הלבלב פיתוח, תא dynamics הטרוגניות, transcriptomic.
Abstract
תאים האנדוקרינית הלבלב, אשר מקובצים ב איונים, לווסת את חילוף החומרים האנרגיה והיציבות של גלוקוז בדם. סוגי תאים נפרדים באיונים, כולל הורמון האינסולין תאי β, נבדלים אבות האנדוקרינית נפוצה בשלב העוברי. תאים אנדוקריני ילדותי להרחיב באמצעות התפשטות תאים ולומדים במהלך תקופה ארוכה כמחנכת התפתחותית. עם זאת, המנגנונים תהליכים אלה אינם מוגדרים בבירור. תא בודד RNA-רצף היא גישה מבטיחה עבור אפיון אוכלוסיות תאים נפרדים מסלולים עקיבה תא שושלת היוחסין בידול. כאן, אנו מתארים שיטה עבור RNA בתא יחיד-הרצף של תאי β בלבלב מבודד מן הלבלב עובריים, neonatal ופוסט.
Introduction
הלבלב הוא איבר חיוני מטבולית אצל יונקים. הלבלב מורכבת האנדוקרינית אקסוקרינית של תאים. תאים האנדוקרינית הלבלב, לרבות מייצרי אינסולין תאי β α תאים מייצרי גלוקגון, אשכול ביחד ב- איי לנגרהנס ולווסת coordinately גלוקוז מערכתית הומאוסטזיס. תפקוד לקוי של התאים האנדוקריניים תוצאות סוכרת, אשר הפך בעיה מרכזית בבריאות הציבור ברחבי העולם.
בתאי האנדוקרינית הלבלב נגזרות Ngn3+ אבות במהלך מופרה1. מאוחר יותר, במהלך תקופת הלידה, התאים האנדוקריניים להתרבות כדי איונים ילדותי טופס. תאים אלה ילדותי להמשיך לפתח ולהפוך בהדרגה איונים בוגרת, אשר הופכים vascularized בעושר לווסת את הגלוקוז בדם הומאוסטזיס מבוגרים2.
למרות זוהתה קבוצה של גורמי תעתיק, המסדירים β תאית התמיינות, מסלול מדויק ההבשלה של תאי β הוא עדיין לא ברור. יתר על כן, תהליך ההבשלה של תאי β גם כרוך ברגולציה של התא-3,הרחבה-מספר-4 הדור של הטרוגניות הסלולר5,6. עם זאת, מנגנוני הרגולציה של תהליכים אלה לא טוב נחקרו.
תא בודד RNA-רצף היא גישה רב-עוצמה פרופיל תא subpopulations, לאתר את התא שושלת היוחסין מסלולים התפתחותית7. מנצל את הטכנולוגיה הזאת, המפתח האירועים המתרחשים במהלך התפתחות הלבלב איון יכול לפענח ברמה תא בודד8. בין הפרוטוקולים רצפי RNA בתא יחיד, חכם-seq2 מאפשר את הדור של cDNA באורך מלא עם רגישות משופרת, דיוק, השימוש של ריאגנטים סטנדרטי-עלות נמוכה יותר9. חכם-seq2 לוקח כ יומיים לבנות ספריית cDNA רצף10.
כאן, אנו מציעים שיטה בידודו של תאי β התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מ הלבלב של העובר כדי העכברים הטרנסגניים למבוגרים Ins1-RFP11, באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS), וניתוחים הביצועים של transcriptomic רמת תא בודד, באמצעות טכנולוגיית Smart-seq2 (איור 1). פרוטוקול זה ניתן להרחיב כדי לנתח את transcriptomes מכל הסוגים התא האנדוקרינית הלבלב במצבים נורמליים, פתולוגי, הזדקנות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב פרוטוקול זה, הפגנו שיטה יעילה, קלה לשימוש עבור הלומדים את פרופילי ביטוי תא בודד של תאי β בלבלב. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבודד תאים האנדוקרינית הלבלב עובריים, neonatal ופוסט, כדי לבצע ניתוח transcriptomic תא בודד.
השלב הקריטי ביותר הוא בידודו של תאי β יחיד במצב טוב. הלבלב באופן מלא perfused…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים המרכז הלאומי על חלבון מדעי, בייג’ינג (אוניברסיטת פקינג) ואל מרכז פקין-צינג עבור פלטפורמת מחשוב מדעי החיים. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע, טכנולוגיה של סין (2015CB942800) את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31521004, 31471358 ו 31522036), מימון ממרכז פקין-צינג עבור מדעי החיים ג-R.X.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
References
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
- Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
- Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- . FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
- Hadley, W. . ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).
- . gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016)
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).
