تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس
Summary
يصف لنا طريقة لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة، تليها تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة. يسمح هذا الأسلوب بتحليل التنمية النسب الغدد الصماء في البنكرياس، خلية ديناميات عدم التجانس وترانسكريبتوميك.
Abstract
خلايا الغدد الصماء البنكرياس، التي تتجمع في الجزر الصغيرة، تنظيم استقرار الجلوكوز في الدم والايض الطاقة. تختلف أنواع الخلايا متميزة في الجزر الصغيرة، بما في ذلك إفراز الأنسولين خلايا بيتا، من أجداد الغدد الصماء شيوعاً أثناء المرحلة الجنينية. توسيع عن طريق انتشار الخلايا غير ناضجة من خلايا الغدد الصماء وتنضج خلال فترة إنمائية طويلة بعد الولادة. ومع ذلك، أن الآليات الكامنة وراء هذه العمليات غير محددة بوضوح. خلية واحدة-تسلسل الحمض النووي الريبي نهجاً واعداً لتوصيف السكان خلية متميزة وتتبع الخلية النسب تمايز المسارات. هنا، يمكننا وصف أسلوب للجيش الملكي النيبالي-تسلسل خلية واحدة من الخلايا β البنكرياس معزولة في البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة.
Introduction
البنكرياس جهاز الأيض حيوي في الثدييات. يتكون البنكرياس من المقصورات، وافرازات الغدد الصماء. خلايا الغدد الصماء البنكرياس، بما في ذلك خلايا بيتا المنتجة للأنسولين وإنتاج الجلوكاجون خلايا α، المجموعة معا في جزر لانجرهانز وكورديناتيلي تنظيم التوازن الجلوكوز الجهازية. ويؤدي الخلل في خلايا الغدد الصماء مرض البول السكري، الذي أصبح مشكلة صحية عامة رئيسية في جميع أنحاء العالم.
يتم اشتقاق خلايا الغدد الصماء في البنكرياس من Ngn3+ فروعه خلال embryogenesis1. في وقت لاحق، خلال فترة ما حول الولادة، تتكاثر خلايا الغدد الصماء بشكل غير ناضجة الجزر الصغيرة. هذه الخلايا غير ناضجة مواصلة تطوير وتدريجيا تصبح جزيرات الناضجة، التي تصبح الغني vascularized لتنظيم التوازن الجلوكوز في الدم في البالغين2.
على الرغم من أن قد حددت مجموعة من العوامل النسخي التي تنظم تمايز الخلايا β، مسار نضج الدقيق لخلايا بيتا لا يزال غير واضح. وعلاوة على ذلك، عملية نضج خلية بيتا ينطوي أيضا على تنظيم توسيع الخلية رقم3،4 وتوليد التغايرية الخلوية5،6. ومع ذلك، لم تدرس جيدا الآليات التنظيمية لهذه العمليات.
خلية واحدة-تسلسل الحمض النووي الريبي هو نهج قوية يمكن الشخصية الفئات السكانية الفرعية الخلية وتتبع الخلية النسب المسارات الإنمائية7. الاستفادة من هذه التكنولوجيا، مفتاح يمكن فك شفرتها الأحداث التي تحدث أثناء تطوير جزيرة البنكرياس في خلية واحدة مستوى8. بين البروتوكولات تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة، يسمح الذكية-seq2 جيل كامل طول كدنا مع تحسين حساسية ودقة، واستخدام الكواشف القياسية في انخفاض تكلفة9. ذكية-seq2 يستغرق يومين تقريبا لبناء مكتبة كدنا للتسلسل10.
هنا، نحن نقترح أسلوب لعزل الخلايا β المسمى الأسفار من البنكرياس للجنين للكبار Ins1-RFP الفئران المعدلة وراثيا11، استخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، ويحلل أداء ترانسكريبتوميك في مستوى خلية واحدة، باستخدام التكنولوجيا الذكية-seq2 (الشكل 1). ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتحليل ترانسكريبتوميس لجميع أنواع خلايا الغدد الصماء في البنكرياس في الدول العادية والمرضية والشيخوخة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي هذا البروتوكول، أثبتنا طريقة فعالة وسهلة الاستخدام لدراسة ملامح التعبير خلية واحدة من الخلايا β البنكرياس. يمكن استخدام هذا الأسلوب لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة والقيام بالتحاليل ترانسكريبتوميك خلية واحدة.
أن الخطو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر المركز الوطني للعلوم البروتين وبكين (جامعة بكين) ومركز بكين تسينغهوا “منصة الحوسبة علوم الحياة”. هذا العمل كان تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (2015CB942800) والوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (31521004 و 31471358 و 31522036)، وتمويل من مركز بكين تسينغهوا لعلوم الحياة إلى جيم-R.X.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
References
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
- Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
- Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- . FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
- Hadley, W. . ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).
- . gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016)
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).
