Le but de cet article est de présenter une méthode qui permet une reconstruction en 3 dimensions de l’arbre vasculaire cérébrale chez la souris après que micro calculé tomographie et détermination des volumes de segments de tout navire qui peuvent être utilisés pour quantifier le vasospasme cérébral dans modèles murins de l’hémorragie sous-arachnoïdienne.
Hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) est un sous-type d’AVC hémorragique. Vasospasme cérébral qui survient à la suite de l’hémorragie est un important facteur déterminant des résultats pour les patients et est donc souvent pris comme un paramètre de l’étude. Toutefois, dans les études animales petites sur SAH, quantification du vasospasme cérébral est un défi majeur. Ici, ex vivo présente une méthode qui permet la quantification des volumes des segments vasculaires ensemble, ce qui peuvent être utilisés comme une mesure objective pour quantifier le vasospasme cérébral. Dans un premier temps, coulée endovasculaire de la vascularisation cérébrale est effectuée à l’aide d’un agent de casting radio-opaque. Ensuite, les données d’imagerie transversales sont acquises par micro tomographie. L’étape finale consiste à reconstruire 3 dimensions de l’arbre vasculaire virtuel, suivie d’un algorithme pour calculer les lignes et les volumes des segments vaisseau sélectionné. La méthode a abouti à une reconstruction virtuelle très précise de l’arbre vasculaire cérébrale montré une comparaison axée sur le diamètre des tissus anatomiques avec leurs reconstructions virtuelles. Par rapport aux diamètres de navire seuls, les volumes de navire en évidence les différences entre les navires vasospastique et non-vasospastique montrés dans une série de SAH et souris opérés.
Anévrismale hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA), un sous-type d’un AVC hémorragique, est une maladie courante dans les unités de soins neurointensive. En plus des lésions cérébrales précoces (EBI), qui comprend les dommages cérébraux causés par l’événement saignement lui-même, un autre important facteur déterminant des résultats pour les patients est l’ischémie cérébrale retardée (DCI), définie par la clinique détérioration par atteinte cérébrale perfusion ou infarctus cérébral associé non interventionnelle ou chirurgicales1,2,3. Des mécanismes importants qui contribuent à la DCI sont angiospasmes des gros vaisseaux cérébraux d’une part ; en revanche, la dysfonction microcirculatoire avec vasospasme des microvaisseaux microthrombose et ischémie associés à des dépressions propagation corticales jouent un rôle (examiné par Macdonald 20141). Par conséquent, diagnostic de spasme des vaisseaux cérébraux grands est crucial dans la pratique clinique et affiche un point de terminaison important dans de nombreuses études cliniques et expérimentales.
Malgré le fait que les caractéristiques du vasospasme dans les modèles murins de SAH ne sont pas directement transférable aux modèles homme patients, murins de SAH vasospasme connexe ont été d’une importance croissante ces dernières années. Dans ces modèles SAH est induite par endovasculaire filament perforation4,5,6,7,8, transection de saccules bateaux9ou l’injection de sang dans le CSF10 ,11,12. Contrairement aux grands modèles animaux de SAH, qui ont été traditionnellement conçus pour étudier le vasospasme13, modèles murins ont le grand avantage qu’il existe de nombreuses souches de souris transgéniques. Cela fait d’eux un excellent outil pour l’étude des mécanismes moléculaires conduisant à un spasme vasculaire et DCI. Toutefois, la détermination du vasospasme cérébral chez la souris est difficile. C’est parce que contrairement aux grands modèles animaux dans lequel vasospasme peut être examiné à l’aide de techniques d’imagerie cliniques, in vivo de l’imagerie pour analyser un vasospasme cérébral chez la souris n’est pas encore disponible. Par conséquent, vasospasme est déterminée couramment à l’aide de deux coupes histologiques10,11 ou au microscope après coulée des vaisseaux cérébraux7,9,12. Toutefois, ces techniques ont l’inconvénient ce navire diamètres sont examinées à des moments définis uniquement.
Selon une précédente étude7, ce manuscrit présente une méthode d’analyse objective et reproductible du vasospasme dans un modèle murin de la SAH. La méthode se base sur la perfusion et le moulage des vaisseaux cérébraux, ex vivo micro-TDM, reconstruction numérique de l’arbre de navire et ultérieures évaluation des volumes des vaisseaux cérébraux ensemble.
Les modèles murins de SAH constituent un outil important pour la recherche fondamentale de SAH. Vasospasme cérébral est fréquemment utilisé comme un point de terminaison dans des études expérimentales étudie les mécanismes conduisant à la DCI après SAH9,11. Cependant, la quantification du vasospasme cérébral chez la souris ou autres petits modèles animaux du SAH sont difficiles. Communément, vasospasme est quantifiée par ex vivo détermination des diamètres de navire aux points anatomiques définis après perfusion endovasculaires et coulée7,9,12 ou par détermination de la circonférence des navires définis sur histologique des sections10,11. Cependant, ces méthodes présentent certains inconvénients : vasospasme est évaluée uniquement à des points anatomiques définis ; vasospasme des voisins des segments vasculaires peut s’échapper d’évaluation. Artefacts histologiques présentent une autre source d’erreurs. En outre, l’évaluation peut être plutôt subjective, parce que la position exacte où le diamètre des vaisseaux est mesuré est déterminée par l’enquêteur.
L’objectif était donc de mettre en place une méthode qui quantifie le vasospasme cérébral en calculant le volume de navire de segments de tout vaisseau cérébral provenant de données d’imagerie transversales7. Le principal avantage de la méthode volumétrique présentée ici est que tout navire segments peuvent être examinés. Ceci évite la nécessité de la définition d’un point où le diamètre des vaisseaux est mesuré. Un autre avantage de l’évaluation des segments de la totalité du bateau, c’est qu’il présente sans doute un paramètre plus objectif afin de quantifier l’angiospasme que la détermination des diamètres de navire à des moments définis où peut échapper à un spasme vasculaire du navire plus proximal ou distal Evaluation. Représentation numérique des diamètres de navire à l’aide d’un code couleur permet d’estimer le degré de vasospasme intuitive. En outre, évaluation volumétrique entraîne des différences plus grandes entre les navires vasospastique par rapport à l’évaluation des diamètres de navire comme le montre les résultats représentatifs. La reconstitution virtuelle obtenue avec la méthode présentée ici reflète l’anatomie vasculaire de façon précise. Ceci est démontré par l’évaluation de la série représentative, de bâtiment, diamètres mesurées au microscope et des reconstitutions numériques ont été similaires, reproduisant les observations d’une précédente étude7. Cependant, malgré ses avantages, autres études sont nécessaires pour évaluer si la méthode présentée ici est supérieure aux méthodes classiques d’analyse de vasospasme.
Une limitation de la méthode présentée ici est qu’il accorde plus de temps par rapport à l’analyse microscopique des échantillons de cerveau coulé ou de faire une analyse histologique (micro tomodensitométrie fois 90 minutes par échantillon de cerveau, traitement des données 45 min par échantillon de cerveau). En outre, la disponibilité des tomodensitomètres micro peut limiter son application. Le nombre d’animaux examinés ici ne suffisait pas à démontrer la faisabilité du protocole décrit dans ce manuscrit. Toutefois, si le protocole doit être utilisé dans les études sur les traitements, animal nombre devra être calculé basé sur les effets attendus sur les volumes de navire et diamètres. Une autre limitation de ceci et d’autres études utilisant des modèles murins de SAH est que ce vasospasme est déterminée ex vivo. Ce qui rend impossible les études longitudinales qui examinent les valeurs de base avant l’induction de la SAH et vasospasme à différents moments. Bien que des études ont démontré qu’il est possible de décrire l’anatomie des gros vaisseaux intracrâniens de souris in vivo à l’aide de la tomographie par résonance magnétique18, tomodensitométrie angiographie19ou soustraction numérique l’angiographie20, ces méthodes, à notre connaissance, n’ont pas encore été utilisés pour analyser le vasospasme cérébral en murine SAH modèles in vivo. À noter, la reconstruction numérique du système vasculaire cérébral avec évaluation volumétrique ultérieure du vasospasme cérébral présentée ici n’est pas limitée à l’usage sur des données ex vivo micro CT. Si l’imagerie vasculaire cérébrale sectionnelle croix haute résolution chez les souris devienne disponible à l’avenir, il pourrait être utilisé pour effectuer une analyse volumétrique de vasospasme in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Parties de cette étude font partie de la thèse de doctorat de T. Pantel, présenté à la faculté de médecine de l’Université Johannes Gutenberg de Mayence. L’étude a été financée par la Stiftung libère de Friedhelm et par la Stiftung Neurochirurgische Forschung (subventions aux A.N.).
Medetomidin | Pfizer, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
Midazolam | Ratiopharm, Ulm, Germany | n.a. | |
Fentanyl | Curamed, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
Venofix 21G | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | n.a. | 21G cannula |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4 | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | D8662 | |
4% paraformaldehyde solution | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | 100496 | |
Microfil MV-122 | Flowtech Inc., Carver, MA, USA | n.a. | Radiopaque |
Micro-CT system Y.Fox | Yxlon, Garbsen, Germany | n.a. | |
Reconstruction Studio software version 1.2.8.1 | TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany | n.a. | Reconstruction software |
Amira software version 5.4.2 | FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA | n.a. | Visualization software |
PHD ultra syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3 | Pressure controlled pump |
anatomical forceps (blunt) | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 160323_v | |
Infinity X-21 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | high resolution camera |
DeltaPix Insight software version 2.0.1 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | |
C57BL6 mice | Charles River, Cologne, Germany |