Een volumetrische methode voor de kwantificering van cerebrale Vasospasm in een lymfkliertest Model van subarachnoïdale bloeding
Summary
Het doel van dit artikel is het presenteren van een methode waarmee een 3-dimensionale reconstructie van de cerebrovasculaire boom in muizen nadat micro berekende tomografie en bepaling van de hoeveelheden van hele schip segmenten die kunnen worden gebruikt voor het kwantificeren van cerebrale vasospasm in lymfkliertest modellen van subarachnoïdale bloeding.
Abstract
Subarachnoïdale bloeding (SAH) een subtype is van hemorragische beroerte. Cerebrale vasospasm die in de nasleep van het bloeden optreedt is een belangrijke factor van patiënt resultaat en wordt daarom vaak beschouwd als een eindpunt van de studie. Echter, in kleine dierlijke studies over SAH, kwantificering van cerebrale vasospasm is een grote uitdaging. Hier wordt een ex vivo methode waarmee kwantificering van hoeveelheden van hele schip segmenten, die kunnen worden gebruikt als een objectieve maatstaf te kwantificeren van cerebrale vasospasm gepresenteerd. In een eerste stap, is endovasculair gieten van de cerebrale therapieën uitgevoerd met behulp van een agent radiopaak gieten. Transversale imaging gegevens worden dan overgenomen door micro computertomografie. De laatste stap omvat 3-dimensionale reconstructie van de virtuele vasculaire boom, gevolgd door een algoritme voor het berekenen van centrum lijnen en volumes van de segmenten van de geselecteerde vaartuig. De methode resulteerde in een zeer nauwkeurige virtuele reconstructie van de cerebrovasculaire boom blijkt uit een vergelijking op basis van de diameter van anatomische monsters met hun virtuele reconstructies. Vergeleken met een vaartuig diameter alleen, verschillen de vaartuig-volumes de tussen vasospastic en niet-vasospastic schepen weergegeven in een reeks SAH en sham bediende muizen.
Introduction
Aneurysmatic subarachnoïdale bloeding (SAH), een subtype van hemorragische beroerte, is een gemeenschappelijk ziekte in eenheden van de zorg van de neurointensive. Naast vroege hersenletsel (EBI), die bestaat uit de cerebrale schade veroorzaakt door het bloeden evenement zelf, is een andere belangrijke factor voor patiënten uitkomst vertraagde cerebrale ischemie (DCI), gedefinieerd door klinische verslechtering door verminderde cerebrale perfusie of cerebrale infarct niet geassocieerd met Interventionele of chirurgische procedures1,2,3. Belangrijke mechanismen bij te dragen aan DCI zijn vasospasms van de grote cerebrale schepen aan de ene kant; aan de andere kant, microcirculatory dysfunctie met vasospasm van microvessels en microthrombosis en ischemie aan corticale verspreiden depressies gerelateerde spelen een rol (herzien in Madonald 2014-1). Daarom, diagnose van vasospasm van de grote cerebrale vaartuigen is van cruciaal belang in de klinische praktijk en geeft een belangrijke eindpunt in veel klinische en experimentele studies.
Ondanks het feit dat de functies van de vasospasm in lymfkliertest SAH modellen zijn niet rechtstreeks overgezet naar de menselijke patiënten, lymfkliertest modellen van SAH verwante vasospasm geweest van het kweken van betekenis in de laatste jaren. In deze modellen wordt SAH geïnduceerd door endovasculair gloeidraad perforatie4,5,6,7,8, transect van cisternal schepen9, of injectie van bloed in het CB10 ,11,12. In tegenstelling tot grote diermodellen van SAH die traditioneel werden ontworpen om te bestuderen van de vasospasm13, hebben lymfkliertest modellen het grote voordeel dat talrijke transgene muizen stammen beschikbaar zijn. Dit maakt hen een uitstekend hulpmiddel voor de studie van moleculaire mechanismen die leiden tot vasospasm en DCI. Echter is de bepaling van de cerebrale vasospasm in muizen uitdagend. Dit is omdat in tegenstelling tot grote dierlijke modellen waarin vasospasm kan worden onderzocht met klinische beeldvormingstechnieken, in vivo imaging om cerebrale vasospasm bij muizen te analyseren nog niet beschikbaar is. Vasospasm wordt daarom vaak bepaald met behulp van hetzij histologische secties10,11 of microscopisch na gieten van cerebrale vaartuigen7,9,12. Echter, deze technieken hebben het nadeel dat vaartuig diameters zijn onderzocht op bepaalde punten alleen.
Op basis van een eerdere studie7, presenteert dit manuscript een methode voor objectieve en reproduceerbare analyse van vasospasm in een lymfkliertest SAH-model. De methode is gebaseerd op de perfusie en gieten van de cerebrale vaartuigen, ex vivo micro-CT scan, digital wederopbouw van de boom van het vaartuig, en latere evaluatie van volumes van hele cerebrale vaartuigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lymfkliertest SAH modellen zijn een belangrijk instrument voor SAH basisonderzoek. Cerebrale vasospasm wordt vaak gebruikt als een eindpunt in experimentele studies, onderzoek naar de mechanismen die leiden tot DCI na SAH9,11. Kwantificering van cerebrale vasospasm in muizen of andere kleine dierlijke modellen van SAH is echter een uitdaging. Algemeen, wordt vasospasm gekwantificeerd door ex vivo bepaling van schip diameters op bepaalde anatomische punten na endovasculair perfusie en gieten7,9,12 of door bepaling van de omtrek paragraaf10,11van gedefinieerde vaartuigen op histologische. Deze methoden hebben echter enkele nadelen: Vasospasm wordt geëvalueerd alleen op bepaalde anatomische punten; vasospasm van naburige segmenten van het vaartuig kan ontsnappen evaluatie. Histologische artefacten presenteren een andere bron van fouten. Bovendien kunnen de evaluatie zijn nogal subjectief, want de exacte positie waar de diameter van het vaartuig wordt gemeten wordt bepaald door de onderzoeker.
Het doel was daarom een methode die cerebrale vasospasm kwantificeert door het berekenen van het volume van de vaartuig van hele cerebrale vaartuig segmenten van transversale imaging gegevens7vast te stellen. Het belangrijkste voordeel van de volumetrische methode hier gepresenteerd is dat hele vaartuig segmenten kunnen worden onderzocht. Dit voorkomt de noodzaak van de definitie van een punt waar de diameter van het vaartuig wordt gemeten. Een bijkomend voordeel van de evaluatie van het hele schip segmenten is dat het vermoedelijk presenteert een meer objectieve parameter om te kwantificeren vasospasm dan bepaling van schip diameters op bepaalde punten waar de vasospasm van het schip meer proximaal of DISTAAL kan ontsnappen evaluatie. Digitale weergave van schip diameters met behulp van een kleurcode staat een intuïtieve schatting van de mate van vasospasm. Bovendien, volumetrische evaluatie leidt tot grotere verschillen tussen vasospastic schepen in vergelijking met de evaluatie van het vaartuig diameters zoals aangegeven in de representatieve resultaten. De virtuele wederopbouw bereikt met de methode die hier gepresenteerd weerspiegelt de vasculaire anatomie nauwkeurig. Dit blijkt uit de evaluatie van de representatieve serie, in welke vat diameters microscopisch gemeten en van de digitale reconstructies waren vergelijkbaar, de opmerkingen van een eerdere studie7te reproduceren. Echter ondanks zijn voordelen, zijn verdere studies nodig om te evalueren of de methode die hier gepresenteerd is superieur aan conventionele methoden voor vasospasm analyse of niet.
Een beperking van de methode die hier gepresenteerd is dat het biedt meer tijd in vergelijking met microscopische analyse van gegoten hersenen monsters of histologische analyse (micro CT scannen tijd 90 minuten per hersenen monster, gegevensverwerking 45 min per monster van de hersenen). Bovendien kan de beschikbaarheid van micro CT-scanners beperken de toepassing ervan. Het aantal dieren die onderzocht worden hier was voldoende om aan te tonen van de haalbaarheid van het protocol wordt beschreven in dit manuscript. Echter als het protocol moet worden gebruikt in de behandeling studies, dier nummers zou moeten worden berekend op basis van de verwachte gevolgen voor vaartuig volumes en diameters. Een andere beperking van deze en andere studies met lymfkliertest SAH modellen is dat vasospasm is vastbesloten ex vivo. Hierdoor niet onmogelijk longitudinale studies die basislijnwaarden voordat SAH inductie en vasospasm op verschillende tijdstippen onderzoeken. Hoewel studies hebben aangetoond dat het is mogelijk om de beelden van de anatomie van de grote intracraniële schepen van muizen in vivo met behulp van magnetische resonantie tomografie18, computertomografie angiografie19of Digitale Subtractie angiografie20, deze methoden, om onze kennis, is nog niet gebruikt voor het analyseren van cerebrale vasospasm in lymfkliertest SAH modellen in vivo. Van de nota is de digitale wederopbouw van de cerebrale therapieën met latere volumetrische evaluatie van cerebrale vasospasm hier gepresenteerd niet beperkt tot het gebruik op ex vivo CT microgegevens. Als hoge resolutie vasculaire cross-sectionele hersenen beeldvorming in muizen in de toekomst beschikbaar komen moet, kan het worden gebruikt voor het uitvoeren van een volumetric analyse van vasospasm in vivo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Delen van deze studie zijn onderdeel van het proefschrift van T. Pantel, voorgelegd aan de medische faculteit van de Johannes Gutenberg-Universiteit Mainz. De studie werd ondersteund door de Stiftung Friedhelm bevrijdt en de Stiftung Neurochirurgische Forschung (subsidies voor A.N.).
Materials
| Medetomidin | Pfizer, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Midazolam | Ratiopharm, Ulm, Germany | n.a. | |
| Fentanyl | Curamed, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Venofix 21G | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | n.a. | 21G cannula |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4 | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | D8662 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | 100496 | |
| Microfil MV-122 | Flowtech Inc., Carver, MA, USA | n.a. | Radiopaque |
| Micro-CT system Y.Fox | Yxlon, Garbsen, Germany | n.a. | |
| Reconstruction Studio software version 1.2.8.1 | TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany | n.a. | Reconstruction software |
| Amira software version 5.4.2 | FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA | n.a. | Visualization software |
| PHD ultra syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3 | Pressure controlled pump |
| anatomical forceps (blunt) | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 160323_v | |
| Infinity X-21 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | high resolution camera |
| DeltaPix Insight software version 2.0.1 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | |
| C57BL6 mice | Charles River, Cologne, Germany |
References
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Dorsch, N. A clinical review of cerebral vasospasm and delayed ischaemia following aneurysm rupture. Acta Neurochirurgica Supplement. 110 (Pt 1), 5-6 (2011).
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: Proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Friedrich, B., et al. CO2 has no therapeutic effect on early microvasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), e1-e6 (2014).
- Friedrich, B., Muller, F., Feiler, S., Scholler, K., Plesnila, N. Experimental subarachnoid hemorrhage causes early and long-lasting microarterial constriction and microthrombosis: An in vivo microscopy study. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (3), 447-455 (2012).
- Terpolilli, N. A., et al. Nitric oxide inhalation reduces brain damage, prevents mortality, and improves neurological outcome after subarachnoid hemorrhage by resolving early pial microvasospasms. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (12), 2096-2107 (2016).
- Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), e0172010 (2017).
- Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (81), e50845 (2013).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
- Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
- Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neurocience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
- Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. Journal of Neuroscience Methods. 221, 70-77 (2014).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurological research. 24 (5), 510-516 (2002).
- Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. 105 (e53208), (2015).
- Marjamaa, J., et al. Mice with a deletion in the first intron of the Col1a1 gene develop dissection and rupture of aorta in the absence of aneurysms: High-resolution magnetic resonance imaging, at 4.7 T, of the aorta and cerebral arteries. Magnetic Resonance in Medicine. 55 (3), 592-597 (2006).
- Schambach, S. J., et al. Ultrafast high-resolution in vivo volume-CTA of mice cerebral vessels. Stroke. 40 (4), 1444-1450 (2009).
- Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
