JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Published: August 02, 2018
doi:
10.3791/57996
, , , ,
1Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, School of Graduate Studies,Rutgers University, The State University of New Jersey, 2Graduate Program in Quantitative Biomedicine, School of Graduate Studies,Rutgers University, The State University of New Jersey, 3Department of Medicine, Division of Medical Oncology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4Crump Institute for Molecular Imaging, Department of Molecular and Medical Pharmacology, Jonsson Comprehensive Cancer Center, UCLA Metabolomics Center, and California NanoSystems Institute,David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 5Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science,University of Southern California, 6Pharmacology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 7Cancer Metabolism and Growth Program,Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

Bu iletişim kuralı ayıklamak ve prostat kanseri hücre hatlarından veya doku phosphoproteome ile kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizi için phosphopeptides zenginleştirmek için bir yordam açıklanır.

Abstract

Phosphoproteomics fosforile proteinlerin büyük ölçekli çalışma gerektirir. Protein fosforilasyon birçok sinyal iletim yollarının kritik bir adımdır ve kinaz ve fosfatazlar tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmiştir. Bu nedenle, phosphoproteome karakterize içine yeni hedefler ve biyolojik onkolojik tedavi için tanımlama bilgileri sağlayabilir. Kütle spektrometresi genel olarak algılamak ve benzersiz fosforilasyon olaylar binlerce ölçmek için bir yol sağlar. Ancak, phosphopeptides daha az sigara-daha zor biyokimyasal analiz yapma phosphopeptides, bol miktarda bulunmaktadır. Bu sınırlamayı aşmak için yöntemleri phosphopeptides kütle spektrometresi analiz önce zenginleştirmek için gereklidir. Ayıklamak ve peptidler, bir zenginlik phosphotyrosine (pY) ve antikor tabanlı kullanarak phosphoserine/treonin (pST) peptidler ve/veya titanyum dioksit (TiO2) ardından verim dokusundan proteinleri sindirmek için açıklayınız-dayalı zenginleştirme yöntemi. Numune hazırlama ve kütle spektrometresi sonra biz daha sonra tanımlamak ve ölçmek sıvı kromatografi-kütle spektrometresi ve analiz yazılımı kullanarak phosphopeptides.

Introduction

Bir tahmini 165,000 Yeni olgu ve yaklaşık 29.000 ölümler 2018 en yaygın kanser ve kanser ile ilgili Amerika Birleşik Devletleri1erkeklerde ölüm ikinci önde gelen nedenidir temsil eden prostat kanseri nedeniyle ortaya çıkar. Prostat kanserinin erken aşamalarında on yıllık yineleme oranı % 20 ve % 40 prostatektomi geçmesi hastalar için ve % 30 ve radyasyon alan hastalar için % 50 arasında arasında nerede hastalığı, organ sınırlı rezeksiyon veya radyasyon terapisi ile tedavi edilebilir tedavi2. Prostat kanserinin büyümesi için sinyal androjen kullandığından, cerrahi ve kimyasal hadım terapiler Ayrıca yüksek riskli hastalar için istihdam edilmektedir. Ancak, kanser artık biyokimyasal yineleme kanıtladığı gibi androjen yoksunluk terapiye yanıt verdiğinde nüks nerede serum prostat spesifik antijen tekrar yükselir oluşur. Bu noktada ilerlemesinde Metastazlari genellikle de tespit edilir. Bu ileri evre metastatik kastrasyon dayanıklı prostat kanseri olarak adlandırılan, prognoz medyan sağkalım süresi iki yıl3az nerede hastalığının ölümcül formu temsil eder. Son aşama hastalığı, taxane tabanlı kemoterapi gibi docetaxel yanı sıra enzalutamide ve abiraterone gibi ikinci nesil antiandrogens de dahil olmak üzere birkaç tedavi seçenekleri kullanılabilir. Mevcut tedaviler rağmen sık sık hastalık ilerler. Bu nedenle, keşif ve yeni tedavi yaklaşımları gelişimi gelişmiş hastalığı prostat kanseri hastalarının bakım geliştirmek gereklidir.

Kütle spektrometresi (MS)-tabanlı yaklaşımlar Proteom peptid analitler4binlerce yüzlerce algılanması aracılığıyla küresel bir analizini sağlar. Özellikle, keşif proteomik, olarak da bilinen veri bağımlı edinme (DDA), tanımlama ve Nefelometri peptidler4,5binlerce yol açabilir. MS tabanlı keşif proteomik daha yukarıdan aşağıya proteomik, nerede olduğu gibi proteinler ile karakterize ve aşağıdan yukarıya (olarak da bilinen shotgun) proteomik nerede peptidler proteinler5karakterize etmek için analiz edilir, tarif. Böylece, av tüfeği proteomik proteolizis adım proteinler peptidler ayırmak için MS Analizi önceki örnek hazırlık yer alır. Sonunda, peptidler geri proteinleri tanımlama için eşlemek için bir veritabanı arama gerçekleştirilir. Etiket içermeyen yanı sıra çok sayıda izotop-etiketleme [Örneğin, kararlı izotop amino asit hücre kültürü (SILAC) tarafından etiketleme] yöntemleri kantitatif peptidler örnekleri6,7arasında karşılaştırmak için kullanılabilir. İzotop etiketleme teknikleri altın standart olmakla birlikte, etiket içermeyen yöntemleri benzer miktar doğruluğu8,9 göstermiştir ve duyarlılık ve özgüllük10arasında karşılaştırılabilir bileşimleri var. Etiket içermeyen Nefelometri daha fazla kapsama alanı sağlar ve etiket tabanlı Yöntemler sınırlı maliyet ve çoğullama kapasiteleri6,7,8, ancak çok daha fazla örnekleri, arasındaki karşılaştırmaları izin verir.

Ayrıca, av tüfeği MS translasyonel modifikasyonlar (PTMs) fosforilasyon11gibi sorguya çekmek için de kullanılabilir. Phosphopeptides için toplam peptidler karşılaştırıldığında daha düşük stokiometrik yapısı nedeniyle, çeşitli yöntemler phosphopeptides için antikor tabanlı immunoprecipitation, phosphotyrosine (pY) peptidler, titanyum dioksit (TiO2 de dahil olmak üzere, zenginleştirmek için istihdam edilmektedir ) ve metal benzeşme Kromatografi (IMAC)5,12immobilize. Protein fosforilasyon av tüfeği phosphoproteomics araştırmacılar hücre değişiklikleri farklı kanser meme13, prostat14, böbrek15de dahil olmak üzere, sinyal araştırmak için izin verir yolları, sinyal birçok hücredeki önemli bir adımdır çünkü ve yumurtalık,16,17 kanser biyoloji daha iyi anlamak ve terapi için potansiyel yeni hedefler belirlemek için.

Bu etiket ücretsiz av tüfeği phosphoproteomic Yöntem inşa ve rafine temel alınarak önceki çalışma Graeber grup18,19,20oldu. Bu iletişim kuralı ayıklama ve içine peptidler, proteinler ve phosphoproteins dokusundan sindirim açıklayarak başlar. Biz o zaman detay belirli phosphotyrosine antikorlar ve TiO2kullanarak pY peptidler zenginleştirme. Ayrıca güçlü katyon TiO2tarafından takip exchange (SCX) kullanarak phosphoserine/treonin (pST) peptidler zenginleştirme açıklar. Bu iletişim kuralı örnekleri bir MS tesise sunulması ve MS analiz yazılımı tanımlamak ve phosphopeptides ve onların karşılık gelen phosphoproteins ölçmek için kullanımı ile bitirmek. Bu iletişim kuralının uygulanması prostat kanseri diğer kanserler ve onkoloji dışında alanları içine genişletebilirsiniz.

Protocol

Xenograft tümörler kullanarak deneyler Rutgers Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından küme olarak ileri Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallar altında kabul edildi. 1. protein çıkarma Lizis arabellek (Tablo 1) hazırlayın. (Ses örnekleri hasat edilebilir sayısına bağlıdır.) Vitro hücre örnekleri için 1.2 adım geçin. Tümör doku için 1.3 adım geçin. Hücre hasat 50 mL konik tüp hücrelerde toplamak ve onları vasıl 700 x g 4 ° C’de 5 min için spin Süpernatant atın ve buz üzerinde Pelet koruyun. Bir Pelet hücreleri toplamak tüm yemekler için bu adımı yineleyin. (Genellikle, yaklaşık 5 neredeyse konfluent 15 cm yemekleri hücre 5 mg protein, ancak gerekli bu cep telefonda bağımlı olabilir ve ampirik olarak her araştırmacı tarafından belirlenecektir gerekir.) Pelet soğutulmuş fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ve spin 30 mL ile 700 x g 4 ° C’de 5 min için de PBS aspirating önce yıkayın. Proteinin hücre Pelet kullanılan 5 mg başına lizis arabellek 1,5 mL ekleyin. Damlalıklı birkaç kez yukarı ve aşağı. 1.4. adıma atlayın. Doku hasat Tümör tartmak ve bir kültür test tüpünde buz gibi lizis arabelleği için doku her 100 mg 2 mL ekleyin. (Genellikle, 50-150 mg doku ıslak ağırlığının gereklidir.) Lysate bir el veya benchtop homogenizer kullanarak homojenize (2 x 15 için nabız s.) Homogenizer önce ilk örnek ve art arda % 10 çamaşır suyu, % 70 etanol ve deiyonize su kullanarak örnekleri arasında temiz. Azaltmak ve alkylate için homojenize örnekleri 5 min için 95 ° c ısı. O zaman onları buz 15dk için serin. Lysate 3 x buza, solüsyon içeren temizleyicide (yani, nabız 30 s 60 s duraklar arasında darbeleri ile). Örnek bu noktada viskoz ya da biçimsiz olmamalıdır. Lysate 5 dk2195 ° c ısı. Lysate içinde aynı sonication için 15 dk. 15 ° C de 3.500 x g, bir salıncak kova rotor kullanarak tüp santrifüj süpernatant toplamak ve Pelet atın. Bir Bradford tahlil22gerçekleştirerek protein konsantrasyonu belirlemek. Gerekirse, lysate 5 mg/ml lizis arabelleği ile oranında seyreltin. -20 ° C’de depolayınNot: Deneme burada duraklatılmış. Örnekleri-80 ° C’de dondurmak ve daha sonraki bir tarihte devam edin. 2. lysate sindirim Örnek 12-fold seyreltik 100 mM Tris kullanarak (pH 8,5 =) guanidinium azaltmak için. Tüm örnekleri eşit olmayan sindirim etkilerini en aza indirmek için aynı birime sulandırmak. 12.5 µg, sindirilmemiş bir jel Coomassie lekeli23tarihinde onaylamak için lysate kaydedin. 5 mg protein, Lysyl Endopeptidase (Lys-C) 10 µg ekleyin ve 5-6 h. ayarlama pH 8,0 tarafından için oda sıcaklığında kuluçkaya 1 M ekleme Tris (pH ~ 11) untitrated. 1 mg/mL L-1-tosylamido-2-Feniletil chloromethyl keton (TPCK) hazırlamak-1 mm HCl (ile 20 mM CaCl2) tripsin tedavi. Tripsin 1: 100 tripsin: protein oranı ekleyin ve 3 h için 37 ° C’de kuluçkaya. Adım 2.3 olduğu gibi taze tripsin aynı miktarda ekleyin. 37 ° C’de gecede kuluçkaya. 12.5 µg sindirilir, jel Coomassie lekeli23tam sindirim onaylamak için lysate kaydedin. 3. aşama ayıklama ters Lysate ses kaydı. Örnek 15 mL 10 kDa kesme filtre kullanarak filtre. Retentate birim daha az 250 µL (Bu yaklaşık 45-60 dakika sürer) kadar örneği salıncak kova rotor kullanarak g (ya da bir sabit açılı rotor 3.500 x g) x 3500 ‘ 15 ° C’de santrifüj kapasitesi. Akışı aracılığıyla toplamak ve retentate atın.Not: Deneme burada duraklatılmış. Örnekleri-80 ° C’de dondurmak ve daha sonraki bir tarihte devam edin. Örnek acidify için yaklaşık 20 µL % 5 trifluoroacetic asit (TFA) lysate mL başına ekleyin. Onları iyice karıştırın ve örnek pH pH şeritler kullanarak ölçün. PH %2.5 5 kullanarak ayarlamak TFA. Daha kısa bir C-18 sütun için bir vakum manifold ucunu. Vakum 17 ve 34 kPa arasında (veya üreticinin yönergelerine göre) ayarlayın. Cam pipetler kullanarak, sütun % 100 Asetonitril (ACN) 3 mL ile ıslak. Kuru sütun izin vermeyin. Pipetler, cam kullanarak sütun 6 mL TFA 2 x 3 mL uygulanan % 0.1 ile equilibrate. Acidified örnek sütuna yerleştirin. 3 mL den fazla teker teker eklemek değil. Saniyede yaklaşık 1-2 damla hedeflemek için vakum ayarlayın. Pipetler, cam kullanarak sütun 9 mL TFA 3 x 3 mL uygulanan % 0.1 ile yıkayın. Sütun 2 mL % 40 ile elute ACN, % 0,1 TFA. İki 2 mL kesirler cam kültür tüpler içine toplamak. Sütun Sil. Parafilm ile eluate tüplerin kapak ve 3-5 delikler 20 G iğne kullanarak kapak. Tamamen katı kadar en az 30 dk için kuru buzda eluate dondur. Kesirler gecede lyophilize. Ertesi gün, örnekleri lyophilizer durdurmadan önce tamamen kuru olduğundan emin olun. Tüpler 50 mL konik tüp ile hassas mendil-80 ° C’de depolayınNot: Deneme burada duraklatılmış. 4. Immunoprecipitation ve pY peptidler24 zenginleştirme Lyophilized tozu ile buz gibi immunoprecipitation (IP) bağlama arabellek 0.5 mL her kesir resuspend. 0.5 mL resuspension cilt ikinci kesir için ilk kesir aktararak kesirler havuz ve Pipet Ucu kaydedin. Şiddetle girdap (yukarı ve aşağı pipetting) yerine örnek tamamen 3.6 mL vidalı kapak cryotube aktarmadan önce çözülmüş emin olmak için. Adım 4.1 olduğu gibi., IP bağlama arabellek (Tablo 1) başka bir 0.5 mL lyophilization tüplerini her tüpte durulayın. Çözüm herhangi bir örnek kaybı en aza indirmek için aynı pipet ucu kullanarak 3.6 mL vidalı kapak tüp aktarın. Son resuspension birimi (5 mg protein için) 2 mL yapma durulama 1 x daha, tekrar. Yaklaşık 7,4 olduğundan emin olmak için örnek pH ölçmek. Çok asittir, yinelemeli olarak 1 M Tris (untitrated, pH ~ 11) 10 µL ekleyin. Çok temel yoksa yinelemeli olarak 10 µL seyreltik HCL (1:25 veya 1: 100) ekleyin. PY boncuk (için lysate başlayan 5 mg) ön yıkama 4 g 10 antikor 25 µg ve 27B10.4 antikor 12.5 µg örnek ihtiyaç vardır. Bir p200 kullandıktan sonra antikorlar ayrı microcentrifuge tüpler içine aktarmak, antikorlar 450 µL buz gibi IP bağlama arabellek ile yıkayın kesilmiş bir ipucu ile 2 x pipet. Onları vasıl 100 x g 1 dk 4 ° C ve aspiratı süpernatant dışarı için santrifüj kapasitesi. Boncuk 0,5 mg/mL IP bağlama arabellek kullanarak hisse senedi bir konsantrasyon için resuspend. (Değil girdap boncuk yapmak.) Bir tek tüp içine aliquoting gerekli Bulamaç (4 g 10 antikor bulamaç ve 25 µL 27B10.4 antikor Bulamaç örnek başına 50 µL) sonra hisse senedi santrifüj tüpleri 200 x g 4 ° C’de 1 dk. için de aşağı spin Yanağında süpernatant ile buzdolabında boncuk dönmeden önce yıkayın. Önceden yıkanmış pY boncuk vidalı kapak cryotubes resuspended örnek çözümde ekleyin. Onları bir bitti sıra rotator üzerinde 4 ° C’de gecede kuluçkaya. Vidalı kapak cryotubes hassas bir mendil ile kaplı bir 50 mL santrifüj tüpü yerleştirin. Spin aşağı 100 x g 1 dk. için pST peptidler zenginleştirmek için kullanılacak süpernatant, Kaydet, boncuk. (PST için zenginleştirme 7 adımda başlar ve pY peptid işleme paralel olarak gerçekleştirilen). Boncuk 300 µL IP bağlama arabellek ile resuspend. Onları 2 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve onları 4 ° C’de 1 dk. için 100 x g de spin aşağı Durulama kuluçka 3 x 200 µL IP bağlama arabellek ile tüp. İçeriği her zaman aynı Microcentrifuge tüp aktarın. Sonra onları aşağı spin. Microcentrifuge boncuk 3 x 500 µL IP bağlama arabellek ile tüp ve onları vasıl 100 x g 1 dk. için spin aşağı yıkama. Sonra yıkayın boncuk 4 x 25 mM NH4HCO3, pH 7.5 ve onları aşağı 100 x g 1 en az kullanmak taze 25 mM NH4HCO3 çözüm için de her zaman toz spin 450 µL ile. Boncuk 1.500 x g 1 dk. kullanım, santrifüj kapasitesi süpernatant tamamen kaldırmak jel-yükleme ucunu biraz boncuk yüzeyinin altında ucu daldırma için jel-yükleme bahşiş. 4 x % 0.1 boncuk cilt ekleyin TFA boncuklar için (yani, % 0.1 300 µL eklemek TFA pY boncuk Bulamaç 75 µg için). Onları iyice karıştırın ve bir thermomixer 37 ° C’de 15 dakika 1000 devirde karışımı kuluçkaya Resuspension 0.2 µm spin filtrenin aktarın. Hızlı bir şekilde aşağı elüsyon tüp spin ve rezidüel hacim P10 damlalıklı kullanarak aynı spin filtresini aktarın. Spin aşağı vasıl 850 x g spin filtre 1 dk. düşük protein bağlayıcı microcentrifuge tüp elüsyon aktarın. Eluate kuruluk için vakum konsantre gecede 40 ° C’de ve 300 dk bir ısı zaman ile.Not: Deneme burada duraklatılmış. Örnekleri-80 ° C’de dondurmak ve daha sonraki bir tarihte devam edin. 5. titanyum dioksit zenginleştirme25 pY peptidler / Kurutulmuş 200 µL % 50 phosphopeptides aşağı resuspend ACN, % 0,1 TFA. Girdap ve onları onları iyi resuspend için bu 1 x 30 s. tekrarlamak için 10.000 x g santrifüj kapasitesi. 200 µL örnekleri için bir kapasitesi var ipuçları içerdiği TiO2 boncuk hazırlanıyor. Bu amaçla malzeme taşımak için belgili tanımlık uç küçük ipucu tarafında hafifçe dokunun. 0 200 µL ekleyerek ucu durulayın ardından ucu ters çevirme ve doğru kap sıvı taşımak için küçük ucunu flicking ACN,. Bir tıraş bıçağı kullanarak ucu küçük ucunu keser ve bir düşük protein bağlayıcı tüpyerleştirir. (TiO2 tüp taraf için sopa olacak gibi polistren tüpler kullanmayınız.) Kapağını çıkarın ve kalan ACN atılmak için bir micropipette ekleyin. Yıkama 200 µL % 100 ile tekrar ACN. TiO2 boncuk şimdi aşağıdaki adımları için düşük protein bağlayıcı tüp bulunmaktadır. Yaygõn ile 0 ACN 2 500 µL TiO2 x. Damlalıklı boncuk solvent ile karıştırmak için. Onları vasıl 100 x g 1 dk santrifüj kapasitesi. Koşul TiO2 500 µL 0.2 M sodyum fosfat tampon (pH ~ 7) ile 2 x. Yıkama ile denge 300 µL boncuk tampon 3 x. TiO2 çok yoğun olduğu için boncuk hızlı bir şekilde halledecek. % 50 400 µL eklemek ACN, % 0,1 TFA düşük protein bağlayıcı tüp içine takip laktik asit ekleyerek 84 µL tarafından. Resuspended phosphopeptides düşük protein bağlayıcı tüp içine aktarın ve onlara bir bitti sıra rotator kullanarak oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Onları cips için 1 dakika için 100 x g de boncuk santrifüj kapasitesi. Onları denge arabellek (Tablo 1) 2 300 µL ile yıkamak x ve onları vasıl 100 x g 1 dk. için spin aşağı. Boncuk 300 ile durulayın durulama µL tampon 2 x. Onları 0.2 µm spin filtrenin aktarın. Onları 1.500 x g 1 dk. için de spin. Filtre birim temiz 1.5 mL düşük protein bağlayıcı tüp aktarın. Elute içeriği 2 x 200 µL % 0,9 NH3 H2O. Ölçü 10 ve 11 arasında olmalıdır pH şeritler ile pH ile. Vakum eluate kuruluk gecede amonyak buharlaşır için konsantre ol. 6. pY peptidler MS Analyses desalting Phosphopeptides 15 µL % 0.1 ile sulandırmak TFA vortexing ve onları 10.000 x g 30 için de centrifuging onları resuspend s. Onları iyi resuspend için bu 1 x tekrarlayın. Yukarı ve aşağı pipet değil. C-18 bahşiş 5 µg bağlama kapasitesi’kullanarak örnek temiz ve üreticinin iletişim kuralı izleyin. Tamamen elüsyon birim vakum konsantrasyon tarafından kuru. Bu 1-2 h. alır kurutulmuş phosphopeptides kütle spektrometresi çözüm 12.5 µL içinde Resuspend (bkz. Tablo 1) (veya araştırmacı MS tarafından önerilen olarak tesis proteomik çekirdek). Girdap ve kısaca çözüm de onları resuspend 30 s. tekrarı bu 2 x için 10.000 x g de spin aşağı. Örnekleri sunulmak üzere bir kütle spektrometresi tesisi (adım 11) hazır.Not: Aşağıdaki adımları yalnızca pST peptid zenginleştirme için ilişkilidir. 7. pST peptidler çıkarımı faz ters Peptid konsantrasyonu bir peptid tahlil gerçekleştirerek 4,6 adımından elde süpernatant ölçmek. PST kütle spektrometresi için yeterli miktarda 2.5 mg dır. PH %3.5 5 ile ayarlamak TFA. Daha kısa bir C-18 sütun için bir vakum manifold ucunu. Vakum 17 ve 34 kPa arasında (veya üreticinin yönergelerine göre) ayarlayın. Sütun 3 mL % 100 ile ıslak ACN. Kuru sütun izin vermeyin. Sütun 6 mL TFA 2 x 3 mL uygulanan % 0.1 ile equilibrate. Acidified örnek sütuna yerleştirin. 3 mL den fazla teker teker eklemek değil. Saniyede yaklaşık 1-2 damla hedeflemek için vakum ayarlayın. Sütun 9 mL TFA 3 x 3 mL uygulanan % 0.1 ile yıkayın. Sütun 2 mL % 40 ile elute ACN, % 0,1 TFA. İki 2 mL kesirler cam kültür tüpler içine toplamak. Sütun Sil. Parafilm ile eluate tüplerin kapak ve 3-5 delikler 20 G iğne kullanarak kapak. Tamamen katı kadar en az 30 dk için kuru buzda eluate dondur. Seçili kesirler gecede lyophilize. Ertesi gün, örnekleri lyophilizer durdurmadan önce tamamen kuru olduğundan emin olun. Tüpler 50 mL konik tüp ile hassas mendil-80 ° C’de depolayınNot: Deneme burada duraklatılmış. 8. güçlü katyon değişimi (SCX) pST peptidler Lyophilized peptidler 2 mL arabellek A (Tablo 1) resuspend. Her örnek için kesirler havuz. (Çözüm bulutlu olacak.) Vakum manifold hazırlayın. SCX sütun 3 mL şırınga kaldırıldı pistonu ile bağlayın. Vakum 17 ve 34 kPa arasında (veya üreticinin yönergelerine göre) ayarlayın. ACN, arabellek A. 4 mL tarafından takip 4 mL SCX sütunla durumu Örnek 2 mL adım 8.1 yükleme ve eluate hemen toplamak. A:B (80.9:19.1) arabellek 3 mL yük ve eluate toplamak. Her örnek ve aliquot eluates onları 2 mL düşük protein bağlayıcı tüpler içine havuz. Vakum kadar hacmi yaklaşık % 30’u kalır tüm örneklerini konsantre ol. (Bu adım yaklaşık 2-4 h alır.) Her örnek için 1 düşük protein bağlayıcı tüp içine aliquots havuz. Daha kısa bir C-18 sütun için bir vakum manifold ucunu. Vakum 17 ve 34 kPa arasında (veya üreticinin yönergelerine göre) ayarlayın. Sütun 3 mL % 100 ile ıslak ACN 2 x. Yapmak değil izin kuru sütun. Sütun 3 mL % 0.1 ile equilibrate TFA 2 x. Örnek sütuna yerleştirin. 3 mL den fazla teker teker eklemek değil. Saniyede yaklaşık 1-2 damla hedeflemek için vakum ayarlayın. Sütun 3 mL % 0.1 ile yıkayın TFA 2 x. Sütun 4 mL % 50 ile elute ACN, % 0,1 TFA. 9. titanyum dioksit zenginleştirme pST peptidler 200 µL örnekleri için bir kapasitesi var ipuçları içerdiği TiO2 boncuk hazırlanıyor Bu amaçla boncuk taşımak için belgili tanımlık uç küçük ipucu tarafındaki hafifçe dokunun. Kapağını çıkarın ve boncuk Polipropilen 15 mL konik tüp içine dökün. 0 200 µL ekleyerek ucu durulayın birkaç kez ucu ters çevirme ve doğru kap sıvı taşımak için küçük ucunu flicking ACN,. Bir tıraş bıçağı kullanarak, ucu küçük ucunu keser ve polipropilen 15 mL konik tüp yerleştirir. Kapağını çıkarın ve kalan ACN atılmak için bir micropipette ekleyin. Yıkama 200 µL % 100 ile tekrar ACN. TiO2 boncuk şimdi aşağıdaki adımları için 15 mL konik tüp bulunmaktadır. Yaygõn ile 0 ACN 2 500 µL TiO2 x. Damlalıklı boncuk solvent ile karıştırmak için. Onları vasıl 100 x g 1 dk santrifüj kapasitesi. Koşul TiO2 500 µL 0.2 M sodyum fosfat tampon (pH ~ 7) ile iki kez. Yıkama ile denge 300 µL boncuk tampon 3 x. Eluted phosphopeptides Polipropilen 15 mL konik tüp içine aktarın. Laktik asitin 560 µL ekleyin ve bir bitti sıra rotator kullanarak oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Boncuk cips için 1 dakika için 100 x g karisimin santrifüj kapasitesi. Onları denge arabellek (Tablo 1) 3 300 µL ile yıkamak x. Onları 100 x g 1 dk. için de aşağı spin. Boncuk 300 ile durulayın durulama µL tampon 2 x. Onları 0.2 µm spin filtrenin aktarın. Onları 1.500 x g 1 dk. için de aşağı spin. Filtre birim temiz 1.5 mL düşük protein bağlayıcı tüp aktarın. Elute içeriği 2 x 200 µL % 0,9 NH3 H2O. ile Onları eluting önce 2 min için phosphopeptides oturmak çözüm ver. 10 ve 11 arasında olmalıdır pH ölçmek. Vakum eluate kuruluk gecede amonyak buharlaşır için konsantre ol. 10. desalting pST peptidler MS analizleri için Bu amaçla malzeme taşımak için belgili tanımlık uç küçük ipucu tarafında hafifçe dokunun. 0 200 µL ekleyerek ucu durulayın ardından ucu ters çevirme ve doğru kap sıvı taşımak için küçük ucunu flicking ACN,. Bir tıraş bıçağı kullanarak, ucu küçük ucunu keser ve polipropilen 15 mL konik tüp. yerleştirir Kapağını çıkarın ve kalan ACN atılmak için bir micropipette ekleyin. Yıkama 200 µL % 100 ile tekrar ACN. TiO2 boncuk şimdi aşağıdaki adımları için polipropilen 15 mL konik tüp bulunmaktadır. Bağlama kapasitesi 100 µg. ‘ C-18 ucu kullanarak örnek temiz (üreticinin yönergeleri izleyin.) Tamamen elüsyon birim vakum konsantrasyon tarafından kuru. Bu 1-2 saat sürer. Kurutulmuş phosphopeptides 12.5 µL kütle spektrometresi çözüm (veya araştırmacı MS proteomik çekirdek tesis tarafından önerilen olarak) resuspend. Girdap ve onları 10.000 x g 30, santrifüj kapasitesi s. de onları resuspend için 2 x tekrarlayın. (Yukarı ve aşağı pipet değil.) 11. kütle spektrometresi Analizi Önerilen ayarlara kullanarak sıvı kromatografi-tandem MS (LC-MS/MS) gerçekleştirmek için MS proteomik çekirdek tesise örnekleri gönderin. Örnek ayarlar ( Tablo 2 Özeti için bkz) şunlardır: Bir tuzak sütuna örnekleri 5 µL yük (2 cm uzun x 75 µm çapı) ve % 0.1 ile yıkayın TFA 5 µL/dak bir debi ile 5 min için. Tuzak bir nano analitik sütun (20 cm x 75 µm) doğrultusunda 300 nL/dk debi ile getir. Parçalı doğrusal gradyanlar (yüzde %0.16 formik asit, %0,2 formik asit ACN) pY ve pST örnekleri arasında farklıdır: PY örnekleri için bir degrade 4- 5 min içinde 15- 40 min ve 5 min içinde % 50-90’ı kullanarak elute. PST örnekleri için bir degrade 4- 30 dk içinde 15- 40 dakika içinde 44 min % 25-50 ve 50- 11 dk içinde kullanarak elute. Tam tarama döngüsel bir dizi 20 en yoğun iyonları ve dinamik hariç tutma süresi 20 MS/MS (PİLGRİM6A, göreli çarpışma enerji % 27) tarafından takip 120.000 çözünürlüğe sahip veri bağımlı satın alma modunda MS verileri elde s. Tamamlanabilecek MS sonra tanımlamak ve phosphopeptides ölçmek için bir MS analiz yazılım programı MS raw dosyalarını içe aktarın. (MaxQuant yazılım8,26,27 bu deneyde kullanıldı. Tablo 3’ te belirtilmediği sürece, varsayılan ayarları kullanılmıştır.)

Representative Results

Bu iletişim kuralı, protein çıkarma ve ardından phosphopeptide zenginleştirme ve daha sonraki MS Analiz (Şekil 1) sindirim için bir yöntem ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Tüm arabellekleri ve bu protokol için kullanılan çözümler Tablo 1′ de listelenmiştir. Lys-C ve tripsin sıralı kullanımını verimli bir sindirim sağlar. Sonrası sindirilir, lysate boyama tam sindirim (Şekil 2A) teyit ederken bir Coomassie lekeli jöleyi önceden sindirilmiş lysate proteinler, varlığını doğruluyor. Tam bir sindirim için hiçbir grup 30 kDa ve Lys-C ve tripsin, için 23.3 kDa grupları hariç 15 kDa yukarıda anılan sıraya göre görünmesi gerekir. Lys-C ilavesi de cevapsız nefrette (Şekil 2B) azaltır. PY peptidler phosphoproteome28sadece % 2’si gösterdiğinden, pY özgü antikor kullanarak pY peptidler immunoprecipitation pY peptid zenginleştirme ilk adımdır. Elde edilen süpernatant pST peptid zenginleştirme için giriş haline gelir. PY immunoprecipitation etkili bir şekilde pY peptidler nerede ortalama pY hazırlık tespit phosphopeptides % 85’i pY (Şekil 3A) ve üzerinde pST hazırlık tespit phosphopeptides % 99’u pST peptidler ayırır. pST (Şekil 3B). Titanyum dioksit phosphopeptides her iki müstahzarları için zenginleştirmek için kullanılır. Beklenen fosforile peptidler MS-hazır hazırlık (Şekil 4A) % 30-50 arasında yüzdesidir. Phosphopeptide zenginleştirme yüzde değişkenlik pY hazırlık sonucu olarak orada çok daha az pY peptidler pST peptidler daha büyük olabilir. Phosphopeptide türler açısından tespit phosphopeptides çoğunluğu bir tek veya çift phosphoryl (Şekil 4B) grubunuz. Kütle spektrometresi gerçekleştirdikten sonra MS ham dosyaları bir MS analiz yazılımı yüklenir. Denemede kullanılan parametre ayarları Tablo 3 ‘ te listelenen ama Yazılım yazılım değişir ve sürüm sürüm değişebilir. Listede bulunmayan parametreler bir FDR de dahil olmak üzere varsayılan peptid spektrumlu eşleşen (PSM) değiştirilmiş peptidler27tanımlanması için 40 minimum Andromeda puanı için % 1’fatura kesme kalmıştı. Sırasıyla 0,75 filtreler yaklaşık pY peptidler %5 ve % 15 ve pS ve pT peptidler, % 34 daha daha büyük bir yerelleştirme olasılık kesme ayarı (Şekil 5A). Bu filtreler uygulandıktan sonra phosphopeptide tanımlamaları MS analiz sonunda beklenen sayısı yaklaşık 300 pY peptidler (için başlangıç protein 5 mg) ve yaklaşık 7.500 pS peptidler ve 640 pT peptidler (başlangıç peptid 2.5 mg için de «««miktar) ilgili zenginleştirme hazırlıkları (Şekil 5B). Çoğaltır sayısı ve phosphopeptide sinyal şiddeti çeşitliliği istatistiksel karşılaştırmalar için yeterli güç belirler. Dört ayrı denemelerinde biyolojik çoğaltmaları veya triplicates içeren grupları ile yüzde katsayıları varyasyon (% CV) algılanan phosphopeptides için hesaplanır. Alt değişkenliği (Örneğin, pST gruplarında Şekil 5C1-5) dağıtımları örnek toplama, hazırlık ve kütle spektrometresi ishal tutarlı olduğunu gösterir. Öte yandan, dağılımları (Örneğin, pST grubunda Şekil 5C6) daha yüksek değişkenlik gösterir aşağı akım fark analizlerde önemli farklılıkları algılamak için daha büyük kat-değişiklikler gerektirecektir gürültülü veri. Şekil 1: iş akışı diyagramı. Proteinler örneklerinden çıkarılan ve sindirilmiş. Peptidler katı faz ayıklama (SPE) tarafından ayıklanır ve immunoprecipitated phosphotyrosine (pY) peptidler vardır. Buna paralel olarak, phosphoserine/treonin (pST) peptidler süpernatant pY immunoprecipitation adımda üzerinden zenginleştirilmiş. Güçlü katyon değişimi (SCX) iyon bastırma12azaltmak için çok peptidler kaldırmak için süpernatant üzerinde gerçekleştirilir. Her iki hazırlıklar titanyum dioksit ile phosphopeptide zenginleştirme (TiO2) tabi. Örnek temizleme sonra sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) phosphopeptide bereket ölçmek için gerçekleştirilir. Ham veriler daha sonra phosphopeptides tanımlamak için MS analiz yazılımı yüklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: sindirim değerlendirilmesi. (A)üç lysate öncesi sindirim, sonrası Lys C sindirim 12.5 µg ile örnekleri ve sonrası tripsin sindirim gösterilir. Coomassie jel-leke testi Lys-C ve tripsin sıralı kullanımdan sonra temiz bir sindirim gösterir. Molekül ağırlığı (MW) boyutu işaretleri kilodaltons (kDa) vardır. (B) A cevapsız nefrette azalma gözlendi Lys-C protokole eklendikten sonra. Phosphopeptides cevapsız nefrette olmadan yüzdesi % 48 ve % 60 ortalama pY ve pST zenginleştirme hazırlıkları sırasıyla artış. Lys-C gerçekleştirilen iki deney elde edilen veri ve beş deneyler Lys-c ile gerçekleştirilen grafikleri özetlemek Hata çubukları 38 pY ve 2 ayrı deneyler (olmadan Lys-C) 38 pST örnekleri ve 62 pY ve 5 ayrı deneylerden (Lys-C) 60 pST örnekleri temsil eden standart sapmalar vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: pY ve pST phosphopeptides zenginleştirme. Bu paneller pST zenginleştirme hazırlıklar pSTY phosphopeptides her iki (A) pY veya (B) yüzdeleri göstermek. PY zenginleştirme pY immunoprecipitation ve titanyum dioksit pST zenginleştirme phosphopeptides sadece % 0,1 pY iken % 85 phosphopeptides pY peptidler için varlık içinde sonuçlandı. Bu değerler Fosfo (STY)Sites.txt dosyası kirleticiler, ters dizileri ve phosphopeptides yerelleştirme olasılıklar 0,75 daha az ile filtre sonra bir temsilcisi denemenin. inceleyerek çizildi Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: titanyum dioksit ile Phosphopeptide zenginleştirme. (A)(görece toplam peptidler) algılanan phosphopeptides dört ayrı deneylerde örneklerinden yüzdesi gösterilir. (B) Bu panel mono, Çift ve çok fosforile peptidler ortalama bileşimi dört ayrı deneylerde gösterir. Hata çubukları panelinde A standart sapmalar vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5: beklenen phosphoresidue tanımlamaları. (A) Bu panel gösterir kimlikleri fosforilasyon yerelleştirme olasılıklar pY zenginleştirme (solda) ve pST zenginleştirme (sağda). Ortalama > 0,75 olasılık kesim karşılamak kimlikleri % 93, % 75 ve % 52 pY, pS ve pT, sırasıyla yüzdesidir. (B) ortalama ile kimlik numarası bir > 0,75 yerelleştirme olasılıktır pY için 300, 7500 PS ve 640 pT için. (C) Bu panel değişimi phosphopeptides (% CV) yüzde katsayısı ve keman araziler gösterir. Bir sinyal yoğunluk değeri her biyolojik çoğaltılır veya onaylatılacak grup içinde algılandıysa % CV değerlendirilmesi sadece gerçekleştirildi. Verileri dört ayrı deneylerden çekildi. Hata çubukları panelleri A ve B 34 pY dan standart sapmalar ve 4 ayrı deneyler 34 pST örnekleri vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Arabellek Birim Kompozisyon 6 M guanidinium klorür lizis arabellek 50 mL 6 M guanidinium klorür, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM tris (2-carboxyethyl) fosfamin, 40 mM chloroacetamide, 2 mM sodyum orthovanadate, 2.5 mM Sodyum pirofosfat, 1 mM β-gliserofosfat, 500 mg n-Oktil-glikozit, ultra-saf suya birimi 100 mM Sodyum pirofosfat 50 mL 2.23 g Sodyum pirofosfat decahydrate, ultra-saf suya birimi 1M β-gliserofosfat 50 mL 15,31 g β-gliserofosfat, ultra-saf suya birimi %5 trifluoroacetic asit 20 mL 1 mL % 100 trifluoroacetic asit 19 mL ultra-saf suya ekleyin %0.1 trifluoroacetic asit 250 mL 5 mL % 5 trifluoroacetic asit 245 ml’lik ultra saf su ekleyin pY elüsyon arabellek 250 mL % 0.1 trifluoroacetic asit, % 40 Asetonitril, ultra-saf suya birimi pST elüsyon arabellek 250 mL % 0.1 trifluoroacetic asit, % 50 Asetonitril, ultra-saf suya birimi IP bağlama arabellek 200 mL 50 mM tris pH 7.4, 50 mM sodyum klorür, ultra-saf suya birimi 25 mM Amonyum Bikarbonat, pH 7.5 10 mL 10 mL steril ultra saf su, pH 7.5 1 N hidroklorik asit ile için içine 19.7 mg dağıtılması (~ 10-15 µL/10 ml solüsyon), taze olun 1M fosfat tampon, pH 7 1000 mL 423 mL 1 M sodyum dihydrogen fosfat, 577 mL 1 M sodyum hidrojen fosfat Denge arabellek 14 mL 6.3 mL Asetonitril, 280 µL % 5 trifluoroacetic asit, 1740 µL laktik asit, 5,68 mL ultra saf su Arabellek durulama 20 mL 9 mL Asetonitril, 400 µL % 5 trifluoroacetic asit, 10,6 mL ultra saf su Kütle spektrometresi çözüm 10 mL 500 µL Asetonitril, 200 µL % 5 trifluoroacetic asit, 9.3 mL ultra saf su Arabellek A 250 mL 5 mM monopotassium fosfat (pH 2.65), % 30 Asetonitril, 5 mM potasyum klorür, birime ultra saf su Arabellek B 250 mL 5 mM monopotassium fosfat (pH 2.65), % 30 Asetonitril, 350 mM potasyum klorür, ultra-saf suya birimi %0,9 amonyum hidroksit 10 mL 300 μL .42 amonyum hidroksit, 9.7 mL ultra saf su Tablo 1: arabellekleri ve çözümler. Bu tablo arabellekleri ve çözümleri bu protokol için kullanılan gösterir. LC-MS/MS ayarları Parametre pY ayarı pST ayarı (µL) yükleme örnek 5 Yükleme akış hızı (µL/dk) 5 Degrade akış hızı (nL/dk) 300 Doğrusal gradyan (yüzde %0.16 formik asit, ACN %0,2 formik asit) 4 – 5 min için 4 – 30 dk 15 – 40 dk 15 – 40 dk 50 – 5 min için % 90 25 – 44 min için 50 – 11 dk için % 90 Tam tarama çözünürlüğü 120.000 Seçili en yoğun iyonları sayısı 20 Göreli çarpışma enerji (%) (HCD) 27 Dinamik dışlama (s) 20 Tablo 2: LC-MS ayarları. Bu bir tipik av tüfeği phosphoproteomic deney LC-MS ayarlarında bir örnektir. Örnekleri için bir tuzak sütun doluydu. Tuzak hatlı bir analitik sütunuyla getirildi. Bu ayarları malzemeler tablo ve Kimyasallarılistelenen LC-MS sistemini kullanarak için optimize. Bu ayarlar diğer LC-MS sistemleri için ayarlanması gerekir. MaxQuant parametre ayarları Ayarı Eylem Gruba özgü parametreleri Türü Türü Standart’ı seçin Çeşitlilik 1 olarak ayarlayın Sindirim modu Enzim Tripsin/P seçin Max. cevapsız nefrette 2 olarak ayarlayın Değişiklikler Değişken değişiklikler Fosfo (arpacık) Ekle Etiket içermeyen miktar Etiket içermeyen miktar LFQ seçin LFQ dk. oranı sayısı 1 olarak ayarlayın Hızlı LFQ Onay kutusunu temizleyin Çeşitli Yeniden ölçmek Onay kutusunu temizleyin Genel parametreleri Dizileri FASTA dosyaları Seçme fasta eğe downloaded–dan UniProt Sabit değişiklikler Carbamidomethyl (C) Ekle Detaylı tanımlama Çalışmaları arasında maç Onay kutusunu temizleyin Maç zaman penceresi 5 min için ayarla Hizalama zaman penceresi 20 dk için ayarla Kimliği belirsiz özellikleri maç Onay kutusunu temizleyin Protein miktar Min. oranı sayısı 1 olarak ayarlayın Klasör konumlarını Buna göre değiştirin Tablo 3: MS analiz yazılım ayarları. MaxQuant, bu tablo gruba özel ve genel parametrelerinde seçilir veya ayarlanabilir. Diğer tüm parametreleri varsayılan olarak kaldı. Bu deneyler istimal yorum 1.5.3.30 yapılmıştır. Parameters sürüm sürüm ve Yazılım yazılım değişebilir.

Discussion

Phosphopeptides için zenginleştirmek için bu iletişim kurallarını kullanan önce deneysel tasarım dikkatli bir değerlendirme önemlidir. Daha düşük maliyetli bir kütle spektrometresi kaynakların kullanımı teknik çoğaltır daha biyolojik çoğaltır kullanmaktır. Gerekli olan çoğaltır sayısı kısmen verileri değişkenliği bağlı olacaktır. Yeni yapılan bir çalışmada sadece marjinal çoğaltır üç ötesinde artırıldığında kimliklerinin sayısını artırır iken, önemli kimlikleri arasında daha fazla gruplar artar sayısı10çoğaltır gösterdi.

Phosphoproteins hücre alt bolluğu nedeniyle, yeterli başlangıç protein miktarları genel phosphoproteome keşif modunda prostat kanseri örneklerinden elde etmek gereklidir. Bu deneyler protein 5 mg kullanıldı. Bu hücre satırı bağlı olacak, ancak yaklaşık beş neredeyse konfluent 15 cm yemekleri hücre içine bu iletişim kuralı, giriş olarak yeterli protein sağlar. Tümör gelince, protein beklenen verim doku ağırlığının yaklaşık % 6-8 dokudur. Vitro ortamda düşünün için olumlu denetim örneği hücreleri hasat önce 30 dk 1 mM vanadat eklenmesidir. Vanadat, rekabetçi protein phosphotyrosyl fosfataz inhibitörü, böylece pY peptid tanımlamaları29sayısını artırarak Tirozin fosforilasyon korur.

Temiz sindirim phosphopeptide kimlik en üst düzeye çıkarmak için önemli bir adımdır. Coomassie leke testi yanı sıra veri cevapsız kesim yüzde sindirim verimliliği (Şekil 2) değerlendirmek için kullanılabilir. Kalite kontrol yazılım kullanılabilir cevapsız nefrette ve MS veri kalite30değerlendirmek için diğer ölçümler analiz eder. Tripsin en yaygın, alternatif proteaz bulunur ise5 ‘ e nerede en iyi tryptic peptidler olamaz adresi kapsamı boşluklar Proteom31oluşturulan. MS analiz yazılımı ayarları sonra buna göre proteaz değişimler için ayarlamak için değiştirilmesi gerekir.

Protokol (pY zenginleştirme için) immunoprecipitation yanı sıra titanyum dioksit phosphopeptides için zenginleştirmek (TiO2) kullanır. Peptidler için zenginleştirmek için alternatif yaklaşımlar immobilize metal benzeşme Kromatografi (IMAC), Alüminyum hidroksit ve metal iyon polimer temel benzeşme yakalama (PolyMAC) gibi metal oksit benzeşme Kromatografi (MOAC) için diğer metal oksit içerir. 5,12. Önceki çalışmalarda farklı zenginleştirme yöntemleri phosphopeptides32farklı olasılığını için zenginleştirmek göstermiştir. Örneğin, MOAC tercihen mono fosforile peptidler33için zenginleştiren ise daha çok fosforile peptidler IMAC zenginleştiriyor. Bu iletişim kuralı Temsilcisi sonuçları bu gözlem (Şekil 4B) yansıtacak. Son Yayın IMAC ve bir melez malzeme kullanarak MOAC birleştirerek potansiyel olarak daha fazla kapsama phosphopeptide türler34sağlayabilir gösterdi. Böylece, bu iletişim kuralı daha kapsamlı phosphoproteomic analizleri için izin vermek için paralel olarak diğer zenginleştirme yöntemleri kullanmak için değiştirilmiş olabilir.

MaxQuant26 bilgisayar yazılımı maiyet bu protokolü MS verileri analiz etmek için kullanılır, ama ticari uygulamalar35 da phosphopeptide kimlik ve miktar için kullanılabilir. Phosphopeptide kimlik için bir yerelleştirme olasılık kesme uygulanır. Bu filtre için phosphopeptides phosphoresidue kimlik10,28(yani, 0,75 büyük) yüksek bir güven ile seçmek için gerçekleştirilir. Başka bir deyişle, potansiyel olarak Fosfo-grup içerebilir diğer kalıntıları toplam olasılık 0,25 azdır. Bu kesim phosphopeptide seçim sıkılık artırmak için kaldırdı olamazdı. PST peptidler beklenen sayısı yüksek binlerce tanımlamaları sayısı açısından, pY peptidler beklenen sayısı yüz içinde iken. Bu değerler yaklaşık % 2, % 12 ve % 86 ‘ phosphosites pY, pT ve pS, sırasıyla28nerede daha önce gözlemlenen phosphoproteome dağıtım yansıtır.

PY ve pST zenginleştirme adımları paralel olarak gerçekleştirilmesi durumunda örnek hazırlık adımları protokolündeki altı gün içinde tamamlanabilir. MS güçlü aracı ile eşleştirme olarak, bu gibi phosphopeptide zenginleştirme iletişim kuralları phosphoproteome ilgili araştırma alanlarında bulunan analiz için veri toplamak üzere bilim adamları için genel bir yaklaşım sağlar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tavsiye ve giriş üzerinde el yazması sağlamak için Drake laboratuvar üyeleri teşekkür ediyoruz. Biz de biyolojik kütle spektrometresi tesis, Robert Wood Johnson Tıp Fakültesi ve Rutgers, University of New Jersey eyalet, üyeleri öneriler ve kütle spektrometresi örneklerimizi üzerinde gerçekleştirmek için teşekkür ederim. Larry C. Cheng tarafından ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası T32 GM008339 altında desteklenir. Thomas G. Graeber ncı/NIH (prostat kanseri P50 CA092131; ın SPORE tarafından desteklenmektedir P01 CA168585) ve bir Amerikan Kanser Derneği araştırma bilim adamı Ödülü (RSG-12-257-01-TBE). Justin M. Drake bölümü savunma prostat kanseri araştırma programı W81XWH-15-1-0236, prostat kanseri Vakfı Genç Araştırmacı ödülü, New Jersey Sağlık Vakfı ve bir hassas tıp girişimi Pilot Ödülü Rutgers’tarafından desteklenmektedir Kanser Enstitüsü, New Jersey.

Materials

Ultra-Low Temperature Freezer Panasonic MDF-U76V
Freezer -20 °C VWR scpmf-2020
Swing rotor bucket ThermoFisher Scientific 75004377
Vacuum manifold Restek 26080
Lyophilizer Labconco 7420020
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator Labconco 7810010
End-over-end rotator ThermoFisher Scientific 415110Q
Razor blade Fisher Scientific 620177
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Millipore Sigma UFC901024
Glass culture tubes Fisher Scientific 14-961-26
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
20G needle BD B305175
Kimwipes Fisher Scientific 06-666A
Screw cap cryotube ThermoFisher Scientific 379189
Nunc 15 mL conical tubes ThermoFisher Scientific 12-565-268
Gel loading tips Fisher Scientific 02-707-181
Millipore 0.2 µm spin filter Millipore Sigma UFC30GVNB
Low protein-binding Eppendorf tubes Eppendorf 22431081
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 Millipore Sigma 16101
27B10.4 antibody Cytoskeleton APY03-beads
Peptide assay kit Thermo Scientific 23275 Step 7
TopTip PolyLC Inc TT200TIO.96 Steps 5 and 9
SCX columns (PolySULFOETHYL A) PolyLC Inc SPESE1203
3 mL syringe BD 309657
Trifluoracetic Acid (TFA) Fisher Scientific PI-28904
Acetonitrile (ACN) Fisher Scientific A21-1
Lactic acid  Sigma-Aldrich 69785-250ML
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific A669S-500
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-500
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific BP510-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypsin, TPCK Treated Worthington Biochemicals LS003740
Lysyl Endopeptidase Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 125-05061
MonoTip PolyLC Inc TT200TIO.96 Step 10
ZipTip MilliporeSigma ZTC18S096 Step 6
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm Waters 186008794 Step 11: analytical column
Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns ThermoFisher Scientific 164535 Step 11: trap column
Ultimate 3000 RLSCnano System Dionex ULTIM3000RSLCNANO Step 11
Q Exactive HF ThermoFisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBFZ Step 11
MilliQ water deionized water used to prepare all solutions and bufferes
Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 sonicator
Polytron System PT Kinematica AG PT 10-35 GT homogenizer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  2. Paller, C. J., Antonarakis, E. S. Management of biochemically recurrent prostate cancer after local therapy: evolving standards of care and new directions. Clinical Advances in Hematology & Oncology. 11 (1), 14-23 (2013).
  3. Lowrance, W. T., Roth, B. J., Kirkby, E., Murad, M. H., Cookson, M. S. Castration-resistant prostate cancer: AUA guideline amendment 2015. The Journal of Urology. 195 (5), 1444-1452 (2016).
  4. Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nature Biotechnology. 28 (7), 710-721 (2010).
  5. Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chemical Reviews. 113 (4), 2343-2394 (2013).
  6. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
  7. Bantscheff, M., Lemeer, S., Savitski, M. M., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: critical review update from 2007 to the present. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (4), 939-965 (2012).
  8. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  9. Rubbi, L., et al. Global phosphoproteomics reveals crosstalk between Bcr-Abl and negative feedback mechanisms controlling Src signaling. Science Signaling. 4 (166), ra18 (2011).
  10. Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
  11. Rush, J., et al. Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells. Nature Biotechnology. 23 (1), 94-101 (2005).
  12. Fila, J., Honys, D. Enrichment techniques employed in phosphoproteomics. Amino Acids. 43 (3), 1025-1047 (2012).
  13. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  14. Drake, J. M., et al. Phosphoproteome integration reveals patient-specific networks in prostate cancer. Cell. 166 (4), 1041-1054 (2016).
  15. Lue, H. W., et al. Metabolic reprogramming ensures cancer cell survival despite oncogenic signaling blockade. Genes & Development. 31 (20), 2067-2084 (2017).
  16. Francavilla, C., et al. Phosphoproteomics of primary cells reveals druggable kinase signatures in ovarian cancer. Cell Reports. 18 (13), 3242-3256 (2017).
  17. Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
  18. Skaggs, B. J., et al. Phosphorylation of the ATP-binding loop directs oncogenicity of drug-resistant BCR-ABL mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (51), 19466-19471 (2006).
  19. Zimman, A., et al. Activation of aortic endothelial cells by oxidized phospholipids: a phosphoproteomic analysis. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2812-2824 (2010).
  20. Zimman, A., Berliner, J. A., Graeber, T. G. Phosphoproteomic analysis of aortic endothelial cells activated by oxidized phospholipids. Methods in Molecular Biology. , 53-69 (2013).
  21. Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  23. Meyer, T. S., Lamberts, B. L. Use of coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochimica el Biophysica Acta. 107 (1), 144-145 (1965).
  24. Bergstrom Lind, S., et al. Immunoaffinity enrichments followed by mass spectrometric detection for studying global protein tyrosine phosphorylation. Journal of Proteome Research. 7 (7), 2897-2910 (2008).
  25. Pinkse, M. W., Uitto, P. M., Hilhorst, M. J., Ooms, B., Heck, A. J. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Analytical Chemistry. 76 (14), 3935-3943 (2004).
  26. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  27. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  28. Olsen, J. V., et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 127 (3), 635-648 (2006).
  29. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. The Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  30. Bielow, C., Mastrobuoni, G., Kempa, S. Proteomics quality control: quality control software for MaxQuant results. Journal of Proteome Research. 15 (3), 777-787 (2016).
  31. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  32. Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Mueller, M., Domon, B., Aebersold, R. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nature Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
  33. Leitner, A., Sturm, M., Lindner, W. Tools for analyzing the phosphoproteome and other phosphorylated biomolecules: a review. Analytica Chimica Acta. 703 (1), 19-30 (2011).
  34. Yang, D. S., et al. Design and synthesis of an immobilized metal affinity chromatography and metal oxide affinity chromatography hybrid material for improved phosphopeptide enrichment. Journal of Chromatography A. 1505, 56-62 (2017).
  35. Al Shweiki, M. R., et al. Assessment of label-free quantification in discovery proteomics and impact of technological factors and natural variability of protein abundance. Journal of Proteome Research. 16 (4), 1410-1424 (2017).

Tags

PhosphoproteomePhosphopeptide EnrichmentLabel-free Quantitative Mass SpectrometryProstate CancerSignaling NetworksTherapeutic ResistanceLysis BufferHomogenizationReductionAlkylationSonicationCentrifugationTrypsin DigestionFilterAcidificationC18 ColumnVacuum Manifold

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cheng, L. C., Li, Z., Graeber, T. G., Graham, N. A., Drake, J. M. Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (138), e57996, doi:10.3791/57996 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image