Este protocolo describe un procedimiento para extraer y enriquecer fosfotoproteida de líneas celulares de cáncer de próstata o tejidos para un análisis de la phosphoproteome través de proteómica masa basado en la espectrometría.
Fosfoproteómico consiste en el estudio a gran escala de proteínas fosforiladas. Fosforilación de la proteína es un paso crítico en muchas vías de transducción de señal y es regulada firmemente por cinasas y fosfatasas. Por lo tanto, caracterizar la phosphoproteome puede proporcionar penetraciones en la identificación de nuevas dianas y biomarcadores para terapia oncológica. Espectrometría de masas proporciona un modo globalmente detectar y cuantificar miles de eventos de fosforilación único. Sin embargo, fosfotoproteida es mucho menos abundante que no fosfotoproteida, haciendo el análisis bioquímico más desafiante. Para superar esta limitación, se requieren métodos para enriquecer fosfotoproteida antes de los análisis de espectrometría de masas. Describimos un procedimiento para extraer y asimilar las proteínas del tejido para producir péptidos, seguidos por un enriquecimiento de fosfotirosina (pY) y péptidos de la fosfoserina-treonina (pST) utilizando un anticuerpo-basado o dióxido de titanio (TiO2)-base método de enriquecimiento. Después de la preparación de la muestra y espectrometría de masas, posteriormente identificar y cuantificar mediante cromatografía líquida-espectrometría y software de análisis fosfotoproteida.
Un estimado 165.000 nuevos casos y aproximadamente 29.000 muertes ocurrirá en 2018 debido a cáncer de próstata, que representa el cáncer más común y la segunda causa de muerte relacionada con cáncer en hombres en los Estados Unidos1. Primeras etapas del cáncer de próstata son tratables con terapia de radiación o resección de la enfermedad órgano-confinada, donde la tasa de recurrencia de 10 años es entre 20% y 40% para los pacientes que se someten a prostatectomía y entre 30% y 50% para los pacientes que reciben radiación terapia2. Porque el cáncer de próstata se basa en andrógenos de señalización para el crecimiento, terapias de la castración quirúrgica y química se emplean también para pacientes de alto riesgo. Sin embargo, la recaída ocurre cuando el cáncer ya no responde a terapia de privación de andrógenos evidenciada por recurrencia bioquímica, donde el antígeno prostático específico en suero se levanta otra vez. En este punto en la progresión, las metástasis son a menudo detectadas así. Esta etapa avanzada, llamada cáncer de próstata metastásico resistente a la castración, representa la forma letal de la enfermedad donde el pronóstico es un tiempo de supervivencia media de menos de dos años3. Pocas opciones de tratamiento están disponibles en fase de enfermedad, incluyendo antiandrógenos de segunda generación como enzalutamide y abiraterona, quimioterapia basada en taxanos como docetaxel. A pesar de los tratamientos disponibles, la enfermedad a menudo progresa. Por lo tanto, el descubrimiento y desarrollo de modalidades de tratamiento nuevo son necesarias para mejorar la atención de pacientes de cáncer de próstata con enfermedad avanzada.
Espectrometría de masas (MS)-basado los acercamientos proporcionan un análisis global del proteoma mediante la detección de cientos de miles de analitos péptido4. En particular, el descubrimiento proteómica, también conocido como adquisición de datos dependientes (DDA), puede producir la identificación y cuantificación de miles de péptidos4,5. Descubrimiento basado en MS proteómica puede ser delineado más en proteómica de arriba hacia abajo, donde se caracterizan las proteínas intactas, y la proteómica (también conocido como escopeta) de abajo a arriba, donde se analizan los péptidos para caracterizar las proteínas5. Así, en proteomics de la escopeta, un paso de la proteólisis ocurre en la preparación de la muestra anterior el análisis de MS que desdoblan las proteínas en péptidos. Al final, se realiza una búsqueda de base de datos para asignar los péptidos a las proteínas para la identificación. Etiqueta-libre, así como varios isótopos etiquetado[por ejemplo, el isótopo estable que etiqueta por los aminoácidos en cultura de célula (SILAC)] métodos pueden utilizarse para comparar cuantitativamente péptidos entre muestras6,7. Etiquetado técnicas isotópicas son el estándar de oro, libre de etiqueta métodos han demostrado similar cuantificación exactitudes8,9 y tienen compensaciones comparables entre sensibilidad y especificidad10. Cuantificación de etiqueta-libre proporciona una mayor cobertura y permite comparaciones entre muchas más muestras, mientras que los métodos basados en la etiqueta están limitados por costos y multiplexación capacidad6,7,8.
Además, escopeta MS también puede utilizarse para interrogar (PTMs) las modificaciones post-traduccionales como fosforilación11. Debido a la naturaleza estequiométrica inferior de fosfotoproteida en comparación con péptidos total, se emplean varios métodos para enriquecer para fosfotoproteida, incluyendo inmunoprecipitación basados en anticuerpos de péptidos del phosphotyrosine (pY), dióxido de titanio (TiO2 ) e inmovilizados metal afinidad cromatografía (IMAC)5,12. Ya que la fosforilación de la proteína es un paso clave en muchos célula de señalización de vías, escopeta fosfoproteómico permite a los investigadores investigar cambios en diferentes tipos de cáncer, incluyendo mama13,14de próstata, renal15, de señalización de la célula y ovario,16,17 para comprender mejor la biología del cáncer y para identificar nuevas dianas potenciales para la terapia.
Este método de phosphoproteomic de fusil libre de etiqueta fue construido y refinado basado en trabajo previo por el grupo de Graeber18,19,20. Este protocolo se inicia describiendo la extracción y digestión de proteínas y fosfoproteínas de tejido en péptidos. A continuación detallamos el enriquecimiento de pY péptidos usando anticuerpos específicos fosfotirosina y TiO2. También describimos el enriquecimiento de los péptidos de la fosfoserina-treonina (pST) mediante el fuertes del intercambio catiónico (SCX) seguido de TiO2. Este protocolo concluye con la presentación de las muestras a un centro de MS y el uso de software de análisis de MS para identificar y cuantificar fosfotoproteida y sus correspondientes fosfoproteínas. La aplicación de este protocolo puede extenderse más allá del cáncer de próstata en otros campos fuera de Oncología y cáncer.
Antes de utilizar este protocolo para enriquecer para fosfotoproteida, una consideración cuidadosa del diseño experimental es fundamental. Utilizando repeticiones biológicas es un uso más rentable de los recursos de la espectrometría de masas que repeticiones técnicas. El número de repeticiones necesarias dependerá en parte la variabilidad de los datos. Un estudio reciente demostró que, mientras que el número de repeticiones más allá de los tres sólo marginalmente incrementa el número de identificación, el número de identificaciones significativas entre los grupos aumenta con más repeticiones10.
Debido a la menor abundancia de fosfoproteínas en la célula, cantidades suficientes de proteína a partir son necesarios para obtener una phosphoproteome global de muestras en modo de detección de cáncer de próstata. En estos experimentos, se utilizaron 5 mg de proteína. Aproximadamente cinco platos de 15 cm casi confluentes de células proporcionan suficiente proteína como entrada en este protocolo, aunque se trata de células dependientes de la línea. En cuanto a tejido del tumor, el rendimiento esperado de la proteína es alrededor 6-8% del peso del tejido. En el ajuste en vitro , una muestra de control positivo a tener en cuenta es la adición de vanadato de 1 mM por 30 min antes de la cosecha de las células. Vanadato, un competitivo fosfotirosil fosfatasa inhibidor, preservará la fosforilación de tirosina, aumentando así el número de pY péptido identificaciones29.
Digestión limpia es un paso clave para maximizar la identificación fosfopéptidos. Además de la prueba de tinción de Coomassie, el porcentaje de perdidas divisiones en los datos puede utilizarse para evaluar la eficiencia de la digestión (figura 2). Software de control de calidad está disponible que analiza divisiones perdidas y otras métricas de evaluación de calidad de datos de MS30. Mientras que la tripsina es que las proteasas más comunes, alternativas están disponibles5 a dirección cobertura las brechas en el proteoma donde péptidos trípticos óptima no pueden ser generado31. La configuración del software de análisis de MS entonces tendría que ser modificado en consecuencia para ajustar los cambios en las proteasas.
El protocolo emplea inmunoprecipitación (para el enriquecimiento de pY) así como dióxido de titanio (TiO2) enriquecer para fosfotoproteida. Alternativas para enriquecer para péptidos incluyen cromatografía de afinidad metálica inmovilizados (IMAC), otros óxidos de metal para la cromatografía de la afinidad del óxido de metal (MOAC) tales como hidróxido de aluminio y la captura de la afinidad de iones metálicos basados en polímeros (PolyMAC) 5,12. Estudios anteriores han demostrado que los métodos de enriquecimiento diferentes enriquecen para las diferentes poblaciones de fosfotoproteida32. Por ejemplo, IMAC enriquece más péptidos fosforilados multi mientras MOAC enriquece preferentemente de péptidos fosforilados mono33. Los Resultados de la representante de este protocolo refleja esta observación (Figura 4B). Una reciente publicación demostró que combinar la IMAC y MOAC utilizando un material híbrido potencialmente podría proporcionar una mayor cobertura de fosfopéptidos especies34. Así, este protocolo podría modificarse para utilizar otros métodos de enriquecimiento en paralelo para permitir un análisis más exhaustivo de la phosphoproteomic.
La suite de software de26 MaxQuant se utiliza para analizar los datos de MS en este protocolo, pero también hay aplicaciones comerciales35 para la cuantificación e identificación de fosfopéptidos. Para la identificación de fosfopéptidos, se aplica un corte de la probabilidad de la localización. Este filtro se realiza para seleccionar para fosfotoproteida con una alta confianza (es decir, mayor que 0.75) en la identificación de phosphoresidue10,28. En otras palabras, la probabilidad sumada de todos los otros residuos que potencialmente podría contener el phospho-grupo es menor que 0.25. Esta corte podría plantearse para aumentar el rigor de la selección de fosfopéptidos. Con relación al número de identificación, el número esperado de péptidos pY es cientos, mientras que el número esperado de péptidos de pST es alta miles. Estos valores reflejan la distribución de phosphoproteome previamente observado que alrededor del 2%, 12% y 86% de los phosphosites son pY, pT y pS, respectivamente28.
Si las medidas de enriquecimiento pY y pST se realizan en paralelo, los pasos de preparación de la muestra en el protocolo pueden realizarse en seis días. Por la vinculación con la poderosa herramienta de MS, protocolos enriquecimiento de fosfopéptidos como esta proporcionan un enfoque global de científicos recopilar datos para analizar la phosphoproteome en sus campos de investigación respectivos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Drake por sus consejos y entrada en el manuscrito. También agradecemos a los miembros de la biológica masa espectrometría instalación de Facultad Robert Wood Johnson Medical y Rutgers, la estatal Universidad de Nueva Jersey, para asesoramiento y realización de espectrometría de masas en nuestras muestras. Larry C. Cheng es apoyado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud con el número de concesión GM008339 T32. Thomas G. Graeber es apoyado por el NCI/NIH (esporas en próstata cáncer P50 CA092131; P01 CA168585) y una sociedad americana del cáncer Research Scholar Award (RSG-12-257-01-TBE). Justin M. Drake es apoyado por el Departamento de defensa de la próstata cáncer de investigación programa de W81XWH-15-1-0236, próstata cáncer Fundación Premio al investigador joven, la Fundación de salud de Nueva Jersey y un premio precisión medicina iniciativa piloto de la Rutgers Instituto del cáncer de Nueva Jersey.
Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
20G needle | BD | B305175 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |