Questo protocollo descrive una procedura per estrarre e arricchire fosfopeptidi da linee cellulari di carcinoma della prostata o tessuti per un’analisi della phosphoproteome via basati sulla spettrometria di massa proteomica.
Fosfoproteomica coinvolge lo studio su larga scala di proteine fosforilate. Fosforilazione della proteina è un passo fondamentale in molte vie di trasduzione del segnale ed è strettamente regolata da chinasi e fosfatasi. Di conseguenza, che caratterizzano il phosphoproteome può fornire intuizioni di identificare nuovi target e biomarcatori per la terapia oncologica. Spettrometria di massa fornisce un modo globalmente individuare e quantificare le migliaia di eventi di fosforilazione unico. Tuttavia, fosfopeptidi sono molto meno abbondanti che non-fosfopeptidi, rendendo l’analisi biochimica più impegnativo. Per ovviare a questa limitazione, sono necessari metodi di arricchire fosfopeptidi prima l’analisi di spettrometria di massa. Descriviamo una procedura per estrarre e digerire le proteine dal tessuto per produrre peptidi, seguite da un arricchimento per phosphotyrosine (pY) e peptidi di fosfoserina/treonina (pST) utilizzando un anticorpo-based e/o biossido di titanio (TiO2)-base Metodo di arricchimento. Dopo la preparazione del campione e la spettrometria di massa, abbiamo successivamente identificare e quantificare fosfopeptidi usando spettrometria della cromatografia-massa liquida e software di analisi.
Circa 165.000 nuovi casi e circa 29.000 morti si verificherà nel 2018 a causa di carcinoma della prostata, che rappresenta il tumore più comune e la seconda causa di morte per cancro negli uomini negli Stati Uniti1. Stadi precoci del carcinoma della prostata sono trattabili con resezione o radioterapia della malattia organo-limitata, dove il tasso di ricorrenza di dieci anni è compresa tra 20% e 40% per i pazienti che subiscono la prostatectomia e tra 30% e 50% per i pazienti che ricevono la radiazione terapia2. Perché il cancro alla prostata si basa sulla segnalazione per la crescita dell’androgeno, terapie di castrazione chirurgica e chimiche vengono impiegate anche per pazienti ad alto rischio. Tuttavia, ricaduta si verifica quando il cancro non risponde alla terapia di deprivazione androgenica come evidenziato dalla recidiva biochimica, dove l’antigene prostatico specifico nel siero aumenta ancora. A questo punto nella progressione, metastasi spesso vengono rilevate come bene. Questa fase avanzata, chiamata carcinoma della prostata metastatico resistente alla castrazione, rappresenta la forma letale della malattia dove la prognosi è un tempo di sopravvivenza mediano di meno di due anni3. Poche opzioni di trattamento sono disponibili in ritardo-fase malattia, compreso la seconda generazione antiandrogeni quali enzalutamide e abiraterone, come pure la chemioterapia a base di taxano come docetaxel. Malgrado i trattamenti disponibili, la malattia spesso progredisce. Pertanto, la scoperta e lo sviluppo di modalità di trattamento novello sono necessarie per migliorare la cura dei pazienti di carcinoma della prostata con la malattia avanzata.
Spettrometria di massa (MS)-approcci basati forniscono un’analisi globale del proteoma attraverso l’individuazione di centinaia di migliaia di peptide analiti4. In particolare, scoperta proteomica, acquisizione di dati-dipendente (DDA), noto anche come può produrre l’identificazione e la quantificazione di migliaia di peptidi4,5. Proteomica di rilevamento basato su MS può essere ulteriormente delineato in proteomica verticistica, dove proteine intatte sono caratterizzati, e proteomica ascendente (anche conosciuto come fucile da caccia), dove i peptidi sono analizzati per la caratterizzazione di proteine5. Così, in proteomica di fucile da caccia, un passo di proteolisi avviene nella preparazione del campione precedente l’analisi MS fendere le proteine nei peptidi. Alla fine, viene eseguita una ricerca di database per mappare i peptidi delle proteine per l’identificazione. Privo di etichetta così come parecchie isotopo-etichettatura [ad es., isotopo stabile etichettatura da amminoacidi nella coltura delle cellule (SILAC)] metodi possono essere utilizzati per confrontare quantitativamente peptidi tra campioni6,7. Mentre le tecniche d’etichettatura degli isotopi sono il gold standard, privo di etichetta metodi hanno dimostrato simile quantificazione esattezze8,9 e sono comparabili compromessi tra sensibilità e specificità10. Privo di etichetta quantificazione fornisce una maggiore copertura e permette confronti tra molti più campioni, mentre metodi basati su etichetta sono limitati dal costo e multiplexing capacità6,7,8.
Inoltre, il fucile MS può essere utilizzato anche per interrogare modificazioni post-traduzionali (PTM) come fosforilazione11. A causa della natura inferiore stechiometrica di fosfopeptidi rispetto al totale peptidi, sono impiegati diversi metodi per arricchire per fosfopeptidi, tra cui immunoprecipitazione anticorpo-basato di peptidi phosphotyrosine (pY), biossido di titanio (TiO2 ) e immobilizzato metallo affinità cromatografia (IMAC)5,12. Perché la fosforilazione della proteina è un passaggio chiave nella cella molte vie, di segnalazione fucile fosfoproteomica permette ai ricercatori di studiare i cambiamenti in diversi tipi di cancro, compresi seno13, prostata14, renale15, di segnalazione delle cellule e alle ovaie,16,17 per comprendere meglio la biologia del tumore e per identificare potenziali nuovi target per la terapia.
Questo metodo di fosfoproteomica fucile privo di etichetta è stato costruito e raffinato basato sul precedente lavoro di Graeber gruppo18,19,20. Questo protocollo inizia descrivendo l’estrazione e la digestione delle proteine e fosfoproteine dal tessuto in peptidi. Abbiamo poi dettaglio l’arricchimento dei peptidi di pY utilizzando anticorpi specifici phosphotyrosine e TiO2. Inoltre descriviamo l’arricchimento dei peptidi di fosfoserina/treonina (pST) utilizzando scambio cationico forte (SCX) seguita da TiO2. Questo protocollo si conclude con la presentazione dei campioni ad un impianto di MS e l’uso del software di analisi di MS per identificare e quantificare fosfopeptidi e loro fosfoproteine corrispondente. L’applicazione del presente protocollo può estendersi oltre il carcinoma della prostata in altri campi di fuori di oncologia e cancri.
Prima di utilizzare questo protocollo per arricchire per fosfopeptidi, un attento esame del disegno sperimentale è fondamentale. Utilizzando replicati biologici è un più costo-efficace utilizzo delle risorse di spettrometria di massa rispetto tecnici replicati. Il numero di repliche che sono necessarie dipenderà in parte la variabilità dei dati. Un recente studio ha dimostrato che, mentre aumentando il numero delle ripetizioni oltre le tre solo marginalmente aumenta il numero di identificazioni, il numero di identificazioni significative tra gruppi aumenta con più replica10.
A causa della bassa abbondanza di fosfoproteine nella cella, quantità sufficiente di proteina partenza sono necessari per ottenere un phosphoproteome globale da campioni di carcinoma della prostata in modalità discovery. In questi esperimenti, è stato utilizzato 5 mg di proteina. Circa cinque piatti 15 cm quasi confluenti di cellule forniscono proteine a sufficienza come input in questo protocollo, anche se si tratta di cella linea-dipendente. Per quanto riguarda il tessuto del tumore, del rendimento atteso di proteina è circa 6-8% del peso del tessuto. Nella cornice in vitro , un campione di controllo positivo da considerare è l’aggiunta di vanadato di 1 mM per 30 min prima della raccolta delle cellule. Vanadato, un inibitore di fosfatasi della proteina competitiva phosphotyrosyl, conserverà la fosforilazione della tirosina, aumentando così il numero di identificazioni di pY peptide29.
Digestione pulita è un passo fondamentale per massimizzare phosphopeptide identificazione. Oltre alla prova di macchia di Coomassie, la percentuale di mancata fenditure nei dati può essere utilizzata per valutare l’efficienza di digestione (Figura 2). Software di controllo di qualità è disponibile che analizza fenditure perse ed altre metriche per valutare MS dati qualità30. Mentre la tripsina è che le proteasi più comuni, alternative sono disponibili5 per colmare le lacune copertura nel proteoma dove peptidi triptici ottimale non possono essere generato31. Le impostazioni del software di analisi di MS sarebbero quindi bisogno di essere modificati di conseguenza per regolare le modifiche di proteasi.
Il protocollo si avvale di immunoprecipitazione (per arricchimento pY) così come biossido di titanio (TiO2) arricchire per fosfopeptidi. Approcci alternativi per arricchire per peptidi includono cromatografia di affinità immobilizzata di metallo (IMAC), altri ossidi metallici per cromatografia di affinità di ossido di metallo (MOAC) come idrossido di alluminio e la cattura di affinità dello ione del metallo a base di polimeri (PolyMAC) 5,12. Studi precedenti hanno dimostrato che diverse arricchimento dei metodi arricchisca per le diverse popolazioni di fosfopeptidi32. Per esempio, IMAC arricchisce più peptidi multi-fosforilati mentre MOAC preferibilmente arricchisce per peptidi fosforilati in mono33. I Risultati di rappresentante del presente protocollo riflettono questa osservazione (Figura 4B). Una recente pubblicazione ha dimostrato che la combinazione di IMAC e MOAC utilizzando un materiale ibrido potenzialmente potrebbe fornire una maggiore copertura di phosphopeptide specie34. Così, questo protocollo potrebbe essere modificato per utilizzare altri metodi di arricchimento in parallelo per consentire analisi fosfoproteomica ancora più complete.
La suite di software26 MaxQuant viene utilizzata per analizzare i dati di MS in questo protocollo, ma applicazioni commerciali35 sono anche disponibili per fosfopeptide identificazione e quantificazione. Per fosfopeptide identificazione, viene applicata una probabilità di localizzazione cutoff. Questo filtro viene eseguito per selezionare per fosfopeptidi con un’elevata probabilità (cioè, maggiore di 0,75) in phosphoresidue identificazione10,28. In altre parole, la probabilità sommata tutti i altri residui che potrebbero potenzialmente contenere il phospho-gruppo è inferiore a 0,25. Questa frequenza di taglio poteva essere sollevata per aumentare il rigore della selezione phosphopeptide. Per quanto riguarda il numero di identificazioni, il numero atteso di peptidi pY è nell’ordine delle centinaia, mentre il numero previsto di peptidi pST è in migliaia ad alte. Questi valori riflettono precedentemente osservati phosphoproteome distribuzione dove circa il 2%, 12% e 86% della phosphosites sono pY, pT e pS, rispettivamente28.
Se i passaggi di arricchimento pY e pST vengono eseguiti in parallelo, la procedura di preparazione del campione nel protocollo può essere completata in sei giorni. In abbinamento con il potente strumento di MS, protocolli di arricchimento phosphopeptide come questo forniscono un approccio globale per gli scienziati raccogliere i dati per analizzare il phosphoproteome nei loro campi rispettivi ricerca.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i membri del laboratorio Drake per fornire consulenza e ingresso sul manoscritto. Ringraziamo anche i membri del biologico massa spettrometria Facility di Robert Wood Johnson Medical School e Rutgers, The State University of New Jersey, per fornire consulenza e l’esecuzione di spettrometria di massa sui nostri campioni. Larry C. Cheng è supportato dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto numero premio T32 GM008339. Thomas G. Graeber è supportato dal NIH/NCI (SPORE in prostata cancro P50 CA092131; P01 CA168585) e un American Cancer Society Research Scholar Award (RSG-12-257-01-TBE). Justin M. Drake è supportato dal dipartimento della difesa prostata cancro ricerca programma W81XWH-15-1-0236, prostata Cancer Foundation Young Investigator Award, il New Jersey Health Foundation e un premio di precisione medicina iniziativa pilota dalla Rutgers Cancer Institute del New Jersey.
Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
20G needle | BD | B305175 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |