העשרה Phosphopeptide בשילוב עם ספקטרומטר מסה ללא תווית כמותיים כדי לחקור את Phosphoproteome סרטן הערמונית

ניסויים באמצעות גידולים xenograft היו אושרה על ידי רוטגרס אוניברסיטת אכפת חיה מוסדיים שימוש הוועדה כפי שנקבע הלאה תחת הקווים המנחים של מכוני הבריאות הלאומיים. 1. חלבון החילוץ להכין מאגר פירוק (טבלה 1). (אמצעי האחסון תלוי במספר הדגימות להיות נקצרו.) עבור במבחנה דגימות תאים, להמשיך לצעוד 1.2. עבור רקמת הגידול, להמשיך לצעוד 1.3. קציר תאים לאסוף את התאים צינור חרוטי 50 מ ל, לסובב אותם ב 700 g x עבור 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע ולשמור בגדר על קרח. חזור על שלב זה עבור כל המנות לאסוף את התאים לתוך גלולה אחת. (בדרך כלל, כ-5 מנות 15-ס”מ כמעט confluent של תאים יש צורך 5 מ”ג של חלבון, אך זה עשוי להיות תלוי על הקו תא וצריך לקבוע מדעית על ידי כל חוקר). רחץ בגדר עם 30 מ של צונן באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ו ספין-700 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C לפני כ רפה בעברית, טוב, מגניב. להוסיף 1.5 מ של פירוק מאגר לכל 5 מ”ג חלבון נהגה בגדר התא. Pipet למעלה ולמטה כמה פעמים. דלג לשלב מס ‘ 1.4. קצירת רקמות שוקל את הגידול ולהוסיף 2 מ של פירוק כקרח המאגר עבור כל 100 מ ג של רקמות במבחנה תרבות. (בדרך כלל, 50 עד 150 מ ג של משקל רטוב רקמות נדרש.) Homogenize באמצעות lysate מהמגן כף יד או benchtop (דופק 2 x 15 s.) לנקות את מהמגן לפני המדגם הראשון, בין דגימות באמצעות אקונומיקה 10%, 70% אתנול ומים יונים ברצף. כדי להפחית את alkylate, מחממים את הדגימות homogenized ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. אז מגניב אותם על קרח למשך 15 דקות. על קרח, sonicate ה-x 3 lysate (כלומר, במשך 30 s עם 60 s הפסקות בין פולסים). המדגם אינו יכול להיות צמיגה או הגושיים בשלב זה. מחממים את lysate ב 95 ° C 5 דקות21. צנטריפוגה lysate ב sonication באותו צינור באמצעות רוטור דלי הנדנדה ב g 3,500 x-15 מעלות במשך 15 דקות לאסוף את תגובת שיקוע וזורקים בגדר. לקבוע ריכוז החלבון על ידי ביצוע וזמינותו ברדפורד22. במידת הצורך, לדלל את lysate עד 5 מ”ג/מ”ל עם מאגר פירוק. אחסן אותו ב-20 ° C.הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן. להקפיא את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס ולהמשיך במועד מאוחר יותר. 2. lysate עיכול לדלל את הדגימה 12-fold באמצעות 100 מ מ טריס (ה-pH = 8.5) כדי להפחית את כמות guanidinium. לדלל כל הדגימות באותו אמצעי אחסון כדי למזער את ההשפעות של עיכול לא שיוויוני. שמור µg 12.5 של מעוכל lysate כדי לאשר אותה ג’ל שהוכתמו Coomassie23. 5 מ”ג של חלבון, להוסיף 10 µg של Lysyl Endopeptidase (Lys-C), דגירה זה בטמפרטורת החדר במשך 5-6 ה pH התאם ל 8.0 על-ידי הוספת 1 מ’ untitrated טריס (pH ~ 11). להכין 1 מ”ג/מ”ל של L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl קטון (TPCK)-טיפול טריפסין 1 מ”מ HCl (עם 20 מ מ CaCl2). הוסף את טריפסין ביחס טריפסין: חלבון מטריים, דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. הוסף את אותה כמות של טריפסין טריים כמו שלב 2.3. דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שמור µg 12.5 של מתעכל lysate כדי לאשר עיכול מלאה ג’ל שהוכתמו Coomassie23. 3. היפוך פאזה החילוץ להקליט את העוצמה lysate. לסנן את הדגימה באמצעות מסנן 15 mL 10 kDa הקיצוץ. Centrifuge המדגם-3500 x g באמצעות הרוטור דלי סווינג (או g x 3,500 ברוטור זווית קבועה) ב 15 ° C עד שאמצעי האחסון retentate µL פחות מ 250 (זה לוקח כ- 45-60 דקות). לאסוף את הזרימה דרך וזורקים את retentate.הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן. להקפיא את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס ולהמשיך במועד מאוחר יותר. כדי acidify את הדגימה, להוסיף כ 20 µL של 5% trifluoroacetic חומצה (TFA) לכל מ של lysate. מתבלים ולמדוד את ה-pH מדגם באמצעות רצועות pH. להתאים את ה-pH ל 2.5 באמצעות 5% TFA. חבר את הקצה קצר יותר של עמודה C-18 יריעה ואקום. הגדר את הריק בין kPa 17 ו- 34 (או על פי הוראות היצרן). באמצעות פיפטות זכוכית , להרטיב את העמודה עם 3 מ ל 100% acetonitrile (לחצן מצוקה). אל תתנו את העמודה יבש. באמצעות פיפטות זכוכית , equilibrate את העמודה עם 6 מ של 0.1% TFA מורחים 2 x 3 מ”ל. לטעון את הדגימה acidified לתוך העמודה. אל תוסיף יותר מ 3 מ ל בכל פעם. התאם את הואקום למטרה כ 1-2 טיפות לשניה. באמצעות פיפטות זכוכית , לשטוף את העמודה עם 9 מ של 0.1% TFA מורחים 3 x 3 מ”ל. Elute את העמודה עם 2 מ של 40% לחצן מצוקה, 0.1% TFA. לאסוף שני שברים 2 מ”ל לתוך צינורות תרבות זכוכית . למחוק את העמודה. מכסה את צינורות eluate עם מצלמות-מיקרוסקופים, 3-5 חורים על השער באמצעות מחט 20 גרם. להקפיא את eluate על קרח יבש במשך לפחות 30 דקות עד שזה יהיה לגמרי מוצק. Lyophilize השברים בן לילה. ביום הבא, ודא כי הדגימות יבשים לחלוטין לפני העצירה של איזה שהוא לופילייזר. לאחסן את הצינורות צינור חרוטי 50 מ עם מגבונים עדינים ב-80 מעלות צלזיוס.הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן. 4. Immunoprecipitation והעשרה של pY פפטידים24 Resuspend את האבקה lyophilized 0.5 מ ל קרה כקרח immunoprecipitation (IP) מחייב מאגר של כל שבר. בריכה השברים על-ידי העברת אמצעי האחסון resuspension 0.5 mL השבר השני השבר הראשון ולשמור את הטיפ פיפטה. נמרצות מערבולת (במקום pipetting למעלה ולמטה) כדי לוודא הדגימה היא התפרקה לחלוטין לפני העברת אותו cryotube בורג מכסה 3.6 mL. כמו שלב 4.1., לשטוף את צינורות lyophilization עם עוד 0.5 mL מאגר איגוד ה-IP (טבלה 1) בכל שפופרת. להעביר את הפתרון הצינור פקקי בורג 3.6 mL באמצעות הטיפ פיפטה אותו כדי למזער את אובדן הדגימה. חזור על רינס 1 x יותר, ביצוע האחסון resuspension הסופי 2 מ”ל (עבור 5 מ”ג של חלבון). למדוד את רמת החומציות מדגם כדי לוודא שזה כ 7.4. אם זה חומצי מדי, iteratively להוסיף 10 µL של 1 מ’ טריס (untitrated, pH ~ 11). אם זה גם בסיסית, iteratively להוסיף 10 µL של HCl שתדללו (1:25 או 1: 100). מראש לשטוף את החרוזים pY (עבור 5 מ”ג של החל lysate) 25 µg של נוגדן 4G 10 ו- 12.5 µg של נוגדן 27B10.4 דרושים עבור דגימה. לאחר שימוש של p200 פיפטה עם טיפ לחתוך כדי להעביר את הנוגדנים לתוך צינורות microcentrifuge נפרדים, לשטוף את הנוגדנים עם 450 µL קר כקרח מאגר איגוד ה-IP 2 x. Centrifuge אותם ב g 100 x דקות 1-4 ° C ו לשאוב החוצה תגובת שיקוע. Resuspend את החרוזים כדי ריכוז מניות של 0.5 מ”ג/מ”ל באמצעות מאגר איגוד ה-IP. (לעשות לא מערבולת החרוזים.) לאחר aliquoting הצורך slurry (50 µL של slurry נוגדן 4G 10 ו slurry נוגדן 27B10.4 µL 25 עבור דגימה) לתוך צינור יחיד, ספין לטמיון צנטריפוגה מניות ב- g 200 x עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. רחץ בקירות הצדדיים עם תגובת שיקוע לפני שחזר את החרוזים לאחסון במקרר. להוסיף חרוזים pY טרום שטף הפתרון מדגם resuspended ב cryotubes פקקי בורג. דגירה אותם ב 4 ° C-מסובב מעל קצה-בן לילה. מקום cryotubes בורג מכסה את שפופרת צנטרפוגה 50 מ עם מגבון עדין. ספין למטה החרוזים-g x 100 עבור דק 1. להציל תגובת שיקוע, אשר ישמש כדי להעשיר עבור pST פפטידים. (העשרת של pST מתחיל שלב 7, יכול להתבצע במקביל לעיבוד פפטיד pY). Resuspend את החרוזים עם 300 µL מאגר איגוד ה-IP. להעביר אותם ל צינור microcentrifuge 2 מ”ל, לסובב אותם למטה ב g x 100 דקות 1-4 מעלות צלזיוס. שטיפה הדגירה צינור 3 x עם 200 µL מאגר איגוד ה-IP. העבר את התוכן הצינור Microcentrifuge אותו בכל פעם. ואז לסובב אותם למטה. תשטוף החרוזים ב microcentrifuge צינור 3 x עם 500 µL מאגר איגוד ה-IP, לסובב אותם למטה ב- g x 100 עבור 1 דקות. לאחר מכן לשטוף את החרוזים 4 x עם 450 µL של 25 מ מ NH4HCO3, pH 7.5 ו ספין לפדר אותם למטה ב g 100 x לפתרון 1 דקות שימוש טריים 25 מ מ NH4HCO3 מ בכל פעם. Centrifuge החרוזים-g x 1,500 עבור 1 הגבלת שימוש טיפ העמסה ג’ל כדי להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע בטבילת קצהו של קצה ג’ל-טעינה מעט מתחת לפני השטח של החרוזים. להוסיף 4 x נפח חרוז של 0.1% TFA כדי החרוזים (כלומר, להוסיף µL 300 של 0.1% TFA עבור 75 µg של slurry חרוז pY). מתבלים, דגירה התערובת ב thermomixer-1000 סל”ד למשך 15 דקות ב 37 º C. להעביר את resuspension מסנן ספין 0.2 µm. ספין דרך צינור • תנאי ובמהירות להעביר את אמצעי האחסון שיורית באותו ספין מסנן משתמש של pipet P10. ספין למטה המסנן ספין ב 850 x g עבור מינימלית 1 להעביר את • תנאי צינור microcentrifuge מחייב חלבון נמוכה . ואקום לרכז את eluate ליובש בלילה ב 40 מעלות צלזיוס, עם זמן החום של 300 דקות.הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן. להקפיא את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס ולהמשיך במועד מאוחר יותר. 5. טיטניום דו-חמצני העשרה25 pY פפטידים Resuspend את יבשים למטה phosphopeptides ב µL 200 של 50% לחצן מצוקה, 0.1% TFA. מערבולת, centrifuge אותם ב g 10,000 x ‘ חזור ‘ ס’ 30 זה x 1 כדי resuspend אותם היטב. הכנת חרוזים2 TiO הכלול טיפים בעלי קיבולת של דגימות µL 200. טפח בעדינות על הצד הטיפ קטן של קצה כדי להעביר את החומר למטרה זו. לשטוף את הטיפ על-ידי הוספת 200 µL של 100% לחצן מצוקה, ואחריו היפוך הקצה, מצליף הסוף קטן כדי להעביר את הנוזל לכיוון הכיפה. בעזרת סכין גילוח, חותכים את קצה הקצה קטן ומניחים אותו מעל. צינור מחייב חלבון נמוכה. (הימנעו משימוש צינורות פוליסטירן TiO2 ידבק צידי הצינור). הסירי את הפקק והכנס של micropipette לצלול החוצה לחצן מצוקה הנותרים. חזור על כביסה עם 200 µL של 100% לחצן מצוקה. החרוזים TiO2 נמצאים עכשיו בצינור מחייב חלבון נמוכה עבור השלבים הבאים. מקדים TiO2 עם µL 500 של לחצן מצוקה 100% 2 x. Pipet זה לערבב את החרוזים עם הממס. Centrifuge אותם ב- g x 100 עבור 1 דקות. תנאי TiO2 עם 500 µL 0.2 מ’ סודיום פוספט מאגר (pH ~ 7) 2 x. תשטוף החרוזים עם 300 µL של equilibration מאגר 3 x. כי TiO2 הוא מאוד צפוף, החרוזים יסדר במהירות. להוסיף 400 µL של 50% לחצן מצוקה, 0.1% TFA לתוך הצינורית מחייב חלבון נמוכה, ואחריו הוספת 84 µL של חומצה לקטית. להעביר את phosphopeptides resuspended לתוך הצינור מחייב חלבון נמוכה, דגירה אותם לשעה בטמפרטורת החדר באמצעות מסובב מעל קצה-. Centrifuge את החרוזים-g x 100 עבור 1 דקות הצניפה אותם. לשטוף אותם עם 300 µL equilibration מאגר (טבלה 1) 2 x ולסובב אותם למטה ב- g x 100 עבור 1 דקות. לשטוף את החרוזים עם 300 µL של שטיפה מאגר 2 x. מעבירים למסנן ספין 0.2 µm. לסובב אותם ב- g x 1,500 עבור 1 דקות. העברת יחידת מסנן צינור נקי mL 1.5 מחייב חלבון נמוכה. Elute את התוכן 2 x עם 200 µL של 0.9% NH3 H2O. מדד ה-pH עם חומציות, אשר צריכה להיות בין 10 ל- 11. ואקום לרכז את eluate ליובש בלילה מתמוססות התרכובת הכימית. 6. desalting pY פפטידים עבור MS ניתוחים לשקם את phosphopeptides עם µL 15 של 0.1% TFA vortexing, צריך שתוציאו אותם ב g x 10,000 ל 30 s כדי resuspend אותם. חזור על x 1 זה כדי resuspend אותם היטב. לא פיפטה למעלה ולמטה. לנקות את הדגימה באמצעות טיפ C-18 עם קיבולת קשירה של 5 µg ופעל הפרוטוקול של היצרן. יבש לחלוטין • תנאי האחסון על-ידי ריכוז ואקום. זה לוקח 1-2 ה Resuspend את phosphopeptides יבשים ב- 12.5 µL של פתרון ספקטרומטר מסה (ראה טבלה 1) (או כפי המומלץ על-ידי MS של החוקר פרוטאומיקס ליבה של המתקן). מערבולת בקצרה ספין הפתרון למטה ב 10,000 g x עבור חזור ס’ 30 זה 2x resuspend אותם היטב. הדגימות מוכנים להגשה למתקן ספקטרומטר מסה (שלב 11).הערה: השלבים הבאים להלן קשורים pST פפטיד העשרה בלבד. 7. הפוך שלב מיצוי של פפטידים pST מודדים את ריכוז פפטיד תגובת שיקוע רכשה משלב 4.6 על-ידי ביצוע וזמינותו של פפטיד. כמות מספקת עבור pST ספקטרומטר מסה הוא 2.5 מ ג. להתאים את ה-pH ל 3.5 עם 5% TFA. חבר את הקצה קצר יותר של עמודה C-18 יריעה ואקום. הגדר את הריק בין kPa 17 ו- 34 (או על פי הוראות היצרן). להרטיב את העמודה עם 3 מ”ל של 100% לחצן מצוקה. אל תתנו את העמודה יבש. Equilibrate את העמודה עם 6 מ של 0.1% TFA מורחים 2 x 3 מ”ל. לטעון את הדגימה acidified לתוך העמודה. אל תוסיף יותר מ 3 מ ל בכל פעם. התאם את הואקום למטרה כ 1-2 טיפות לשניה. לשטוף את העמודה עם 9 מ של 0.1% TFA מורחים 3 x 3 מ”ל. Elute את העמודה עם 2 מ של 40% לחצן מצוקה, 0.1% TFA. לאסוף שני שברים 2 מ”ל לתוך צינורות תרבות זכוכית. למחוק את העמודה. מכסה את צינורות eluate עם מצלמות-מיקרוסקופים, 3-5 חורים על השער באמצעות מחט 20 גרם. להקפיא את eluate על קרח יבש במשך לפחות 30 דקות עד שזה יהיה לגמרי מוצק. Lyophilize שברים הנבחר בין לילה. ביום הבא, ודא כי הדגימות יבשים לחלוטין לפני העצירה של איזה שהוא לופילייזר. לאחסן את הצינורות צינור חרוטי 50 מ עם מגבונים עדינים ב-80 מעלות צלזיוס.הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן. 8. חזקה קטיון (SCX) של פפטידים pST Resuspend של פפטידים lyophilized ב 2 מ”ל של מאגר A (טבלה 1). בריכת השברים עבור כל דגימה. (הפתרון יהיה מעונן.) הכינו את סעפת ואקום. להתחבר עמודת SCX מזרק 3 מ עם הבוכנה הוסר. הגדר את הריק בין kPa 17 ו- 34 (או על פי הוראות היצרן). להתנות את העמודה SCX עם 4 מ של לחצן מצוקה, ואחריו 4 מ של מאגר א לטעון mL 2 של הדוגמה מהצעד 8.1 ולאסוף את eluate מיד. לטעון 3 מ”ל של A:B (80.9:19.1) מאגר ולאסוף את eluate. מאגר eluates של כל דוגמה, aliquot אותם לתוך צינורות מחייב חלבון נמוכה מ ל 2. ואקום להתרכז כל דוגמאות עד כ-30% של אמצעי האחסון נשאר. (שלב זה לוקח כ 2-4 h). מאגר של aliquots לתוך צינור 1 מחייב חלבון נמוכה עבור כל דגימה. חבר את הקצה קצר יותר של עמודה C-18 יריעה ואקום. הגדר את הריק בין kPa 17 ו- 34 (או על פי הוראות היצרן). להרטיב את העמודה עם 3 מ”ל של 100% לחצן מצוקה 2 x. האם לא נתנו העמודה יבש. Equilibrate את העמודה עם 3 מ”ל של 0.1% TFA 2 x. לטעון את הדגימה לתוך העמודה. אל תוסיף יותר מ 3 מ ל בכל פעם. התאם את הואקום למטרה כ 1-2 טיפות לשניה. לשטוף את העמודה עם 3 מ”ל של 0.1% TFA 2 x. Elute את העמודה עם 4 מ”ל של 50% לחצן מצוקה, 0.1% TFA. 9. טיטניום דו-חמצני העשרה של פפטידים pST הכנת חרוזים2 TiO הכלול טיפים בעלי קיבולת של 200 דוגמאות µL טפח בעדינות על הצד טיפ קטן של קצה כדי להעביר את החרוזים למטרה זו. הסירי את הפקק ויוצקים את החרוזים לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ”ל. לשטוף את הטיפ על-ידי הוספת 200 µL של 100% לחצן מצוקה, היפוך הקצה כמה פעמים והוא מצליף הסוף קטן כדי להעביר את הנוזל לכיוון הכיפה. בעזרת סכין גילוח, חותכים את קצה הקצה קטן, מעל הצינור חרוט פוליפרופילן 15 מ”ל. הסירי את הפקק והכנס של micropipette לצלול החוצה לחצן מצוקה הנותרים. חזור על כביסה עם 200 µL של 100% לחצן מצוקה. החרוזים2 TiO נמצאים עכשיו בצינור חרוט 15 mL עבור השלבים הבאים. מקדים TiO2 עם µL 500 של לחצן מצוקה 100% 2 x. Pipet זה לערבב את החרוזים עם הממס. Centrifuge אותם ב- g x 100 עבור 1 דקות. תנאי TiO2 עם 500 µL 0.2 מ’ סודיום פוספט מאגר (pH ~ 7) פעמיים. תשטוף החרוזים עם 300 µL של equilibration מאגר 3 x. להעביר את phosphopeptides eluted לתוך הצינור חרוט פוליפרופילן 15 מ”ל. הוסף µL 560 של חומצה לקטית, דגירה זה לשעה בטמפרטורת החדר באמצעות מסובב מעל קצה-. Centrifuge את התערובת ב g x 100 עבור 1 דקות הצניפה החרוזים. לשטוף אותם עם 300 µL equilibration מאגר (טבלה 1) 3 x. ספין אותם למטה ב- g x 100 עבור 1 דקות. לשטוף את החרוזים עם 300 µL של שטיפה מאגר 2 x. מעבירים למסנן ספין 0.2 µm. ספין אותם למטה ב- g x 1,500 עבור 1 דקות. העברת יחידת מסנן צינור נקי mL 1.5 מחייב חלבון נמוכה. Elute את התוכן 2 x עם 200 µL של 0.9% NH3 H2O. תן את הפתרון לשבת על phosphopeptides למשך 2 דקות לפני eluting אותם. למדוד את רמת החומציות, אשר צריכה להיות בין 10 ל- 11. ואקום לרכז את eluate ליובש בלילה מתמוססות התרכובת הכימית. 10. desalting את pST פפטידים עבור MS ניתוחים טפח בעדינות על הצד הטיפ קטן של קצה כדי להעביר את החומר למטרה זו. לשטוף את הטיפ על-ידי הוספת 200 µL של 100% לחצן מצוקה, ואחריו היפוך הקצה, מצליף הסוף קטן כדי להעביר את הנוזל לכיוון הכיפה. בעזרת סכין גילוח, חותכים את קצה הקצה קטן ומניחים אותו מעל צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ”ל. הסירי את הפקק והכנס של micropipette לצלול החוצה לחצן מצוקה הנותרים. חזור על כביסה עם 200 µL של 100% לחצן מצוקה. החרוזים TiO2 נמצאים עכשיו בצינור חרוט פוליפרופילן 15 mL עבור השלבים הבאים. לנקות את הדגימה באמצעות טיפ C-18 עם קיבולת איגוד של 100 µg. (בצע הוראות היצרן). יבש לחלוטין • תנאי האחסון על-ידי ריכוז ואקום. זה לוקח 1-2 h. Resuspend את phosphopeptides יבשים ב- 12.5 µL של פתרון ספקטרומטר מסה (או כפי המומלץ על-ידי MS של החוקר פרוטאומיקס ליבה של המתקן). מערבולת, centrifuge אותם ב g x 10,000 ל 30 ס חזור על x 2 כדי resuspend אותם היטב. (לא פיפטה למעלה ולמטה.) 11. ניתוח ספקטרומטר מסה להגיש את הדגימות למתקן הליבה פרוטאומיקס MS כדי לבצע נוזלי MS כרומטוגרפיה-טנדם (LC-MS/MS) תוך שימוש בהגדרות המומלצות שלהם. הגדרות לדוגמה להלן (ראה טבלה 2 התקציר): לטעון µL 5 של הדגימות לתוך עמודה השמנה (2 ס מ זמן x 75 קוטר מיקרומטר) ולשטוף אותם עם 0.1% TFA במשך חמש דקות עם קצב זרימה של µL 5/min. תביא את המלכודת בקנה אחד עם ננו אנליטי עמודה (20 ס מ x 75 מיקרומטר) עם קצב זרימה של nL 300/min. מעברי צבע ליניאריים מקוטע (אחוז חומצה פורמית 0.16%, 80% לחצן מצוקה ב- 0.2% חומצה פורמית) שונים בין דגימות pY ו pST: עבור הדגימות pY, elute אותם באמצעות מעבר הדרגתי של 4-15% ב- 5 דקות, 15-50% בדקות 40 ו 50-90% ב- 5 דקות. לקבלת דוגמאות pST, elute אותם באמצעות מעבר הדרגתי של 4-15% 30 דקות, 15-25% ב- 40 דקות, 25-50% בדקות 44 ו- 50-90% ב- 11 דקות. MS נתוני רכישת נתונים תלויי במצב עם סדרה מחזורית של סריקה מלאה עם רזולוציה של 120,000 ואחריו MS/MS (HCD, אנרגיית התנגשות היחסי של 27%) של היונים האינטנסיבי ביותר 20 ומשך דינמי אי-הכללה של 20 s. לאחר MS להפעיל השלמה, לייבא את קבצי raw של MS תוכנית תוכנת MS ניתוח כדי לזהות ולכמת phosphopeptides. (MaxQuant תוכנה8,26,27 נעשה שימוש בניסוי זה. אלא אם צוין בטבלה3, הגדרות ברירת המחדל שימשו.)