JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

Published: August 02, 2018
doi:
10.3791/57996
, , , ,
1Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, School of Graduate Studies,Rutgers University, The State University of New Jersey, 2Graduate Program in Quantitative Biomedicine, School of Graduate Studies,Rutgers University, The State University of New Jersey, 3Department of Medicine, Division of Medical Oncology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4Crump Institute for Molecular Imaging, Department of Molecular and Medical Pharmacology, Jonsson Comprehensive Cancer Center, UCLA Metabolomics Center, and California NanoSystems Institute,David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 5Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science,University of Southern California, 6Pharmacology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 7Cancer Metabolism and Growth Program,Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

Dit protocol beschrijft een procedure om uitpakken en verrijken van phosphopeptides van prostaatkanker cellijnen of weefsels voor een analyse van de phosphoproteome via massa spectrometrie gebaseerde proteomics.

Abstract

Fosfoproteomics omvat de grootschalige studie van gefosforyleerd eiwitten. Proteïne Fosforylatie is een cruciale stap in de vele signaaltransductie wegen en is strak gereguleerd door kinases and fosfatasen genaamd. Daarom kan karakterisering van de phosphoproteome inzicht verwerven in het identificeren van nieuwe doelstellingen en biomarkers voor oncologische therapie. Massaspectrometrie biedt een manier om wereldwijd detecteren en kwantificeren van duizenden unieke fosforylatie evenementen. Phosphopeptides zijn echter veel minder overvloedig dan niet-phosphopeptides, maken van biochemische analyse uitdagender. Om deze beperking ondervangen zijn methoden te verrijken van phosphopeptides vóór de massaspectrometrie analyse vereist. We beschrijven een procedure om te halen en verteren van eiwitten uit weefsel aan opbrengst peptides, gevolgd door een verrijking voor phosphotyrosine (pY) en phosphoserine/threonine (pST) peptiden met behulp van een antilichaam-gebaseerd en/of titaniumdioxide (TiO2)-gebaseerd verrijking methode. Na de bereiding van de monsters en massaspectrometrie, we vervolgens identificeren en kwantificeren van phosphopeptides met vloeibare chromatografie-massa spectrometrie en analysesoftware.

Introduction

Er treedt een geschatte 165.000 nieuwe gevallen en ongeveer 29.000 sterfgevallen in 2018 te wijten aan prostaatkanker, vertegenwoordigen de meest voorkomende kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker sterfgevallen bij mannen in de Verenigde Staten1. Vroege stadia van prostaatkanker zijn behandelbaar met resectie of straling therapie van orgel-begrensde ziekte, waar het tien jaar herhaling tarief is tussen 20% en 40% voor patiënten die ondergaan prostatectomie en tussen 30% en 50% voor patiënten die straling ontvangen therapie2. Omdat prostaatkanker afhankelijk van androgeen signalering voor groei is, zijn chirurgische en chemische castratie therapieën ook werkzaam voor met een hoog risico patiënten. Echter, Herval gebeurt wanneer de kanker niet langer op androgeen ontbering therapie, reageert zoals blijkt uit de biochemische herhaling, waar de prostaat-specifiek antigen in serum weer opkomt. Op dit punt in de progressie, worden metastasen vaak gedetecteerd als goed. Deze geavanceerde fase, genaamd metastatische castratie-resistente prostaatkanker, vertegenwoordigt de dodelijke vorm van de ziekte waar de prognose een gemiddelde overlevingstijd van minder dan twee jaar3 is. Enkele behandelingsopties zijn beschikbaar in laat-stadium ziekte, met inbegrip van de tweede generatie antiandrogens zoals enzalutamide en abiraterone, evenals chemotherapie op basis van taxane zoals docetaxel. Ondanks de beschikbare behandelingen verloopt de ziekte vaak. Daarom, de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe behandelmodaliteiten zijn noodzakelijk voor het verbeteren van de zorg van prostaatkanker patiënten met gevorderde ziekte.

De Spectrometrie van de massa (MS)-gebaseerde benaderingen bieden een globale analyse van de Proteoom via de detectie van honderden tot duizenden peptide analyten4. In het bijzonder kan de ontdekking proteomics, ook bekend als gegevens-afhankelijke acquisition (DDA), de identificatie en kwantificatie van duizenden peptiden4,5opleveren. Op basis van MS ontdekking proteomics kan verder worden afgebakend in de top-down proteomics, waar intact eiwitten worden gekenmerkt, en onderop (ook bekend als shotgun) proteomics, waar peptides worden geanalyseerd om te karakteriseren eiwitten5. Dus, in shotgun proteomics, een proteolyse stap vindt plaats in de bereiding van de monsters voorafgaande aan de MS-analyse te klieven van eiwitten in peptiden. Aan het eind, een database opzoeking uitgevoerd om de peptiden kaart terug naar de eiwitten voor identificatie. Label-vrije evenals zo verschillende isotopen-labeling [bijvoorbeeld, stabiele isotoop labelen door aminozuren in de cultuur van de cel (SILAC)] kunnen methoden worden gebruikt kwantitatief vergelijken peptiden tussen monsters6,7. Terwijl isotoop labeling technieken de gouden standaard zijn, label-vrije methoden hebben aangetoond vergelijkbare kwantificering nauwkeurigheden8,9 en vergelijkbare compromissen tussen de gevoeligheid en specificiteit10hebben. Label-vrije kwantificatie biedt grotere dekking en vergunningen van vergelijkingen tussen de vele meer monsters, overwegende dat etiket gebaseerde methoden worden begrensd door kosten en multiplexing capaciteiten6,–7,8.

Bovendien, shotgun MS kan ook worden gebruikt om te ondervragen posttranslationele modificaties (PTMs) zoals fosforylatie11. Als gevolg van de lagere stoichiometrische aard van phosphopeptides in vergelijking met de totale peptiden, zijn verschillende methoden tewerkgesteld te verrijken voor phosphopeptides, met inbegrip van antilichaam gebaseerde immunoprecipitation van phosphotyrosine (pY) peptiden, titaandioxide (TiO2 ), en metal affinity chromatografie (IMAC)5,12geïmmobiliseerd. Omdat proteïne fosforylatie een belangrijke stap in vele cel signaling pathways is, shotgun Fosfoproteomics kan onderzoekers te onderzoeken van de cel die veranderingen in verschillende soorten kanker, waaronder borstkanker13prostaat14, renale15, signalering en ovariële,16,17 Kankerbiologie beter te begrijpen en identificeren van potentiële nieuwe streefcijfers voor therapie.

Deze label-vrije shotgun phosphoproteomic methode werd gebouwd en verfijnd op basis van eerdere werkzaamheden door de Graeber groep18,19,20. Dit protocol begint met een beschrijving van de winning en de vertering van eiwitten en phosphoproteins van weefsel in peptiden. We dan detail de verrijking van pY peptiden met behulp van specifieke phosphotyrosine antilichamen en TiO2. Ook beschrijven we de verrijking van phosphoserine/threonine (pST) peptiden met sterke cation exchange (SCX) gevolgd door TiO2. Dit protocol wordt afgesloten met de indiening van de monsters naar een MS-faciliteit en het gebruik van de software van de analyse van de MS te identificeren en kwantificeren van de phosphopeptides en hun overeenkomstige phosphoproteins. De toepassing van dit protocol kan verder reiken dan prostaatkanker in de velden buiten oncologie en andere kankers.

Protocol

Experimenten met behulp van xenograft tumoren zijn goedgekeurd door de Rutgers Universiteit institutionele Animal Care en gebruik Comité als set weer onder de richtlijnen van de National Institutes of Health. 1. eiwit extractie Bereiden lysis-buffermengsel (tabel 1). (Het volume is afhankelijk van het aantal monsters te worden geoogst.) Voor in vitro celsteekproeven, gaat u verder naar stap 1.2. Voor tumor weefsel, gaat u verder naar stap 1.3. Oogsten van cellen Verzamelen van de cellen in een conische tube van 50 mL en draaien ze bij 700 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en houden de pellet op ijs. Herhaal deze stap voor alle gerechten om te verzamelen van de cellen in een pellet. (Meestal ongeveer 5 bijna confluente 15 cm schotels van cellen die nodig zijn voor 5 mg van eiwit, maar dit kan afhankelijk van de cellijn en moet empirisch worden bepaald door elke onderzoeker.) Het wassen van de pellet met 30 mL van gekoelde-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en spin bij 700 x g gedurende 5 min bij 4 ° C vóór aspirating de PBS. Voeg 1,5 mL lysisbuffermengsel per 5 mg eiwit gebruikt om de cel-pellet. Pipetteer omhoog en omlaag een paar keer. Ga verder met stap 1.4. Oogsten van weefsels Weeg de tumor en voeg 2 mL ijskoud lysis-buffermengsel voor elke 100 mg van weefsel in een reageerbuis cultuur. (Meestal 50 tot 150 mg weefsel versgewicht is vereist.) Meng de lysate met behulp van een handbediende of benchtop homogenizer (pulse 2 x voor 15 s.) Reinig de homogenizer vóór het eerste monster, en tussen de monsters met behulp van 10% bleekwater, 70% ethanol en gedeïoniseerd water achter elkaar. Te verminderen en alkylate, Verwarm de gehomogeniseerde monsters bij 95 ° C gedurende 5 min. Koel ze dan op ijs gedurende 15 minuten. Op het ijs, bewerk ultrasone trillingen ten de lysate 3 x (d.w.z., pulse voor 30 s met 60 s pauzes tussen pulsen). Het monster mag geen viskeuze of clumpy op dit punt. Verwarm de lysate bij 95 ° C gedurende 5 min21. Centrifuge de lysate in de dezelfde ultrasoonapparaat buis met behulp van een schommel emmer rotor bij 3500 x g bij 15 ° C gedurende 15 minuten het supernatant verzamelen en gooi de pellet. Bepaal de concentratie van de eiwitten door het uitvoeren van de een Bradford assay22. Eventueel verdunnen de lysate tot 5 mg/mL met een lysis-buffermengsel. Bewaar het bij-20 ° C.Opmerking: Het experiment kan hier worden gepauzeerd. Bevriezen van de monsters bij-80 ° C en blijft op een later tijdstip. 2. lysate spijsvertering Verdun de steekproef 12-fold met behulp van 100 mM Tris (pH = 8,5) te verminderen van de hoeveelheid guanidinium. Verdun alle monsters hetzelfde volume aan het minimaliseren van de effecten van de ongelijke spijsvertering. Bespaar 12,5 µg de onverteerd lysate te bevestigen op een gel Coomassie gebeitste23. Voor 5 mg eiwit, toevoegen van 10 µg Lysyl Endopeptidase (Lys-C) en na het bebroeden bij kamertemperatuur voor 5-6 h. aanpassen pH tot 8,0 door untitrated toevoeging van 1 M Tris (pH ~ 11). Bereiden van 1 mg/mL L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloormethyl keton (TPCK)-trypsine in 1 mM HCl (met 20 mM CaCl2) behandeld. Voeg de trypsine op een trypsine: eiwitverhouding van 1:100 en het incuberen bij 37 ° C gedurende 3 uur. Voeg de dezelfde hoeveelheid verse trypsine zoals in stap 2.3. Incubeer bij 37 ° C’s nachts het. Bespaar 12,5 µg de verteerd lysate te bevestigen de volledige spijsvertering op een gel Coomassie gebeitste23. 3. omgekeerde fase extractie Record het lysate volume. Het filteren van het monster met behulp van een 15 mL 10 kDa cutoff filter. Centrifugeer het monster bij 3500 x g gebruikend de schommel emmer rotor (of 3.500 x g in een vaste hoek rotor) bij 15 ° C, totdat het volume retentate minder dan 250 µL is (dit duurt ongeveer 45-60 min). Verzamel de doorstroming en negeren de retentate.Opmerking: Het experiment kan hier worden gepauzeerd. Bevriezen van de monsters bij-80 ° C en blijft op een later tijdstip. Voeg om breng het monster, ongeveer 20 µL van 5% trifluorazijnzuur (TFA) per mL lysate. Meng ze goed en meten van de pH van het monster met behulp van pH strips. Breng de pH aan 2.5 met 5% TFA. Sluit het kortere uiteinde van een C-18 kolom aan een vacuüm variëteit. Stel het vacuüm tussen 17 en 34 kPa (of volgens de instructies van de fabrikant). Met behulp van glas pipetten, natte de kolom met 3 mL 100% acetonitril (ACN). Laat niet de kolom droog. Gebruik glas equilibreer pipetten, de kolom met 6 mL 0,1% TFA als 2 x 3 mL toegepast. Laad het aangezuurde monster in de kolom. Voeg niet meer dan 3 mL tegelijk. Aanpassen van het vacuüm te richten op ongeveer 1 tot 2 druppels per seconde. Gebruik glas was pipetten, de kolom met 9 mL 0,1% TFA als 3 x 3 mL toegepast. De kolom met 2 mL van 40% Elueer ACN, 0,1% TFA. Twee breuken van 2 mL in glazen cultuur buizen verzamelen. Gooi de kolom. Dekking van het eluaat buizen met parafilm en punch van 3-5 gaten op de cover met behulp van een naald van 20G. Bevriezen van het eluaat op droog ijs gedurende ten minste 30 minuten totdat het volledig effen. Lyophilize de breuken ‘s nachts. De volgende dag, door ervoor te zorgen dat de monsters volledig droog zijn voordat u stopt de lyophilizer. Opslaan van de buizen in een tube 50 mL kegelvormig met delicate doekjes bij-80 ° C.Opmerking: Het experiment kan hier worden gepauzeerd. 4. Immunoprecipitation en verrijking van pY peptiden24 Resuspendeer de gelyofiliseerd poeder met 0,5 mL ijskoud immunoprecipitation (IP) bindende buffer in elke fractie. Bundelen van de breuken door overdracht van het volume van 0,5 mL resuspensie van het tweede deel op de eerste breuk en sla het uiteinde van de pipet. Krachtig vortex (in plaats van op en neer pipetteren) om ervoor te zorgen dat het monster volledig is opgelost voordat over te dragen aan een 3,6 mL schroefdop cryotube. Zoals in stap 4.1., spoel de lyofilisatie buizen met een andere 0,5 mL buffer (tabel 1) bindende IP in elke buis. Breng de oplossing aan de 3.6 mL schroefdop buis met behulp van de dezelfde Pipetteer tip om te minimaliseren van de schade van de steekproef. Herhaal de spoeling 1 x meer, waardoor het uiteindelijke resuspensie volume 2 mL (voor 5 mg van eiwitten). Wordt de pH van de steekproef om ervoor te zorgen dat het is ongeveer 7.4. Als het te zuur, voeg iteratief 10 µL van 1 M Tris (untitrated, pH ~ 11). Als het te basic, iteratief Voeg 10 µL van verdunde HCl (1:25 of 1:100). Vooraf wassen de pY kralen (voor 5 mg beginnen lysate) 25 µg van 4 g 10 antilichaam en 27B10.4 antilichaam 12,5 µg zijn per monster nodig. Pipetteer met een gesneden tip om overdracht van de antilichamen in aparte microcentrifuge buizen, wassen van de antistoffen met 450 µL van ijskoude IP-bindende buffer 2 x na het gebruik van een p200. Centrifugeer ze bij 100 x g voor 1 min bij 4 ° C en aspirate uit het supernatant. Resuspendeer de kralen aan een voorraad concentratie van 0,5 mg/mL met behulp van IP-bindende buffer. (Doen niet vortex de parels.) Na aliquoting de nodige drijfmest (50 µL van 4 g 10 antilichaam drijfmest en 25 µL 27B10.4 antilichaam gier per monster) in een enkele buis, spin down de voorraad centrifuge buizen bij 200 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C. De zijwanden met supernatant wassen voordat hij terugkeerde van de kralen naar opslag in de ijskast. Vooraf gewassen pY kralen aan de geresuspendeerde monsteroplossing in de schroefdop cryotubes toevoegen. Hen bij 4 ° C op een eind over rotator na een nacht bebroeden. Plaats de schroefdop cryotubes in een 50 mL centrifugebuis bekleed met een delicate veeg. Spin down de kralen bij 100 x g gedurende 1 min. Sla het supernatant, die zal worden gebruikt om te verrijken voor pST peptides. (De verrijking voor pST begint bij stap 7 en parallel aan de pY peptide verwerking kan worden uitgevoerd). Resuspendeer de kralen met 300 µL van IP-bindende buffer. Overbrengen naar een tube van 2 mL microcentrifuge en draai ze naar beneden bij 100 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C. Spoel de incubatie tube 3 x met 200 µL van IP-bindende buffer. Breng de inhoud aan de buis Microcentrifuge hetzelfde elke keer. Draai vervolgens aan hen neer. Wassen de kralen in de microcentrifuge 3 x met 500 µL van IP-bindende buffer buis en draai ze naar beneden bij 100 x g gedurende 1 minuut. Daarna wassen de kralen 4 x met 450 µL van 25 mM NH4HCO3, pH 7.5 en draai ze naar beneden bij 100 x g gedurende 1 min. gebruik een vers 25 mM NH4HCO3 -oplossing van poeder telkens. Centrifugeer de kralen bij 1.500 x g gedurende 1 min. gebruik een gel-laden tip het supernatant om volledig te verwijderen door dompelen de tip van de gel-laden tip lichtjes onder de parels oppervlak. Toevoegen van 4 x het volume van de parel van 0,1% TFA aan de kralen (d.w.z., voeg 300 µL van 0,1% TFA voor pY kraal drijfmest 75 µg). Meng ze goed en Incubeer het mengsel in een thermomixer bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 15 minuten bij 37 ° C. De resuspensie overbrengen in een 0,2 µm spin filter. Snel draai onderaan de elutie buis en het restvolume overbrengen in de zelfde draai filter met behulp van een pipet P10. Spin down de filter van de draai op 850 x g voor 1 min. de elutie overbrengen in een lage binding aan eiwitten – microcentrifuge buis. Vacuüm concentreren het eluaat volledig in ‘s nachts bij 40 ° C en met een tijd van de warmte van 300 min.Opmerking: Het experiment kan hier worden gepauzeerd. Bevriezen van de monsters bij-80 ° C en blijft op een later tijdstip. 5. titaandioxide verrijking25 van pY Peptides Resuspendeer de gedroogde neer phosphopeptides in 200 µL van 50% ACN, 0,1% TFA. Vortex samen en centrifugeer ze bij 10.000 x g voor 30 s. herhalen dit 1 x resuspendeer hen goed. Voorbereiding van de TiO2 kralen in tips die een capaciteit voor 200 µL monsters hebben opgenomen. Zachtjes Tik op de kleine tip-kant van de tip om het materiaal naar dat einde. Spoel de tip door toevoeging van 200 µL van 100% ACN, gevolgd door het omkeren van de tip en flicking de kleine einde te verplaatsen van de vloeistof naar het GLB. Met behulp van een scheermesje, knip het kleine puntje van de tip en plaats deze over een geringe binding aan eiwitten buis. (Vermijd het gebruik van polystyreen buizen zoals de TiO2 aan de zijkanten van de buis vasthouden zal.) Verwijder de dop en voeg een micropipet om te duiken uit de resterende ACN. Herhaal het wassen met 200 µL van 100% ACN. De TiO2 kralen zijn nu gevestigd in de lage binding aan eiwitten buis voor de volgende stappen. Voorwaarde van TiO2 met 500 µL van 100% ACN 2 x. Pipetteer het mengen van de kralen met oplosmiddel. Centrifugeer ze bij 100 x g voor 1 min. Voorwaarde van TiO2 met 500 µL van 0,2 M natriumfosfaat buffer (pH ~ 7) 2 x. Wassen de kralen met 300 µL van evenwichtsinstelling buffer 3 x. Omdat TiO2 zeer dichte is, zal de kralen snel regelen. Voeg 400 µL van 50% ACN, 0,1% TFA in de lage binding aan eiwitten buis, gevolgd door toe te voegen 84 µL van melkzuur. Overdracht van de geresuspendeerde phosphopeptides in de lage binding aan eiwitten buis en hen Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met behulp van een eind over rotator. Centrifugeer de kralen bij 100 x g gedurende 1 min naar pellet hen. Ze wassen met 300 µL van evenwichtsinstelling buffer (tabel 1) 2 x en draai ze naar beneden bij 100 x g gedurende 1 minuut. Spoel de kralen met 300 µL van het spoelen buffer 2 x. Overbrengen naar een filter van de draai 0,2 µm. Draaien ze bij 1.500 x g gedurende 1 minuut. De filter eenheid overbrengen in een schone 1,5 mL lage binding aan eiwitten buis. Elueer de inhoud 2 x met 200 µL van 0,9% NH3 H2O. maatregel de pH met pH strips, die tussen 10 en 11 moet. Vacuüm concentreren het eluaat volledig ‘s nachts te verdampen de ammoniak. 6. ontzouten pY peptiden voor MS Analyses Reconstrueren van de phosphopeptides met 15 µL van 0,1% TFA door vortexing en centrifugeren hen bij 10.000 x g gedurende 30 s tot resuspendeer hen. Herhaal deze 1 x resuspendeer hen goed. Pipetteer niet op en neer. Reinigen van het monster met behulp van een C-18-tip met een bindende capaciteit van 5 µg en volg de fabrikant protocol. Volledig droog het elutievolume door het vacuüm concentratie. Dit duurt 1-2 h. resuspendeer de gedroogde phosphopeptides in 12,5 µL van massaspectrometrie oplossing (Zie tabel 1) (of zoals aanbevolen door het researcher’s MS kern proteomics facility). Vortex en kort draaien de oplossing neer op 10.000 x g voor 30 s. Herhaal dit 2 x naar resuspendeer hen goed. De monsters zijn klaar voor de indiening van een faciliteit van de Spectrometrie van de massa (stap 11).Opmerking: De volgende stappen zijn gerelateerd aan pST peptide verrijking alleen. 7. omgekeerde fase extractie van pST peptiden Het meten van de concentratie van de peptide van het supernatans dat vanaf stap 4.6 verworven door een peptide-test uit te voeren. Een voldoende bedrag voor de Spectrometrie van de massa van de pST is 2,5 mg. Breng de pH op 3.5 met 5% TFA. Sluit het kortere uiteinde van een C-18 kolom aan een vacuüm variëteit. Stel het vacuüm tussen 17 en 34 kPa (of volgens de instructies van de fabrikant). De kolom met 3 mL voor 100% NAT ACN. Laat niet de kolom droog. De kolom met 6 mL 0,1% TFA als 2 x 3 mL toegepast equilibreer. Laad het aangezuurde monster in de kolom. Voeg niet meer dan 3 mL tegelijk. Aanpassen van het vacuüm te richten op ongeveer 1-2 druppels per seconde. Was de kolom met 9 mL 0,1% TFA als 3 x 3 mL toegepast. De kolom met 2 mL van 40% Elueer ACN, 0,1% TFA. Twee breuken van 2 mL in glazen cultuur buizen verzamelen. Gooi de kolom. Dekking van het eluaat buizen met parafilm en punch van 3-5 gaten op de cover met behulp van een naald van 20G. Bevriezen van het eluaat op droog ijs gedurende ten minste 30 minuten totdat het volledig effen. Lyophilize de geselecteerde breuken ‘s nachts. De volgende dag, door ervoor te zorgen dat de monsters volledig droog zijn voordat u stopt de lyophilizer. Opslaan van de buizen in een tube 50 mL kegelvormig met delicate doekjes bij-80 ° C.Opmerking: Het experiment kan hier worden gepauzeerd. 8. sterke Cation Exchange (SCX) van pST peptiden Resuspendeer de gelyofiliseerd peptiden in 2 mL zuiver Buffer A (tabel 1). Zwembad de breuken voor elk monster. (De oplossing zal zijn bewolkt.) Voorbereiden op het vacuüm variëteit. Een kolom SCX verbinden met een spuit met 3 mL met de plunjer verwijderd. Stel het vacuüm tussen 17 en 34 kPa (of volgens de instructies van de fabrikant). Voorwaarde voor de kolom SCX met 4 mL van ACN, gevolgd door 4 mL Buffer A. De 2 mL van het monster uit stap 8.1 laadt en verzamelen van het eluaat onmiddellijk. Laden van 3 mL buffer van de A:B (80.9:19.1) en het verzamelen van het eluaat. Zwembad de eluaten van elk monster en aliquoot hen in 2 mL lage binding aan eiwitten buizen. Vacuüm concentreren alle monsters tot ongeveer 30% van het volume blijft. (Deze stap duurt ongeveer 2-4 h.) Zwembad de aliquots in 1 laag binding aan eiwitten buis voor elk monster. Sluit het kortere uiteinde van een C-18 kolom aan een vacuüm variëteit. Stel het vacuüm tussen 17 en 34 kPa (of volgens de instructies van de fabrikant). De kolom met 3 mL voor 100% NAT ACN 2 x. Doen niet laat de kolom droog. De kolom met 3 mL 0,1% equilibreer TFA 2 x. Laad het monster in de kolom. Voeg niet meer dan 3 mL tegelijk. Aanpassen van het vacuüm te richten op ongeveer 1-2 druppels per seconde. Was de kolom met 3 mL 0,1% TFA 2 x. De kolom met 4 mL 50% Elueer ACN, 0,1% TFA. 9. titaandioxide verrijking van pST peptiden Voorbereiding van de TiO2 kralen vervat in tips die een capaciteit voor 200 µL monsters hebben Zachtjes tik aan de kant van de kleine tip van de tip om het verplaatsen van de kralen te dien einde. Verwijder de dop en giet de kralen in een conische buis van polypropyleen 15 mL. Spoel de tip door toevoeging van 200 µL van 100% ACN, omkeren de tip een paartijden en flicking de kleine einde te verplaatsen van de vloeistof naar het GLB. Met behulp van een scheermesje, knip het kleine puntje van de tip en plaats deze over de polypropyleen 15 mL conische buis. Verwijder de dop en voeg een micropipet om te duiken uit de resterende ACN. Herhaal het wassen met 200 µL van 100% ACN. De TiO2 kralen zijn nu gevestigd in de conische tube van 15 mL voor de volgende stappen. Voorwaarde van TiO2 met 500 µL van 100% ACN 2 x. Pipetteer het mengen van de kralen met oplosmiddel. Centrifugeer ze bij 100 x g voor 1 min. Voorwaarde TiO2 met 500 µL van 0,2 M natriumfosfaat buffer (pH ~ 7) tweemaal. Wassen de kralen met 300 µL van evenwichtsinstelling buffer 3 x. Breng de eluted phosphopeptides in de conische buis van polypropyleen 15 mL. Voeg 560 µL van melkzuur en het Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met behulp van een eind over rotator. Centrifugeer het mengsel bij 100 x g gedurende 1 minuut aan de pellet de kralen. Ze wassen met 300 µL van evenwichtsinstelling buffer (tabel 1) 3 x. Draai ze naar beneden bij 100 x g gedurende 1 minuut. Spoel de kralen met 300 µL van het spoelen buffer 2 x. Overbrengen naar een filter van de draai 0,2 µm. Draai ze naar beneden bij 1.500 x g gedurende 1 minuut. De filter eenheid overbrengen in een schone 1,5 mL lage binding aan eiwitten buis. Elueer de inhoud 2 x met 200 µL van 0,9% NH3 H2O. Laat de oplossing zitten op de phosphopeptides gedurende 2 minuten voordat eluerende hen. Het meten van de pH, die tussen 10 en 11 moet. Vacuüm concentreren het eluaat volledig ‘s nachts te verdampen de ammoniak. 10. ontzouten pST peptiden voor MS Analyses Zachtjes Tik op de kleine tip-kant van de tip om het materiaal naar dat einde. Spoel de tip door toevoeging van 200 µL van 100% ACN, gevolgd door het omkeren van de tip en flicking de kleine einde te verplaatsen van de vloeistof naar het GLB. Met behulp van een scheermesje, knip het kleine puntje van de tip en plaats deze over een conische buis van polypropyleen 15 mL. Verwijder de dop en voeg een micropipet om te duiken uit de resterende ACN. Herhaal het wassen met 200 µL van 100% ACN. De kralen TiO2 bevinden zich nu in de polypropyleen 15 mL conische buis voor de volgende stappen. Reinigen van het monster met behulp van een C-18-tip met een bindende capaciteit van 100 µg. (volg de instructies van de fabrikant.) Volledig droog het elutievolume door het vacuüm concentratie. Dit duurt 1-2 h. Resuspendeer de gedroogde phosphopeptides in 12,5 µL van massaspectrometrie oplossing (of zoals aanbevolen door het researcher’s MS proteomics kern faciliteit). Vortex samen en centrifugeer ze bij 10.000 x g gedurende 30 s. Herhaal 2 x tot resuspendeer hen goed. (Niet Pipetteer omhoog en omlaag.) 11. massaspectrometrie analyse Dienen de monsters naar de MS proteomics kern faciliteit voor het uitvoeren van de vloeibare chromatografie-tandem MS (LC-MS/MS) met behulp van de aanbevolen instellingen. Voorbeeld van instelling zijn als volgt (Zie tabel 2 voor de samenvatting): Laden van 5 µL van de monsters op de kolom van een val (2 cm lang x 75 µm diameter) en spoel ze met 0,1% TFA gedurende 5 minuten met een debiet van 5 µL/min. Breng de val in overeenstemming met een nano analytische kolom (20 cm x 75 µm) met een debiet van 300 nL/min. De gesegmenteerde lineaire verlopen (een percentage van 0,16% 80% mierenzuuroplossing ACN in 0,2% mierenzuur) verschillen tussen de pY en pST monsters: Voor de monsters pY, Elueer met behulp van een helling van 4-15% in 5 min, 15-50% in 40 min en 50-90% in 5 min. Voor pST monsters, Elueer met behulp van een helling van 4-15% in 30 min, 15-25% in 40 min 25-50% in 44 min en 50-90% in 11 min. Verwerven van MS gegevens in gegevens-afhankelijke overname modus met een cyclische serie van te volmondig scannen met een resolutie van 120.000 gevolgd door MS/MS (HCD, relatieve botsing energie van 27%) van de 20 meest intense ionen en de duur van een dynamische uitsluiting van 20 s. Na de MS uitvoeren van voltooiing, door de MS raw-bestanden te importeren in een MS-analyse softwareprogramma voor het identificeren en kwantificeren van de phosphopeptides. (MaxQuant software8,26,27 werd gebruikt in dit experiment. Tenzij vermeld in tabel 3, werden de standaardinstellingen gebruikt.)

Representative Results

Dit protocol beschrijft in detail een methode voor de extractie van het eiwit en de spijsvertering gevolgd door phosphopeptide verrijking en latere MS analyse (Figuur 1). De composities van alle buffers en oplossingen die worden gebruikt in dit protocol zijn vermeld in tabel 1. De sequentiële gebruik van Lys-C en trypsine biedt een efficiënte spijsvertering. Een gel voor het Coomassie gebeitste van vooraf verteerd lysate bevestigt de aanwezigheid van eiwitten, terwijl de volledige spijsvertering (figuur 2A) kleuring van post verteerd lysate bevestigt. Voor een volledige spijsvertering, moeten geen banden verschijnen boven 15 kDa, behalve de 30 kDa en 23.3 kDa bands voor Lys-C en trypsine, respectievelijk. De toevoeging van Lys-C vermindert ook het aantal gemiste breuklijnen (figuur 2B). Omdat pY peptiden slechts 2% van de phosphoproteome28 vertegenwoordigen, is immunoprecipitation van de pY peptiden met behulp van een pY-specifieke antilichaam de eerste stap van pY peptide verrijking. Het resulterende supernatant wordt de ingang voor pST peptide verrijking. De immunoprecipitation pY scheidt effectief pY peptiden pST peptiden waar gemiddeld 85% van de phosphopeptides van de voorbereiding van de pY aangegeven pY (Figuur 3 bis) en meer dan 99% van de phosphopeptides geïdentificeerd van de pST-voorbereiding zijn pST (figuur 3B). Titaandioxide wordt gebruikt om te verrijken voor phosphopeptides in beide preparaten. De verwachte percentage van peptiden in de voorbereiding van de MS-klaar die zijn phosphorylated is tussen de 30-50% (figuur 4A). De variabiliteit in de phosphopeptide verrijking percentage mag niet groter zijn bij de voorbereiding van de pY als gevolg van er veel minder pY peptiden dan pST peptiden. In termen van phosphopeptide soorten hebben de meerderheid van de phosphopeptides ontdekt een enkele of dubbele fosforyl-groep (figuur 4B). Na het uitvoeren van de Spectrometrie van de massa, worden de MS raw-bestanden geladen in de software van de analyse van een MS. De parameterinstellingen gebruikt in het experiment zijn vermeld in tabel 3 maar zal variëren van software om software en kunnen variëren van versie tot versie. De parameters die niet worden vermeld bleven als standaard, met inbegrip van een FDR cutoff van 1% voor overeenkomende peptide-spectrum (PSM) met een minimale score van Andromeda van 40 voor de identificatie van gemodificeerde peptiden27. Instellen van een localisatie waarschijnlijkheid cutoff van meer dan 0,75 filters uit ongeveer 5% van de pY peptiden en 15% en 34% van de pS en pT peptides, respectievelijk (figuur 5A). Na het toepassen van deze filters, is het verwachte aantal phosphopeptide identificaties aan het einde van de MS-analyse ongeveer 300 pY peptiden (voor 5 mg van het begin eiwit) en ongeveer 7.500 pS peptiden en 640 pT peptiden (voor 2,5 mg van de startende peptide bedragen) van de respectieve verrijking voorbereidingen (figuur 5B). Het aantal replicatieonderzoeken en de variabiliteit van de signaalsterkte van de phosphopeptide bepaalt voldoende drijven voor statistische vergelijkingen. In vier aparte experimenten met groepen met biologische duplicaten of triplicates, werden het percentage coëfficiënten van variatie (% CV) voor gedetecteerde phosphopeptides berekend. Distributies van lagere variabiliteit (b.v., pST groepen 1-5 in figuur 5C) geven aan dat de sample collectie, voorbereiding en massaspectrometrie punten consistent waren. Aan de andere kant, geeft de distributies van hogere variabiliteit (b.v., pST groep 6 in figuur 5C) luidruchtiger gegevens die zou vereisen grotere vouw-wijzigingen in het detecteren van significante verschillen in downstream differentiële analyses. Figuur 1: Werkstroomdiagram. Eiwitten van monsters zijn geëxtraheerd en verteerd. Peptides worden geëxtraheerd door vaste fase extractie (SPE) en phosphotyrosine (pY) peptiden zijn immunoprecipitated. Parallel, zijn de phosphoserine/threonine (pST) peptiden van het supernatant in de pY immunoprecipitation stap verrijkt. Sterke cation exchange (SCX) wordt uitgevoerd op de bovendrijvende vloeistof verwijderen zeer geladen peptiden ter vermindering van de ion onderdrukking12. Beide preparaten ondergaan phosphopeptide verrijking via titaandioxide (TiO2). Na monster schoonmaakbeurt, wordt vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) uitgevoerd voor het meten van de overvloed van phosphopeptide. De ruwe gegevens is vervolgens in een MS-analysesoftware te identificeren phosphopeptides geladen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: evaluatie van de spijsvertering. (A) drie monsters met 12,5 µg lysate pre vergisting, na-Lys-C spijsvertering en na trypsine spijsvertering worden getoond. Een Coomassie gel-vlek test toont aan een schoon spijsvertering na opeenvolgende gebruik van Lys-C en trypsine. Het molecuulgewicht (MW) grootte markers zijn in kilodaltons (kDa). (B) A vermindering van gemiste breuklijnen nadat Lys-C was toegevoegd aan het protocol wordt nageleefd. Het percentage van de phosphopeptides zonder gemiste breuklijnen verhoogd van 48 tot 64% en van 60% naar 84% gemiddeld voor pY en pST verrijking preparaten, respectievelijk. De grafieken bevatten een samenvatting van de gegevens die zijn verkregen uit twee experimenten uitgevoerd zonder Lys-C en vijf experimenten met Lys-C. De foutbalken worden standaarddeviaties vertegenwoordigen 38 pY en 38 pST monsters uit 2 aparte experimenten (zonder Lys-C) en 62 pY en 60 pST monsters van 5 aparte expermenteren (Lys-C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: verrijking van pY en pST phosphopeptides. Deze panelen tonen de percentages van pSTY phosphopeptides van ofwel (A) de pY of (B) de pST verrijking voorbereidingen. De pY verrijking door pY immunoprecipitation en titaandioxide resulteerde in 85% phosphopeptides wordt voor pY peptides, terwijl slechts 0,1% van de phosphopeptides in de verrijking van de pST pY. Deze waarden werden getrokken uit het onderzoek van de Phospho (STY)Sites.txt-bestand van een representatieve experiment na het uitfilteren van contaminanten, omgekeerde sequenties, en phosphopeptides met localisatie waarschijnlijkheden, minder dan 0,75. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: Phosphopeptide verrijking met titaandioxide. (A) het percentage van de gedetecteerde phosphopeptides (ten opzichte van de totale peptiden) van monsters in vier aparte experimenten wordt weergegeven. (B) dit paneel toont de gemiddelde samenstelling van mono-, tweepersoons- en multi-phosphorylated peptiden in vier aparte experimenten. De foutbalken in deelvenster A zijn standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: verwacht phosphoresidue identificaties. (A) dit paneel toont de waarschijnlijkheid van de fosforylatie-lokalisatie van IDs van pY verrijking (links) en pST verrijking (rechts). Het gemiddelde percentage van de id’s die voldoen aan de > 0,75 waarschijnlijkheid cutoff is 93%, 75% en 52% voor pY, pS en pT, respectievelijk. (B) het gemiddelde aantal id’s met een > 0,75 lokalisatie kans is 300 voor pY, 7.500 voor pS en 640 voor pT. (C) dit paneel toont viool percelen van het percentage variatiecoëfficiënt (% CV) van de phosphopeptides. Een evaluatie van % CV was alleen uitgevoerd als een signaal intensiteitswaarde in elke biologische repliceren of drievoudige groep werd ontdekt. Gegevens werd genomen uit vier afzonderlijke experimenten. Foutbalken in panelen A en B zijn de standaarddeviaties van 34 pY en 34 pST monsters uit 4 aparte experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Buffer Volume Samenstelling 6 M guanidinium chloride lysis-buffermengsel 50 mL 6 M guanidinium chloride, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM tris (2-carboxyethyl) Fosfine chloroacetamide van 40 mM, 2 mM natrium orthovanadate, 2.5 mM natrium pyrofosfaat, 1 mM β-glycerophosphate, 500 mg n-octyl-glycoside, ultra pure water naar volume 100 mM natrium pyrofosfaat 50 mL 2.23 g natrium pyrofosfaat decahydrate, ultra pure water naar volume 1M β-glycerophosphate 50 mL 15.31 g β-glycerophosphate, ultra pure water naar volume 5% trifluorazijnzuur 20 mL Voeg 1 mL voor 100% trifluorazijnzuur in 19 mL ultra puur water 0,1% trifluorazijnzuur 250 mL Voeg toe 5 mL 5% trifluorazijnzuur aan 245 mL ultra puur water pY elutie buffer 250 mL 0,1% trifluoroacetic acid, 40% acetonitril, ultra pure water naar volume pST elutie buffer 250 mL 0,1% trifluoroacetic acid, 50% acetonitril, ultra pure water naar volume IP-bindende buffer 200 mL 50 mM tris pH 7.4, 50 mM natriumchloride, ultra pure water naar volume 25 mM Ammoniumbicarbonaat, pH 7.5 10 mL 19.7 mg oplossen in 10 mL steriele ultra pure water, pH 7.5 met 1 N zoutzuur (~ 10-15 µL/10 ml oplossing), verse maken 1M fosfaatbuffer, pH 7 1000 mL 423 mL 1 M natriumfosfaat kaliumdiwaterstoffosfaat p.a. in water, 577 mL 1 M natriumfosfaat waterstof Evenwichtsinstelling buffer 14 mL 6.3 mL acetonitril, 280 µL 5% trifluorazijnzuur, 1740 µL melkzuur, 5.68 mL ultra puur water Spoelen van de buffer 20 mL 9 mL acetonitril, 400 µL 5% trifluorazijnzuur, ultra pure water 10,6 mL Massaspectrometrie oplossing 10 mL 500 µL acetonitril, 200 µL 5% trifluorazijnzuur, 9,3 mL ultra puur water Buffer A 250 mL 5 mM Monokalium fosfaat (pH 2.65), 30% acetonitril, 5 mM kaliumchloride, ultra-zuiver water naar volume Buffer B 250 mL 5 mM Monokalium fosfaat (pH 2.65), 30% acetonitril, 350 mM kaliumchloride, ultra pure water naar volume 0,9% ammoniumhydroxide 10 mL 300 μL 29.42% ammoniumhydroxide, 9.7 mL ultra puur water Tabel 1: Buffers en oplossingen. Deze tabel toont de composities van de buffers en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt. LC-MS/MS instellingen Met de parameter pY instelling pST instelling Monster laden (µL) 5 Laden van debiet (µL/min) 5 Kleurovergang debiet (nL/min) 300 Lineair verloop (percentage 0,16%, 80% mierenzuuroplossing ACN in 0,2% mierenzuur) 4 – 15% voor 5 min 4 – 15% voor 30 min 15 – 50% voor 40 min 15 – 25% voor 40 min 50 – 90% voor 5 min 25 – 50% voor 44 min 50 – 90% voor 11 min Volledige scanresolutie 120.000 Aantal van de meest intense ionen geselecteerd 20 Relatieve botsing energie (%) (HCD) 27 Dynamische uitsluiting (s) 20 Tabel 2: LC-MS instellingen. Dit is een voorbeeld van LC-MS instellingen in een typische shotgun phosphoproteomic experiment. De monsters werden geladen op een trap-kolom. De val kwam in lijn met een analytische kolom. Deze instellingen zijn geoptimaliseerd voor het gebruik van het systeem van de LC-MS vermeld in de tabel van materialen en reagentia. Deze instellingen zou moeten worden aangepast voor andere systemen LC-MS. MaxQuant parameterinstellingen Instelling Actie Groep-specifieke Parameters Type Type Selecteer standaard Veelheid Ingesteld op 1 Spijsvertering-modus Enzym Selecteer trypsine/P Max. gemiste breuklijnen Ingesteld op 2 Wijzigingen Variabele wijzigingen Toevoegen van Phospho (stal) Label-vrije kwantificering Label-vrije kwantificering Selecteer LFQ LFQ min. verhouding graaf Ingesteld op 1 Snelle LFQ Afvinken Diversen Opnieuw kwantificeren Afvinken Globale Parameters Sequenties FASTA bestanden Selecteer fasta bestand gedownload van UniProt Vaste wijzigingen Carbamidomethyl (C) toevoegen Adv. identificatie Match tussen punten Afvinken Het venster van de tijd van wedstrijd Ingesteld op 5 min Het venster van de tijd van uitlijning Ingesteld op 20 min Onbekende eigenschappen aanpassen Afvinken Eiwit kwantificering Min. verhouding graaf Ingesteld op 1 Maplocaties Aanpassen Tabel 3: MS analyse software instellingen. In MaxQuant, waren de groepsspecifieke en globale parameters in deze tabel geselecteerd of aangepast. Alle andere parameters bleef op standaard. Deze experimenten werden uitgevoerd met behulp van versie 1.5.3.30. De parameters kunnen verschillen van versie tot versie en van de software naar de software.

Discussion

Vóór gebruik makend van dit protocol te verrijken voor phosphopeptides, is een zorgvuldige afweging van de proefopzet kritisch. Het gebruik van biologische replicatieonderzoeken is een rendabeler gebruik van massaspectrometrie hulpbronnen dan technische wordt gerepliceerd. Het aantal replicatieonderzoeken die nodig zijn zal gedeeltelijk afhangen van de variabiliteit van de gegevens. Een recente studie aangetoond dat, terwijl het aantal replicatieonderzoeken voorbij drie slechts marginaal het aantal identificaties verhoogt, het aantal belangrijke identificaties tussen groepen stijgt met meer10repliceert.

Wegens de lagere overvloed van phosphoproteins in de cel zijn voldoende startende eiwit bedragen nodig zijn om een wereldwijde phosphoproteome van prostaatkanker monsters in de detectiemodus. In deze experimenten, werd 5 mg eiwit gebruikt. Ongeveer vijf bijna confluente 15 cm schotels van cellen bieden voldoende eiwit als input voor dit protocol, hoewel dit zal lijn-afhankelijke cel. Wat betreft de tumor weefsel is de verwachte opbrengst van eiwit ongeveer 6-8% van weefsel gewicht. In de in vitro -instelling is een positieve controlemonster te overwegen de toevoeging van 1 mM vanadate gedurende 30 minuten vóór het oogsten van de cellen. Vanadate, een concurrerende eiwit phosphotyrosyl fosfatase inhibitor, behouden de tyrosine fosforylering, waardoor het aantal pY peptide identificaties29.

Schone spijsvertering is een belangrijke stap om te maximaliseren phosphopeptide identificatie. Naast de Coomassie vlek test, kan het percentage van gemiste breuklijnen in de gegevens worden gebruikt om te evalueren van de efficiëntie van de vertering (Figuur 2). Kwaliteitscontrole software beschikbaar is die analyseert gemiste breuklijnen en andere statistieken te beoordelen kwaliteit30van de gegevens van de MS. Terwijl trypsine is dat de meest voorkomende, alternatieve proteasen zijn beschikbaar5 adres dekking hiaten in het proteoom waar optimale al peptiden kunnen niet worden gegenereerd31. De instellingen van de software van de analyse van de MS zou dan moeten worden aangepast om aan te passen voor wijzigingen in proteasen.

Het protocol maakt gebruik van immunoprecipitation (voor pY verrijking) evenals titaandioxide (TiO2) te verrijken voor phosphopeptides. Alternatieve benaderingen te verrijken voor peptides omvatten geïmmobiliseerdet metal affiniteitchromatografie (IMAC), andere metaaloxiden voor metaaloxide affiniteitchromatografie (Ignatandrei) zoals aluminium hydroxide en metaal-ion-polymeer gebaseerde affiniteit vastleggen (PolyMAC) 5,12. Eerdere studies hebben aangetoond dat verschillende verrijking methoden voor de verschillende populaties van phosphopeptides32verrijken. Bijvoorbeeld, verrijkt IMAC meer multi-phosphorylated peptiden terwijl Ignatandrei bij voorkeur voor mono-phosphorylated peptiden33 verrijkt. De Resultaten van de vertegenwoordiger van dit protocol weerspiegelen deze observatie (figuur 4B). Een recente publicatie aangetoond dat het combineren van IMAC en Ignatandrei met behulp van een hybride materiaal potentieel grotere dekking van phosphopeptide soorten34 bieden kan. Dus, dit protocol kan worden gewijzigd voor het gebruik van andere methoden van verrijking in parallel te maken voor nog meer uitgebreide analyses van de phosphoproteomic.

De MaxQuant26 softwaresuite wordt gebruikt voor het analyseren van de gegevens van de MS in dit protocol, maar i.c.m.35 zijn ook beschikbaar voor phosphopeptide identificatie en kwantificering. Voor de identificatie van de phosphopeptide, wordt een localisatie waarschijnlijkheid cutoff toegepast. Dit filter wordt uitgevoerd om voor phosphopeptides met een hoge betrouwbaarheid (dat wil zeggen, groter is dan 0.75) in10,28van de identificatie van de phosphoresidue te selecteren. Met andere woorden, is de opgeteld kans van alle andere residuen die potentieel de phospho-groep bevatten kunnen minder dan 0,25. Deze cutoff kan worden verhoogd om de striktheid van de selectie van de phosphopeptide. Met betrekking tot het aantal identificaties is het verwachte aantal pY peptiden in honderden, terwijl het verwachte aantal pST peptiden in de hoge duizenden. Deze waarden geven eerder waargenomen phosphoproteome distributie waar ongeveer 2%, 12% en 86% van de phosphosites pY, pT en pS, respectievelijk28 zijn.

Als de pY en pST verrijking stappen parallel worden uitgevoerd, kunnen de sample voorbereiding stappen in het protocol worden uitgevoerd in zes dagen. Door het in paren rangschikken met de krachtige tool van MS, bieden phosphopeptide verrijking protocollen zoals deze een totaalconcept voor wetenschappers voor het verzamelen van gegevens voor het analyseren van de phosphoproteome in hun respectievelijke onderzoeksgebieden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken de leden van de lab Drake voor het verstrekken van advies en inbreng op het manuscript. Wij danken ook de leden van de biologische massaspectrometrie faciliteit of Robert Wood Johnson Medical School en Rutgers, The State University of New Jersey, voor het verstrekken van advies en het uitvoeren van massaspectrometrie op onze voorbeelden. Larry C. Cheng wordt ondersteund door de National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder award nummer T32 GM008339. Thomas G. Graeber wordt ondersteund door het NCI/NIH (SPORE in prostaat kanker P50 CA092131; P01 CA168585) en een Amerikaans kanker maatschappij Research Scholar Award (RSG-12-257-01-FSME). Justin M. Drake wordt ondersteund door het departement van defensie prostaat kanker onderzoek programma W81XWH-15-1-0236, prostaat kanker Stichting Young Investigator Award, de New Jersey Health Foundation en een precisie geneeskunde initiatief Pilot Award van de Rutgers Kanker Instituut voor New Jersey.

Materials

Ultra-Low Temperature Freezer Panasonic MDF-U76V
Freezer -20 °C VWR scpmf-2020
Swing rotor bucket ThermoFisher Scientific 75004377
Vacuum manifold Restek 26080
Lyophilizer Labconco 7420020
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator Labconco 7810010
End-over-end rotator ThermoFisher Scientific 415110Q
Razor blade Fisher Scientific 620177
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Millipore Sigma UFC901024
Glass culture tubes Fisher Scientific 14-961-26
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
20G needle BD B305175
Kimwipes Fisher Scientific 06-666A
Screw cap cryotube ThermoFisher Scientific 379189
Nunc 15 mL conical tubes ThermoFisher Scientific 12-565-268
Gel loading tips Fisher Scientific 02-707-181
Millipore 0.2 µm spin filter Millipore Sigma UFC30GVNB
Low protein-binding Eppendorf tubes Eppendorf 22431081
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 Millipore Sigma 16101
27B10.4 antibody Cytoskeleton APY03-beads
Peptide assay kit Thermo Scientific 23275 Step 7
TopTip PolyLC Inc TT200TIO.96 Steps 5 and 9
SCX columns (PolySULFOETHYL A) PolyLC Inc SPESE1203
3 mL syringe BD 309657
Trifluoracetic Acid (TFA) Fisher Scientific PI-28904
Acetonitrile (ACN) Fisher Scientific A21-1
Lactic acid  Sigma-Aldrich 69785-250ML
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific A669S-500
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-500
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific BP510-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypsin, TPCK Treated Worthington Biochemicals LS003740
Lysyl Endopeptidase Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 125-05061
MonoTip PolyLC Inc TT200TIO.96 Step 10
ZipTip MilliporeSigma ZTC18S096 Step 6
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm Waters 186008794 Step 11: analytical column
Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns ThermoFisher Scientific 164535 Step 11: trap column
Ultimate 3000 RLSCnano System Dionex ULTIM3000RSLCNANO Step 11
Q Exactive HF ThermoFisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBFZ Step 11
MilliQ water deionized water used to prepare all solutions and bufferes
Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 sonicator
Polytron System PT Kinematica AG PT 10-35 GT homogenizer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  2. Paller, C. J., Antonarakis, E. S. Management of biochemically recurrent prostate cancer after local therapy: evolving standards of care and new directions. Clinical Advances in Hematology & Oncology. 11 (1), 14-23 (2013).
  3. Lowrance, W. T., Roth, B. J., Kirkby, E., Murad, M. H., Cookson, M. S. Castration-resistant prostate cancer: AUA guideline amendment 2015. The Journal of Urology. 195 (5), 1444-1452 (2016).
  4. Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nature Biotechnology. 28 (7), 710-721 (2010).
  5. Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chemical Reviews. 113 (4), 2343-2394 (2013).
  6. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
  7. Bantscheff, M., Lemeer, S., Savitski, M. M., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: critical review update from 2007 to the present. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (4), 939-965 (2012).
  8. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  9. Rubbi, L., et al. Global phosphoproteomics reveals crosstalk between Bcr-Abl and negative feedback mechanisms controlling Src signaling. Science Signaling. 4 (166), ra18 (2011).
  10. Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
  11. Rush, J., et al. Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells. Nature Biotechnology. 23 (1), 94-101 (2005).
  12. Fila, J., Honys, D. Enrichment techniques employed in phosphoproteomics. Amino Acids. 43 (3), 1025-1047 (2012).
  13. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  14. Drake, J. M., et al. Phosphoproteome integration reveals patient-specific networks in prostate cancer. Cell. 166 (4), 1041-1054 (2016).
  15. Lue, H. W., et al. Metabolic reprogramming ensures cancer cell survival despite oncogenic signaling blockade. Genes & Development. 31 (20), 2067-2084 (2017).
  16. Francavilla, C., et al. Phosphoproteomics of primary cells reveals druggable kinase signatures in ovarian cancer. Cell Reports. 18 (13), 3242-3256 (2017).
  17. Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
  18. Skaggs, B. J., et al. Phosphorylation of the ATP-binding loop directs oncogenicity of drug-resistant BCR-ABL mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (51), 19466-19471 (2006).
  19. Zimman, A., et al. Activation of aortic endothelial cells by oxidized phospholipids: a phosphoproteomic analysis. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2812-2824 (2010).
  20. Zimman, A., Berliner, J. A., Graeber, T. G. Phosphoproteomic analysis of aortic endothelial cells activated by oxidized phospholipids. Methods in Molecular Biology. , 53-69 (2013).
  21. Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  23. Meyer, T. S., Lamberts, B. L. Use of coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochimica el Biophysica Acta. 107 (1), 144-145 (1965).
  24. Bergstrom Lind, S., et al. Immunoaffinity enrichments followed by mass spectrometric detection for studying global protein tyrosine phosphorylation. Journal of Proteome Research. 7 (7), 2897-2910 (2008).
  25. Pinkse, M. W., Uitto, P. M., Hilhorst, M. J., Ooms, B., Heck, A. J. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Analytical Chemistry. 76 (14), 3935-3943 (2004).
  26. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  27. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  28. Olsen, J. V., et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 127 (3), 635-648 (2006).
  29. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. The Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  30. Bielow, C., Mastrobuoni, G., Kempa, S. Proteomics quality control: quality control software for MaxQuant results. Journal of Proteome Research. 15 (3), 777-787 (2016).
  31. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  32. Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Mueller, M., Domon, B., Aebersold, R. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nature Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
  33. Leitner, A., Sturm, M., Lindner, W. Tools for analyzing the phosphoproteome and other phosphorylated biomolecules: a review. Analytica Chimica Acta. 703 (1), 19-30 (2011).
  34. Yang, D. S., et al. Design and synthesis of an immobilized metal affinity chromatography and metal oxide affinity chromatography hybrid material for improved phosphopeptide enrichment. Journal of Chromatography A. 1505, 56-62 (2017).
  35. Al Shweiki, M. R., et al. Assessment of label-free quantification in discovery proteomics and impact of technological factors and natural variability of protein abundance. Journal of Proteome Research. 16 (4), 1410-1424 (2017).

Tags

PhosphoproteomePhosphopeptide EnrichmentLabel-free Quantitative Mass SpectrometryProstate CancerSignaling NetworksTherapeutic ResistanceLysis BufferHomogenizationReductionAlkylationSonicationCentrifugationTrypsin DigestionFilterAcidificationC18 ColumnVacuum Manifold

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cheng, L. C., Li, Z., Graeber, T. G., Graham, N. A., Drake, J. M. Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (138), e57996, doi:10.3791/57996 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image