На основе спаривания гиперэкспрессия библиотека скрининга в дрожжи

Многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae широко используется в фундаментальных научных исследований¹ понять клеточных процессов, непосредственно связанных с заболеваниями человека. Кроме того он был использован в качестве модельного организма для изучения человеческих болезней связанных белков, таких как те связаны с наиболее распространенными нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и амиотрофический Склероз (ALS)². Преимуществом дрожжевых модели является легкость, с которой геном широкий экран может выполняться для выявления клеточных пути, относящиеся к токсичности белков, связанных с заболеванием, таким образом давая понять механизм их токсичности. Один такой экран называется гиперэкспрессия библиотека экрана, в котором каждый из 5500 дрожжи генов в библиотеку выстроились превращается в модель дрожжи для определения, какие гены могут изменять токсичности при оверэкспрессировали. Этот метод отбора успешно применяется в моделях дрожжи несколько нейродегенеративные заболевания связанных белков, включая гентингтина для болезни Гентингтона³, α-synuclein для болезни Паркинсона^4,5 , Значения для болезни Альцгеймера⁶и Фу и TDP-43 ALS^7,8,9. Хотя обычно это делается в манере высок объём¹⁰, наиболее трудоемкий этап экрана индивидуально преобразования 5500 дрожжей гены от выстроились библиотеки. Этот шаг должен выполняться каждый раз, когда показ повторяется, и всякий раз, когда модель недавно созданной дрожжи необходимо изучить. Важно найти более эффективный способ для решения этой задачи.

Стабильно дрожжевых клеток может существовать в haploid и диплоидных форм. Существует два противоположных спаривания типы клеток haploid, спаривания типа и α. Haploid клетки каждого спаривания типа производят и выделяют их собственных конкретных спаривания феромонов, которому только напротив спаривания типа клетки реагируют. Это позволяет спаривания между и α клетки для производства стабильных диплоидных клетках, a/α. Этот процесс является спонтанным и высокоэффективных¹¹. Мы можем воспользоваться этой уникальной жизненного цикла S. cerevisiae представить библиотеку плазмиды. Говоря более конкретно каждый ген в библиотеке выстроились плазмиды будет преобразован в haploid клетки одного брачного типа, т.е., α клеток. Эти клетки, содержащие гены библиотека затем будут храниться на складе глицерина в формате выстроились 96-луночных. Для каждой модели дрожжей, который должен быть показан, дрожжевые клетки, содержащие гены библиотеки можно разморозить из глицерина запасов, и скрининга может быть сделано путем спаривания с моделью дрожжи интереса к противоположной спаривания, то есть, спаривания типа type. Эта идея использования спаривания объединить два генов в дрожжи не является новым. Она успешно применялась в высок объём дрожжей, которые скрининг 2 гибрида, в котором приманку (т.е., Gal4-ДНК связывающих домена сплавливания) построить в одном типе спаривания приняли участие путем спаривания с добычей конструкции из выстроились библиотеки ¹². Тем не менее, эта стратегия никогда не применялась в гиперэкспрессия библиотека фильмов, которые всегда использовали методы традиционной трансформации.

Наша лаборатория ранее установленные дрожжи модель ALS-связанные Белка FUS⁷. Через гиперэкспрессия библиотека скрининга с помощью метода преобразования мы обнаружили пять дрожжи генов(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1и VHR1), которые спасти токсичность FUS, когда оверэкспрессировали. Эти выводы были независимо подтверждены с аналогичного исследования другой группы⁸. hUPF1, человека гомолога ECM32, позднее было показано для подавления токсичности в первичной нейрональные клетки¹³ и в животной модели ALS¹⁴ также. Используя эти пять гены как подтверждение принципа, мы демонстрируем, что все пять гены аналогичным образом спасти FUS токсичности, когда они будут введены в модель дрожжи FUS путем спаривания. Поскольку дрожжи клетки, содержащие гены библиотека может хранятся постоянно на складе глицерина и возродил всякий раз, когда необходимо, этот метод, основанный на спаривание будет удалить времени шаг преобразования каждый раз, когда библиотека должна проверяться против. После спаривания высокоэффективных с без преобразования плазмида участвующих, эта стратегия также существенно снижает затраты, связанные с очищения и преобразования библиотеки большой плазмиды. Мы будем успешно применять этот метод в библиотеке, скрининг против дрожжи модели FUS.

Процедура отбора на основе спаривания кратко описана на рисунке 1. Первоначально выстроились плазмида библиотека превращается в haploid дрожжей спаривания типа α, с помощью протокола преобразования высокой пропускной способностью дрожжи в котором каждой скважины 96-луночных плиты содержит дрожжи преобразована с определенной библиотеки плазмиды. Эта коллекция преобразованные дрожжей сохраняется как глицерин запас, который может быть оттаяла и возродил для использования позже. Дрожжи модель интереса, в данном случае FUS токсичности, должен быть создан в haploid дрожжей с противоположным типом спаривания (спаривания типа). В духе высокой пропускной способности, с помощью стерильных 96-контактный репликаторы штамм FUS и штаммов дрожжей, содержащий библиотеку плазмида переданы 96-луночных пластины, содержащие богатые средства массовой информации и разрешено мат. После спаривания, небольшой объем от каждой скважины спаривания культуры передается 96-луночных пластины, содержащие синтетические отсева СМИ в котором только диплоидных дрожжи, содержащие оба FUS и библиотека гены могут расти. Роботизированная машина пятнистость затем используется для передачи культуры дрожжей от каждой скважины на плиты агара, где индуцируется выражение FUS и библиотека генов.  Кроме того дрожжевая культура выставляется для управления где FUS и библиотека гены не выразили плиты агара. После роста на плитах агара будут определены гены, которые спасти или усугубить FUS токсичности.