ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

שמרים ניצני האפייה כבר בשימוש נרחב כדי להבין תהליכים תאיים הקשורים ישירות מחלות אנושיות מחקר מדעי בסיסי¹ . יתר על כן, הוא שימש כאורגניזם מודל עבור לומד האדם הקשורים למחלה חלבונים, כגון אלה קשורה מחלות ניווניות הנפוצים ביותר, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, מחלת ניוון שרירים טרשת נפוצה לרוחב (ALS)². יתרון של המודל שמרים היא הקלות שבה ניתן לבצע מסך הגנום כולו כדי לזהות הסלולר מסלולים הקשורים הרעילות של חלבונים הקשורים למחלות, ובכך נותן תובנה מנגנון הרעילות שלהם. מסך אחד כזה נקרא מסך ספריה של ביטוי, שבו כל אחד הגנים שמרים 5,500 בספריה ערוכים הופכת מודל שמרים לזהות אילו גנים יכולים לשנות רעילות כאשר overexpressed. שיטה זו הקרנה יושם בהצלחה במודלים שמרים מרובות ניווניות הקשורות למחלות חלבונים, כולל huntingtin של מחלת הנטינגטון³, α-synuclein עבור מחלת פרקינסון^4,5 , Aβ עבור מחלת אלצהיימר⁶, ואת FUS TDP-43 ALS-^7,–^8,–⁹. בזמן זה נעשה בדרך כלל באופן תפוקה גבוהה¹⁰, השלב הכי מהגידולים של המסך בנפרד משתנה 5,500 גנים שמרים מספריה ערוכים. שלב זה חייב להתבצע בכל פעם שחוזר על עצמו ההקרנה, בכל פעם דוגמנית שהוקם שמרים צריך להילמד. חשוב למצוא דרך יעילה יותר כדי לבצע משימה זו.

תאי שמרים יכולה להתקיים stably בצורות הפלואידי והן דיפלואידי. ישנם שני מול ההזדווגות סוגים של תאים הפלואידי, הזדווגות סוג α. תאים הפלואידי של כל הזדווגות הקלד התוצרת, מפרישות פרומון ההזדווגות משלהם ספציפי, אשר מגיבים רק מול ההזדווגות סוג התאים. דבר זה מאפשר הזדווגות בין α תאים כדי לייצר תאים דיפלואידי יציב, / α. תהליך זה הוא ספונטני ויעיל מאוד¹¹. אנחנו יכולים לנצל את מחזור החיים הייחודי של cerevisiae ס כדי להציג את ספריית פלסמיד. ליתר דיוק, כל הגן בספריה פלסמיד ערוכים תעבור טרנספורמציה לתוך תאים הפלואידי של סוג ההזדווגות אחד, דהיינו, α התא. אלה תאים המכילים את הגנים ספריית ואז יאוחסנו במלאי גליצרול בתבנית 96-ובכן ערוכים. עבור כל דגם שמרים צריך להיות מוקרן, תאי שמרים המכיל את הגנים ספריה יכולה להיות הקרת מן המלאי גליצרול ולאחר ההקרנה יכול להיעשות באמצעות הזדווגות עם המודל שמרים עניין בסוג השני ההזדווגות, כלומר, סוג ההזדווגות. הרעיון של שימוש ההזדווגות כדי להפגיש את שני גנים לתוך שמרים אינו חדש. זה יושם בהצלחה בשמרים תפוקה גבוהה ההקרנה שני-היברידית, שבו פיתיון לבנות (קרי, Gal4-הדי-איגוד תחום fusions) בסוג אחד ההזדווגות הוא הביא יחד באמצעות הזדווגות עם מבנה טרף מספריה ערוכים ¹². אולם, אסטרטגיה זו מעולם לא הוחל ב ביטוי בספריה הקרנות, אשר תמיד השתמשו בשיטות מסורתיות טרנספורמציה.

המעבדה שלנו הקימה בעבר מודל שמרים של חלבונים הקשורים ALS FUS⁷. דרך ביטוי בספריה ההקרנה בשיטת טרנספורמציה גילינו חמש שמרים הגנים (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, ו VHR1) להציל את רעילות FUS כאשר overexpressed. ממצאים אלה שאושרו באופן עצמאי עם מחקר דומה על-ידי קבוצה אחרת⁸. hUPF1, homolog האנושית של ECM32, הוצגה מאוחר יותר לדכא את רעילות ראשי תאים עצביים¹³ , במודל חיה של ALS¹⁴ גם כן. באמצעות גנים חמש אלה כהוכחה עקרון, נדגים כי כל הגנים 5 בדומה להציל FUS רעילות כאשר הם יוכנסו המודל שמרים FUS על ידי הזדווגות. כיוון שמרים תאים המכילים את הגנים הספרייה יכולים להיות מאוחסנים לצמיתות במלאי גליצרול לתחייה בכל פעם שיש צורך, שיטה זו מבוססת על הזדווגות יסיר את הצעד גוזלת זמן של שינוי בכל פעם שהספרייה צריך להיות מוקרן נגד. מאז ההזדווגות היא יעילה במיוחד עם שינוי פלסמיד לא מעורב, אסטרטגיה זו פוחתת משמעותי גם את העלות המשויכת לטיהור ושינוי של ספרייה פלסמיד גדול. אנחנו יחולו בהצלחה בשיטה זו לספריית הקרנה נגד שמרים מודל של FUS.

התהליך להקרנה ההזדווגות מבוסס בקצרה מתואר באיור1. בתחילה, הספרייה פלסמיד ערוכים הופכת זן שמרים הפלואידי של הזדווגות מסוג α באמצעות פרוטוקול השינוי בתפוקה גבוהה שמרים שבו כל טוב של צלחת 96-ובכן מכיל שמרים טרנספורמציה עם פלסמיד ספריה ספציפית. זה אוסף של שמרים טרנספורמציה נשמרת מניה גליצרול כי ניתן הקרת לתחייה לשימוש מאוחר יותר. הדגם שמרים של עניין, רעילות FUS במקרה הזה, להפיקם בזן הפלואידי שמרים עם סוג ההזדווגות הנגדי (ההזדווגות סוג). באופן תפוקה גבוהה באמצעות המשכפלים 96 פינים סטרילי, הלחץ FUS ואת זני שמרים המכיל ספריית פלסמיד הועבר צלחות 96-ובכן המכיל מדיה עשירים, רשאי חבר. לאחר ההזדווגות, נפח קטן מכל טוב של התרבות ההזדווגות מועבר המכיל התקשורת הנשירה סינתטי אשר שמרים בלבד דיפלואידי המכיל שני FUS את הצלחות 96-ובכן, ספריית גנים יכולים לגדול. מכונת spotting רובוטית משמש לאחר מכן להעביר שמרים תרבות מכל קידוח על פלטות אגר שבו הביטוי FUS ואת הגנים ספריית מושרה.  בנוסף, תרבות שמרים הוא הבחין לשלוט פלטות אגר איפה FUS ואת הגנים הספרייה אינם מבוטאים. בעקבות גידול על פלטות אגר, הגנים או להחריף FUS רעילות יזוהו.