فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae كانت تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية الأساسية¹ فهم العمليات الخلوية التي تتصل مباشرة بالأمراض التي تصيب الإنسان. وعلاوة على ذلك، قد استخدمت ككائن نموذج لدراسة البروتينات البشرية المرتبطة بالمرض، مثل تلك المرتبطة بأمراض الأعصاب الأكثر شيوعاً، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون والجانبي الضموري ²من التصلب الجانبي (المرض). ميزة نموذج الخميرة هو السهولة التي يمكن أن يؤديها شاشة على نطاق الجينوم لتحديد المسارات الخلوية المتصلة بسمية البروتينات ذات الصلة بالمرض، مما يعطي نظرة ثاقبة إليه سميتها. شاشة واحدة من هذا القبيل يطلق على شاشة مكتبة overexpression، فيه كل من جينات الخميرة 5,500 في مكتبة أراييد تتحول إلى نموذج خميرة على تحديد الجينات التي يمكن تعديل السمية عند أوفيريكسبريسيد. هذا أسلوب الفرز قد طبقت بنجاح في نماذج الخميرة متعددة الأعصاب المرتبطة بالمرض البروتينات، بما في ذلك هونتينجتين لمرض هنتنغتون³، α-سينوكلين لمرض باركنسون^4،5 ، Aβ⁶من مرض الزهايمر، وفوس، ماساتشوستس-43 للمرض^7،،من⁸⁹. الخطوة كثيفة العمالة أكثر من الشاشة على حدة في حين أنه يتم عادة في طريقة الفائق¹⁰، هو تحويل جينات الخميرة 5,500 من مكتبة أراييد. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في كل مرة يتم تكرار الفحص، وكلما نموذجا خميرة المنشأة حديثا تحتاج إلى دراسة. من المهم إيجاد وسيلة أكثر كفاءة لإنجاز هذه المهمة.

[ستبلى] يمكن أن توجد خلايا الخميرة في أشكال فرداني والنباتات على حد سواء. هناك نوعان من المقابلة للتزاوج أنواع الخلايا فرداني، يزاوج نوع والخلايا α. فرداني للتزاوج كل نوع تنتج وتفرز فرمون التزاوج المحددة الخاصة بهم، التي تستجيب فقط الخلايا نوع التزاوج المعاكس. وهذا يسمح للتزاوج بين والخلايا α لإنتاج الخلايا ضعفاني مستقرة،/α. هذه العملية هي عفوية وذات كفاءة عالية¹¹. يمكن لنا أن نستفيد من هذه دورة حياة فريدة من نوعها S. cerevisiae لإدخال بلازميد المكتبة. وبشكل أكثر تحديداً، ستحول كل الجينات في مكتبة صفت بلازميد إلى الخلايا فرداني من نوع التزاوج واحد، أي، خلية α. سيتم تخزين هذه الخلايا التي تحتوي على جينات مكتبة ثم والغليسيرول الأسهم في شكل 96-جيدا أراييد. لكل طراز الخميرة التي تحتاج إلى فحص، يمكن إذابة خلايا الخميرة التي تحتوي على جينات مكتبة من المخزون والغليسيرول، ويمكن أن يتم الفحص عن طريق التزاوج مع نموذج الخميرة من اهتمام بالمقابل التزاوج نوع، أينوع التزاوج. هذه الفكرة من استخدام التزاوج للجمع بين اثنين من الجينات في الخميرة ليست جديدة. قد طبقت بنجاح في الخميرة الفائق الفرز الهجين اثنين، فيه بناء طعم (أي، Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال الأنشطار) في نوع التزاوج واحد جمعت عن طريق التزاوج مع بنية بري من مكتبة أراييد ¹²-غير أن هذه الاستراتيجية لم تطبق ابدأ في عروض مكتبة أوفيريكسبريشن، التي استخدمت دائماً طرق التحويل التقليدية.

قبل إنشاء مختبرنا نموذج خميرة فوس البروتين المرتبط بالمرض⁷. من خلال الفحص مكتبة أوفيريكسبريشن باستخدام أسلوب التحويل اكتشفنا خمس جينات الخميرة (ECM32، NAM8، SBP1، SKO1، و VHR1) أن إنقاذ سمية فوس عند أوفيريكسبريسيد. وتأكدت هذه النتائج بشكل مستقل مع دراسة مماثلة بآخر مجموعة⁸. وأبدى hUPF1، homolog الإنسان من ECM32، لاحقاً لقمع السمية في الخلايا العصبية الأولية¹³ وفي نموذج حيوان من المرض¹⁴ كذلك. باستخدام هذه الجينات الخمسة كدليل على المبدأ، علينا أن نبرهن أن الجينات خمس جميع المثل إنقاذ فوس السمية عند إدخالها في نموذج الخميرة فوس بالتزاوج. حيث يمكن تخزينها بشكل دائم في الأسهم والغليسيرول خلايا الخميرة التي تحتوي على جينات مكتبة وإحياء كلما دعت الحاجة، سيتم إزالة هذا الأسلوب القائم على التزاوج خطوة وقتاً طويلاً لتحويل كل مرة المكتبة بحاجة إلى فحص ضد. منذ التزاوج ذات كفاءة عالية بأي تحويل بلازميد المعنية، هذه الاستراتيجية أيضا إلى حد كبير يقلل التكلفة المرتبطة بتنقية وتحويل مكتبة بلازميد كبيرة. سوف نطبق هذا الأسلوب بنجاح إلى مكتبة الفرز ضد الخميرة نموذج فوس.

إجراء الفرز على أساس التزاوج يرد بإيجاز في الشكل 1. في البداية، تتحول إلى سلالة خميرة فرداني من التزاوج α نوع استخدام بروتوكول تحول الفائق خميرة التي يحتوي على كل من لوحة 96-جيدا جيدا الخميرة تحول مع بلازميد مكتبة محددة المكتبة بلازميد صفت. يتم حفظ هذه المجموعة من الخميرة المحولة كمخزون والغليسيرول يمكن إذابة وإحياؤها لاستخدامها في وقت لاحق. نموذج الخميرة من الاهتمام، في هذه الحالة سمية فوس، يجب أن يتم إنشاؤها في سلالة خميرة فرداني مع نوع التزاوج المعاكس (التزاوج نوع). في طريقة الفائق باستخدام معقم 96-دبوس مثاليان، سلالة فوس وسلالات الخميرة التي تحتوي على مكتبة بلازميد يتم تحويلها إلى لوحات 96-البئر الذي يحتوي على الوسائط الغنية، ويسمح لرفيقه. بعد التزاوج، كمية صغيرة من كل بئر الثقافة التزاوج يتم نقلها إلى 96-جيدا لوحات تحتوي على وسائط الإعلام التسرب الاصطناعية في الخميرة مثنوية فقط التي تحتوي على كلا فوس ومكتبة الجينات يمكن أن تنمو. ثم يتم استخدام جهاز اكتشاف روبوتية لنقل الثقافة الخميرة من كل بئر على لوحات أجار فيها فعل التعبير عن فوس والجينات المكتبة.  بالإضافة إلى ذلك، رصدت الثقافة الخميرة للتحكم في لوحات أجار حيث فوس والجينات مكتبة لا يعبر عن. في أعقاب النمو على ألواح أجار، سيتم تحديد الجينات التي إنقاذ أو تزيد من حدة سمية فوس.