Análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo

1. preparación para MS nativa de proteínas y complejos de proteína-ligando Nota: Para obtener una comprensión de la base molecular de un complejo proteico y ligando utilizando MS nativas, preparación de la muestra adecuada es clave. El objetivo de esta sección es destacar los pasos de preparación esencial muestra antes del análisis de MS con el complejo de HerA-NurA que ata la DNA y los nucleotides como ejemplo. Preparar 20 alícuotas μl del concentrado purificado de la proteína (típicamente 15-30 μm) en un tubo de 1,5 mL. Para el análisis de unión de ATP o ADPNota: Agregar concentraciones cada vez mayor de los no hidrolizables ATP adenosina analógica 5′-O-(3-thiotriphosphate), sal tetralithium (ATP-γ-S) o 5-difosfato de adenosina (ADP). No hidrolizables ATP generen un complejo estable que permitiría la proteína ATP-limite ser capturado. Otros análogos no hidrolizables de ATP que podrían analizarse incluyen PNP AMP y ATP-γ-S-Mg2 +. Estudios de HerA-NurA, mezclar 5 μm de proteína purificada con ATP-γ-S y ADP en concentraciones que van desde 0-1 mM. Para capturar a simultáneo enlace ATP-γ-S y ADP, añadir dos nucleótidos en las misma o diferentes concentraciones. Añadir 2 mM de MgCl2 e incubar a 25 ° C en una incubadora de baño seco para 1 h.Nota: Análisis de unión de nucleótidos mediante nESI que MS nativa puede causar atascamiento artefactual en altas concentraciones, por lo tanto fijación no específica debe tenerse en cuenta29. Para investigar el atascamiento no específico, añadir una mayor concentración de nucleótidos de entre 2-5 mM). Para el análisis de ADN vinculante Mezclar la proteína y el ADN en una proporción molar que permite la formación de complejos proteína ADN. Para HerA y HerA-NurA, mezcle 5 μm de proteico purificado con el ADN en una proporción 1:1. Incubar la HerA-NurA o HerA – mezcla de ADN durante 30 min a 25 ° C en una incubadora de baño seco hasta que alcanza el equilibrio. La duración y la temperatura de incubación pueden variar dependiendo de la proteína bajo investigación. Búfer intercambio proteína muestras MS compatible con buffers. Comúnmente, se utilizan solución de acetato de amonio acuoso entre 5 mM-1 M a pH 7-8. Otros búferes compatibles MS incluyen etilendiamonio diacetato (EDDA) y Trietilamonio acetato (TEAA)30. Estudios de HerA-NurA, use 200 mM amonio acetato pH 7.Nota: Existen varios métodos para cambio de tampón antes del análisis por MS como el uso de un concentrador centrifugado o columnas de cromatografía. MS nativa está limitada sobre todo por la calidad de la muestra tales como tampones y aductores utilizados durante la purificación. Por lo tanto, es imprescindible realizar la desalación suficiente para obtener picos resueltos. Para estudios de unión de ligando HerA-NurA, tampón intercambio muestras de 6 a 8 veces en acetato de amonio 200 mM utilizando un concentrador. Aunque este método es más lento, asegura que resolvió se alcanzan picos y permite la determinación de masa exacta de especie dependiente de ATP/ADP. 2. nativos de MS de adquisición y análisis para la investigación de complejos de proteínas y complejos de proteína-ligando Nota: MS condiciones deberían optimizarse para alcanzar picos de alta resolución para las medidas exactas de la masa. Los datos de esta sección optimizan los parámetros en un espectrómetro de masas de Q-ToF con un quadrupole de m/z 32 k límite superior. Preparar los capilares internos para nano-electrospray y realizar la calibración masa instrumento para las medidas exactas de masas según lo detallado por Kirshenbaum et al. 1. Seleccione movilidad TOF modos, adquisición de iones positivos y sensibilidad. Encender los gases trampa, API y IMS. Para la separación de la IM, use nitrógeno (60 mL/min) y argón (8,4 mL/min para la región de la trampa) como puntos de partida y ajuste. Coloque una adquisición adecuada de m/z. Para una proteína desconocida, pasos de optimización inicial deben utilizar una amplia gama como 32.000 500 m/z. Carga 2-3 μl de la solución compleja de proteínas a analizar en un tubo capilar recubierto oro e insertarla en un soporte de tubo capilar. Suavemente apriete el tubo capilar y coloque el capilar en la etapa de fuente electrospray y deslice la etapa en posición para empezar a adquirir datos. Aplique una presión de gas de nano-flujo bajo (0.00-0.05 Bar) hasta que una gota se forma en el extremo del tubo capilar. Nano-presión puede descartarse hasta que el chorro se mantiene. Ajustar el tubo capilar en relación con el cono moviendo el tubo capilar en x, y, z las posiciones y controlar el ion actual para lograr un ion estable actual. Aplicar una tensión capilar en el rango de 0.9-1.6 kV. Ajuste el cono de muestreo (50-120 V), offset fuente (60.0), temperatura (25 ° C) de la fuente y caudal de gas de cono (0.0 L/h). Éstos sugirieron las condiciones iniciales se pueden ajustar. Para la adquisición de un espectro de masa bien resuelto y para maximizar la transmisión de iones, ajustar parámetros de MS y monitorear el cambio resultante en los espectros. Se trata de ajustar el caudal de gas de la trampa (2-8 mL/min), él celular (180 mL/min) y célula IMS (90 mL/min) para lograr la mejor separación de transmisión máxima. Ajustar las energías de colisión de trampa si desvíos de tensión no son suficientes. Un punto de partida óptimo es entre 10-50 V.Nota: Aumentar la energía de la trampa puede quitar no-covalentemente aductos. Sin embargo, tenga cuidado para evitar la disociación inducida por colisión y despliegue del complejo proteína-ligando. Realizar mediciones de movilidad de iones para comprobar si las condiciones del instrumento mantienen la proteína en el estado doblado nativo (paso 3). Mejorar desolvation optimizando el voltaje de bias de trampa. Un óptimo punto de partida es el V 20-45. Optimizar la velocidad de las ondas y la altura de ola para lograr la mejor separación de movilidad. Una explicación detallada y protocolo pueden encontrarse aquí31. Para los estudios de HerA-NurA, usar la velocidad de las ondas de 40 (m/s) y altura de onda de 550-650 (V). Utilizar otros parámetros como valores por defecto de instrumento. Preparar una muestra libre de ligando para el análisis como un control para cada serie (figura 1). Para los experimentos de unión de ligando, realizar al menos tres mediciones independientes. Utilice el software Masslynx para medir masas de especies generadas e identificar el atascamiento del ligand, como enlace de ATP y ADP y los Estados (figura 2 y 3). Otros software disponible incluyen UniDec32, PULSAR33 y34de Anfitrite. Para cuantificar la abundancia relativa de especies, utilizar las correspondientes intensidades de iones observadas en el espectro ESI-MS crudo (por ejemplo límite del ligando diferentes oligómeros, etcetera). Como alternativa, realizar cuantificación usando software especializado como UniDec y Massign35 (figura 1 y 3 ). 3. adquisición y análisis de IM-MS Nota: IM-MS separa los iones en la fase de gas basado en su tamaño (masa), la forma y la carga. Cada característica resuelto en espectro de m/z se asocia una distribución del tiempo de deriva. IM-MS mide el tiempo de la deriva de un ion que puede ser utilizado para calcular la sección de colisión (CCS). Valores de tiempo deriva medición desde IM-MS datos adquiridos mediante que un tubo de la deriva puede ser linealmente correlacionado con CCS valores36. Para viajar las medidas IM-MS (TWIMS) de la onda, calculando valores CCS requiere una curva de calibración obtenida a partir de estándares de proteína con el conocido CCS valores37. Estructuras compactas viajan más rápido que extendido o reducción de estructuras alargadas debido a interacciones con el gas de búfer en la movilidad celular38. Por lo tanto, IM-MS puede usarse para detectar si la estructura nativa plegada se ha mantenido en la fase de gas39,40. Esta sección describe cómo medir IM-MS y calcular la CCS de proteína TWIMS. Después de optimizar las condiciones del instrumento de transmisión estable (paso 2), reducir la energía de colisión y el cono de muestreo tan baja como sea posible manteniendo calidad buena espectros. Utilice la velocidad de las ondas optimizado y altura de ola para adquirir IM-MS (paso 2). Medir la deriva de ion el tiempo con IM-MS a tres velocidades diferentes de la onda (por ejemplo, 550, 600 y 650 m/s), manteniendo la misma altura de onda (por ejemplo, 40 V). Para determinar los iones de proteínas CCS, calibradores de proteína medida bajo las mismas condiciones del instrumento utilizadas para la proteína bajo investigación. Una óptima calibración de tiempo deriva requiere medición de las proteínas con CCS conocidas. Seleccione cuatro calibradores, dos con una masa por encima y dos con una masa inferior a la de la proteína bajo investigación37. Lo más importante, asegúrese de que la altura de ola y la velocidad de la onda son los mismos que los registrados para la proteína bajo investigación. Calcular manualmente CCS41 o usando un software especializado como PULSAR33 y Amphitrite34 (figura 5). Para comprobar si la proteína es nativo-como en la fase gaseosa, CCS experimental compara a CCS teóricos obtenidos de estructuras de alta resolución. Para HerA-NurA, calcular CCS teórica utilizando el método de aproximación de proyección (PA) en MOBCAL42. Otros métodos incluyen trayectoria método (TM)42 y exacto ámbito difícil dispersión (EHS)43. 4. solución en interrupción de complejos de la proteína nativa MS y IM-MS Led determinación estructural Nota: Los complejos de la proteína pueden en algunos casos identificar de la misma solución como complejo intacto. Sin embargo, puede lograrse estructural información adicional como la inter-subunidad conectividad y complejo conjunto de interrumpir las interacciones de la proteína en solución, para formar los complejos. Esto puede lograrse de varias maneras tales como la adición de solvente orgánico, aumentando la fuerza iónica o manipulando el pH. Para conocer de la HerA-NurA subunidad compleja conectividad y complejo conjunto, los complejos se generaban en solución mediante la adición de disolventes que perturban las interacciones de la subunidad. Preparar el cambio de muestra y tampón de proteínas en acetato de amonio como se describe en el paso 1. Añadir 10-40% de solvente en incrementos del 10%. Disolventes normalmente utilizados son el dimetil sulfóxido (DMSO), metanol (MeOH) y acetonitrilo (ACN).Nota: Esto puede realizarse dentro de un tubo de microcentrífuga de polipropileno. Incubar la mezcla en hielo durante 1 hora. Adquirir un espectro IM-MS para cada condición (pasos 2 y 3) (figura 4). Utilice el software Cumbre del44 para asignar los complejos de la proteína y generar redes de interacción de proteínas. Como alternativa, manualmente generar una lista de masas teóricas de las especies esperadas. Para asegurar se dobla Subcomplejos mando, calcular los valores experimentales de CCS para los complejos secundarios y comparar a CCS teórica como se explica en el paso 3 (tabla 1, figura 5 y figura 6). 5. investigar la proteína compleja estabilidad mediante colisión inducida por despliegue (CIU) Nota: Se puede utilizar CIU sonda la estabilidad estructural de las proteínas y sus complejos con el ligando. Paquetes de software especializados como PULSAR33, Amphitrite34 y CIU suite9 pueden utilizarse entonces para modelar el despliegue de la fase gaseosa de la proteína bajo investigación con y sin ligando. Por ejemplo, esta sección describe el procedimiento de control de fase gaseosa desarrollando trayectorias e investigar el efecto que se estabiliza del atascamiento de la DNA y ATP en el complejo de HerA-NurA. Registrar datos de IM-MS mientras que aumenta el voltaje de aceleración de trampa de 10 V a 200 V en incrementos de 2-10 V a revelar progresivamente la proteína en la fase gaseosa.Nota: Registro de resultados de incrementos más pequeños en más archivos de datos para procesar, sin embargo este enfoque proporciona el diagrama de despliegue más resuelto, que es importante para el análisis de los puntos de transición entre las especies de plegado/desplegado. Analizar los datos adquiridos mediante PULSAR33, Amphitrite34 o CIU suite9 y generar diagramas de despliegue bidimensionales en unidades de CCS en función de la aceleración de tensión (paso 3). Para cada estado de carga, este se crea apilando las distribuciones CCS intensidad-normalizado en cada voltaje de aceleración (figura 7 A-Bi). Generar un diagrama de despliegue teórico utilizando uno de los paquetes de software. Se instalarán los datos a un modelo de despliegue. Esto hace posible cuantificar la energía de colisión en que despliegue las transiciones ocurren y determinan la estabilidad de las proteínas con y sin ligandos consolidados33. Una transición que es cuando las transiciones de una especie de un estado (basado en sus valores experimentales de CCS) a otro estado con un CCS más grande. Para cuantificar las transiciones, calcular la midpoint(s) transición entre Estados mediante algoritmos y software como PULSAR33. Esto se divulga comúnmente como CV50, cual es el valor de tensión de choque (trampa) en que se agote el 50% de un estado específico. El valor de50 CV, calcular la energía interna total de un ion con la colisión del centro de masa energía (KECOM)45. KECOM se define por la energía interna total disponible para la transición de despliegue de un ion y se calcula a partir de la energía cinética y las Misas de los socios de colisión (ion proteína y gas neutro) tal como se describe en la ecuación (1)10KEcom (eV) = (ecuación 1).Donde Z es la carga de iones, MN es la masa de los gases neutros yiones de M es la masa del ion de la proteína.Nota: Esto es porque CIU de proteínas es cargo dependent46, 47. Se recomienda realizar el análisis KECOM a más de un estado de carga ( figura 7Aii). 6. procedimientos de modelado para simulaciones de dinámica Molecular diferencial utilizado en MS Integrativa Nota: Usar modelos de subunidades de proteínas o de complejos como de las estructuras cristalinas, simulaciones diferencial (complejo con y sin ligando de la proteína) pueden utilizarse para determinar efectos de por ejemplo presencia de ligando en la dinámica y estructura de la proteína. Esta sección detalla un flujo de trabajo y las herramientas necesarias para el modelado de procedimientos necesarios para simulaciones de dinámica molecular diferencial de la instalación. Identificar las subunidades que componen el complejo (figura 8A, en los pasos 2 y 3). Fuente de los modelos existentes de subunidades, por ejemplo, las estructuras cristalinas de la base de datos de copia (https://www.rcsb.org). El UniProt entrada de la proteína contiene una lista de conocer estructuras cristalográficas/NMR (http://www.uniprot.org). Si estos no están disponibles, la secuencia teórica puede entrar a la explosión para identificar plantillas convenientes para modelado de homología (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Montar el conjunto de la topología correcta (figura 8A-ii). Esto puede hacerse a través de varios métodos. Las subunidades individuales pueden montarse en mapas de la microscopia electrónica disponible encontradas el EMDB para armar el complejo intacto (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). Un tutorial para el montaje de PDBs en EM mapas usando Molecular dinámica Flexible montaje (MDFF) puede encontrarse aquí: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/. Identificar las regiones que faltan del complejo (figura 8A-iii). Realizar alineamiento múltiple de secuencias (MSA) entre el PDB y secuencia teórica para identificar residuos que pueden ser preparados en las estructuras cristalinas, o ninguna mutaciones heredadas de experimentos cristalográficos. MSA se puede realizar utilizando los servidores de web tales como T-café (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular). Residuos que falta regenerados mediante homología modelado (figura 8A-iv). Falta de residuos de la proteína del complejo se puede construir usando el programa MODELLER (https://salilab.org/modeller/). MODELLER puede salir un conjunto de n los modelos en diferentes configuraciones regenerados. Buenos modelos se pueden identificar partiendo su calificación de energía proteína optimización discreta (droga). Se proporciona un tutorial completo en el sitio web de software (https://salilab.org/modeller/tutorial/). Realizar simulaciones de dinámica molecular diferencial (MD) de la proteína del complejo (figura 8B) para identificar las regiones de las proteínas que responden a un cambio ambiental en particular, por ejemplo, la presencia de un ligando. En tales simulaciones, parámetros de comportamiento de la simulación A (sólo proteínas) que actúa como referencia, se resta de B simulación (proteína + ligando). La fluctuación diferencial cuadrático (RMSF) calculada entre simulaciones A y B puede informar en las regiones de la proteína que aumentan o disminuyen en la flexibilidad de una manera dependiente de ligando. Realizar simulaciones y análisis descendente con GROMACS (http://www.gromacs.org). Un tutorial se puede encontrar en: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. Para eliminar sesgos de modelo, se debe generar primero la estructura del complejo ligando-limite. La proteína se copiará de esto sin el ligando, para producir un modelo de proteína idéntico al complejo ligando enlazado.