タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析

1 タンパク質とタンパク質-リガンド複合体のネイティブの MS のサンプル準備 注: ネイティブの MS を使用してリガンド結合とタンパク質複合体の分子基盤の理解を得るためには、適切なサンプル準備キーです。このセクションの目的は、例として DNA とヌクレオチドを結合するヘラぬ錯体を用いた MS 分析の前に重要なサンプル準備の手順を強調することです。 1.5 mL チューブに高濃度精製タンパク質 (通常 15-30 μ M) の 20 μ L 因数を準備します。 ATP または ADP 結合分析のため注: 追加の非加水分解性 ATP アナログ アデノシン 5 ‘O濃度を上げる-(3-thiotriphosphate)、tetralithium 塩 (ATP-γ-S) またはアデノシン 5’-二リン酸 (ADP)。非加水分解性 ATP 誘導体は、キャプチャされる ATP 結合蛋白質を可能にする安定した複雑なを生成します。テストできる他の非加水分解性 ATP アナログ アンプ PNP と ATP γ S Mg2 +があります。 ヘラぬ研究、ADP と ATP γ S の浄化された蛋白質の 5 μ M を 0-1 に至る濃度でミックス mM。 ATP-γ-S と ADP の同時バインドをキャプチャするには、同じまたはさまざまな濃度で両方のヌクレオチドを追加します。 2 mM MgCl2を追加し、25 ° c 1 時間乾燥風呂インキュベーターで孵化させなさい。注: ネイティブの MS は高濃度で artefactual バインディングにつながる nESI のヌクレオチド結合の解析、したがって非特異的結合取られなければならないアカウント29に。非特異的結合を調べるためには、追加 2 ~ 5 mM 間のヌクレオチドの高濃度)。 DNA 結合分析のため タンパク質-DNA 複合体の形成は、モル比でタンパク質や DNA をミックスします。ヘラ、ヘラぬ 1:1 の比率で DNA の浄化された蛋白質の 5 μ M をミックスします。 ヘラぬやヘラ – DNA 混合乾燥風呂インキュベーター平衡に達するまでに 25 ° C で 30 分間インキュベートします。期間および培養温度は、調査中のタンパク質によって異なります。 MS 互換性のあるバッファーにバッファー交換蛋白質のサンプル。一般的に、ph 7 8 5 mM 1 m アンモニア水酢酸溶液が使用されます。エチレンジアミン二酢酸一 (エッダ) と Triethylammonium (TEAA) 酢酸30他の MS の互換性のあるバッファーが含まれます。ヘラぬ研究 200 mM アンモニウム酢酸 pH 7 を使用します。注: スピン コンセントレーターやクロマトグラフィ用カラムなど質量分析法による分析の前にバッファー交換のためいくつかの方法があります。ネイティブの MS は主バッファー付加体などは浄化中に使用されるサンプルの質によって制限されます。したがって、解決のピークを取得する十分な脱塩を行うために不可欠です。 ヘラぬリガンド結合実験のコンセントレーターを使用して 200 mM 酢酸アンモニウムに 6-8 回 exchange サンプルをバッファーします。このメソッドはより時間がかかるが、それは確実にピークを達成、解決し、ATP/ADP 結合種の正確な質量測定を可能します。 2. ネイティブの MS の取込みと蛋白質の複合体およびタンパク質-リガンド複合体の調査のための解析 注: MS の条件は、正確な質量測定を有効にする高度に解決のピークを達成するために最適化する必要があります。このセクションの詳細は、32 k 上限 m/z 極 Q ToF 質量分析計のパラメーターを最適化されています。 ナノ エレクトロ スプレーに備えて社内毛細血管とキルシェンバウムらによって詳細なとして正確な質量測定のための測定器の質量校正を実行1。 感度、肯定的なイオンの取得およびモビリティ TOF モードを選択します。 トラップ、API および IMS のガスを入れます。IM の分離のための開始点として窒素 (60 mL/分)、アルゴン (8.4 mL/分トラップ領域) を使用して、調整します。 適切な m/z 収集範囲を設定します。未知の蛋白質の初期最適化のステップ 500 32,000 m など広い範囲を使用する必要があります/z。 ゴールド コーティングされたキャピラリーに分析して毛細血管のホルダーに挿入する蛋白質の複雑な解決の 2-3 μ L をロードします。 優しく毛細血管を強化、エレクトロ スプレー ソース段階で毛細血管を配置、データ集録を開始する位置にステージをスライドさせます。 低ナノ流量のガス圧力を適用 (0.00 0.05 バー) ドロップがキャピラリーの先端に形成されるまで。スプレーの維持まで、ナノ流動圧は下がりました。 Z 位置し、イオンの安定したイオン電流を達成するために電流を監視、x、y 毛細血管を移動することによって円錐に関して毛細血管を調整します。0.9 1.6 の範囲のキャピラリー電圧 kV。 サンプリング コーン (50-120 V)、ソース ・ オフセット (60.0)、ソース温度 (25 ° C)、円錐形ガス流れ (0.0 L/h) を設定します。これらの提案の初期条件を調整することができます。 うまく解決のマススペクトルを取得し、イオン伝達を最大化するには、MS パラメーターを調整し、スペクトルの結果の変更を監視します。転送の最大で最高の分離を達成するためにトラップ (2-8 mL/分)、彼のセル (180 mL/分) および IMS セル (90 mL/分) のガスの流れを調整することが含まれます。 電圧オフセットが十分ではない場合は、トラップの衝突エネルギーを調整します。最適な開始点は、10-50 V の間です。注: トラップ エネルギーの増加は、付加体非共有結合削除ことができます。ただし、衝突誘起解離とタンパク質-リガンド複合体の展開を避けるために注意してください。イオン移動度測定計器保持ネイティブたたんだ状態 (ステップ 3) で蛋白質を確認するを実行します。 トラップのバイアス電圧を最適化することにより溶媒を向上します。最適な開始点は、20-45 V です。 波速度と最高のモビリティの分離を達成するために波の高さを最適化します。詳細な説明とプロトコルは、31をここ発見することができます。ヘラぬ研究 40 (m/s) の波速度と 550-650 (V) の波の高さを使用します。 楽器の既定値として、他のすべてのパラメーターを使用します。 (図 1) の実行ごとにコントロールとして解析用配位子の無料サンプルを準備します。リガンド結合実験のために少なくとも 3 つの独立した測定を実行します。 Masslynx ソフトウェアを使用して生成された種の質量を測定し、ATP や ADP 結合オリゴマー状態 (図 2 、3) などのリガンド結合を識別します。UniDec32、パルサー33アムピトリーテー34利用可能なその他のソフトウェアが含まれます。 種の相対的な豊かさを定量化するには、(たとえばリガンド連結、異なるオリゴマーなど。) 生の MS スペクトルで観測された対応するイオン強度を使用します。また、UniDec と Massign35 (図 1 と 3 ) のような特殊なソフトウェアを使用して定量化を行います。 3. 集録および解析 IM MS 注: IM MS (質量) のサイズ、形状および料金に基づいて気相のイオンを分離します。M/z スペクトルで解決されたすべての機能は、ドリフト時間分布に関連付けられます。IM MS は、衝突断面 (CCS) を計算するため使用ことができるイオンのドリフト時間を計測します。ドリフト時間値は、IM MS ドリフト管は直線的 CCS 値36を関連付けることができますを使用して取得したデータから計測されます。IM MS (双子だものね) 測定を旅行する CCS の値を計算すると、知られている CCS 値37タンパク質基準から得られた検量線が必要です。コンパクトな構造は拡張よりも速く移動または細長い構造体減少移動セル38バッファー ガスとの相互作用。したがって、IM MS はガス相39,40でネイティブの折られた構造が保持されているかどうかを検出する使用ことができます。このセクションは、IM MS を測定、双子だものねを使用して蛋白質の CCS を計算する方法をについて説明します。 安定した伝送 (ステップ 2) の計測条件の最適化の後良いスペクトル品質を維持しながら衝突エネルギーと可能な限り低くサンプリング コーンを減らします。 最適化された波速度と波の高さを使用して IM MS (ステップ 2) を取得します。 イオンのドリフトを測定 (例えば40 V) 同じの波の高さを維持しながら 3 つの異なる波速度 (例えば550、600 と 650 m/s) で IM MS の時間。 タンパク質イオン CCS は、調査中のタンパク質の使用同じ計器測定蛋白質 calibrants を確認します。最適なドリフト時の校正には、知られている CCS が付いている蛋白質の測定が必要です。 4 つの calibrants、2 つの上の質量を持つと下調査37蛋白質の質量を持つ 2 つを選択します。最も重要なは、波の高さと波速度が調査中の蛋白質のために記録されるそれらとして同じであることを確認します。 計算41 CCS 手動でまたはパルサー33アムピトリーテー34 (図 5) などの特殊なソフトウェアを使用しています。 タンパク質であるかどうかを確認するには、ネイティブのようなガス相で比較実験的理論的 CCS CCS は、高分解能構造から取得されます。ヘラ-ぬ理論 CCS MOBCAL42で使用される射影近似 (PA) メソッドを使用して計算されます。他の方法では、軌道法 (TM)42 (EHS)43を散乱正確な剛体球をご利用など。 4 ネイティブの MS と IM MS タンパク質複合体のソリューション混乱主導の構造決定 注: サブ タンパク質によって識別できます無傷の複合体として同じソリューションから。ただし、ソリューションでは、フォームのサブの複合体に蛋白質の相互作用の妨げ間サブユニット接続や複雑な組み立てなどさらに構造情報が得られます。これは有機溶剤、イオン強度を増加または pH を操作に追加するなどいくつかの方法で達成することができます。ヘラぬ複雑な亜単位の接続と複雑なアセンブリに洞察力を得るためには、サブの錯体は、サブユニットの相互作用を摂動する溶剤を追加することによってソリューションに発生しました。 ステップ 1で説明したように酢酸アンモニウムに蛋白質のサンプルとバッファー交換を準備します。 10% 刻みで溶剤の 10-40% を追加します。通常使用される溶媒はメタノール (メタノール)、ジメチルスルホキシド (DMSO)、アセトニ トリル (ACN です)。注: これは、ポリプロピレン微量遠心チューブ内で実行できます。 1 h の氷の混合物を孵化させなさい。 (手順 2 および 3) (図 4) 各条件に対して IM MS スペクトルを取得します。 サミット ソフトウェア44を使用して、割り当てるサブ タンパク質とタンパク質間相互作用ネットワークを生成します。また、予想される種の理論的な大衆の一覧を手動で生成します。 Subcomplexes が折り畳まれていることを確認、サブの複合体の実験的 CCS 値を計算し、ステップ 3 (表 1図 5と図 6) で説明している理論的 CCS に比較します。 5. 衝突による展開 (CIU) を使用して蛋白質複雑な安定性の調査 注: CIU を使用できますその錯体の配位子が結合して蛋白質の構造安定性をプローブします。パルサー33、アムピトリーテー34 CIU スイート9などの専門家のソフトウェア パッケージは、捜査、リガンドとタンパク質のアンフォールディング気相モデルに使用できます。例として、このセクションは気相の監視の手順を説明ヘラぬ複合体の DNA や ATP 結合の安定の効果の調査と軌跡を展開します。 気相におけるタンパク質を徐々 に展開する 2-10 V 単位で 200 V を 10 V からトラップ加速電圧を高くしながらレコード IM MS データ。注: プロセス、しかしこの方法より多くの解決の展開プロットするデータ ファイルの小さい増分結果の記録折り畳まれて繰り広げられる種の間の遷移点を分析のために重要であります。 パルサー33、アムピトリーテー34または CIU スイート9を使用して取得したデータを分析し、加速電圧 (ステップ 3) の関数として CCS の単位で二次元展開プロットを生成します。各充電状態、これがそれぞれの加速電圧 (図 7 A Bi) における強度 – 正規化 CCS 分布を積層することにより作成されます。 ソフトウェア パッケージの 1 つを使用して理論的展開プロットを生成します。データは、展開モデルに装着されます。これにより、展開の遷移が発生してバインドされている配位子33とタンパク質の安定性を決定する衝突エネルギーを定量化することが可能。アンフォールディング転移、種の遷移 (実験的 CCS 値に基づいて) 1 つの状態から大きい CCS と別の状態です。 遷移を量的に表わすとパルサー33などソフトウェアのアルゴリズムを使用して状態間移行 midpoint(s) を計算します。これは一般履歴書50は、特定の状態の 50% を消耗する衝突 (トラップ) 電圧値として報告されます。 CV50値を使用して、質量中心衝突エネルギー (柯COM)45を用いたイオンの総内部エネルギーを計算します。KECOMイオンの展開の移行の合計の内部エネルギーによって定義され、10式 (1) で説明したように運動エネルギーと衝突パートナー (タンパク質イオンと中性ガス) の質量から計算されます。KEcom (eV) = (式 1)。Zはイオンの電荷、MNは中性のガスの質量、Mイオンがタンパク質のイオンの質量。注: これは蛋白質の CIU 料金 dependent46、47 は、ためにです。1 つ以上の充電状態 (図 7Aii) 柯COM分析を実行することをお勧めします。 6. 差動分子動力学の統合 MS で使用されるプロシージャをモデリング 注: 蛋白質の亜単位または錯体結晶構造からのモデルを使用して、差分の MD シミュレーション (タンパク質とリガンド複合体) は蛋白質の構造とダイナミクスに及ぼすたとえばリガンドの存在を決定する使用できます。このセクションは、ワークフローおよびセットアップ差動分子動力学シミュレーションに必要な手順をモデル化に必要なツールについて説明します。 (図 8A手順 2 および 3 の) 複合体を構成するサブユニットを識別します。サブユニット、RCSB データバンク (https://www.rcsb.org) から結晶構造などの既存のモデルをソースします。UniProt タンパク質のエントリのリストが含まれますは、結晶/NMR 構造 (http://www.uniprot.org) を知っています。これらが使用できない場合は、相同性モデリング (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) のための適したテンプレートを識別するために爆発する理論的なシーケンスを入力できます。 正しいトポロジ (図 8A ii) の複合体を組み立てます。これは、さまざまな方法で行うことができます。個々 のサブユニットは、無傷の複合体 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/) を組み立てるため、EMDB で見つけた使用可能な電子顕微鏡マップに取り付けることができます。分子動力学フレキシブル継手 (MDFF) を使用して EM マップに Pdb をフィッティングするためのチュートリアルをここで見つけることが: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/。 (図 8A iii) 複合体の欠損個所を特定します。結晶構造や結晶学的実験から継承された任意の突然変異に取り付けできない場合があります残基を識別する PDB と理論的なシーケンスを複数配列アラインメント (MSA) を実行します。MSA は、T-コーヒー (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular) などの web サーバを使用して実行できます。 相同性モデリング (図 8A iv) 経由で不足している残基を再生成します。複雑なタンパク質の残基を行方不明は、モデラー プログラム (https://salilab.org/modeller/) を使用して構築できます。モデラーは、別の再生設定で n モデルのアンサンブルを出力できます。良いモデルは、離散最適化蛋白質エネルギー (ドープ) スコアに基づいて識別できます。包括的なチュートリアルは、ソフトウェアのウェブサイト (https://salilab.org/modeller/tutorial/) で提供しています。 配位子の存在など、特定の環境変化に対応する蛋白質の領域を識別する (図 8B) 複雑な蛋白質の差動分子動力学 (MD) シミュレーションを実行します。このようなシミュレーションは、シミュレーションから行動パラメーター (蛋白質のみ) でシミュレーション B (タンパク質 + 配位子) から減算は、参照として機能します。計算シミュレーション A と B 間差分の二乗平均ゆらぎ (RMSF) を増減させる柔軟性のリガンド依存的蛋白質の地域に知らせることができます。 MD シミュレーションと GROMACS (http://www.gromacs.org) を使用してダウン ストリームの解析を実行します。チュートリアルを見つけることができます: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html。Elimate モデル バイアス最初リガンド複合体の構造を生成します。タンパク質は、リガンド、リガンド複合体と同じタンパク質モデルを生成することがなく、これからコピーされます。