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Chemistry

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Published: October 15, 2018
doi:
10.3791/57966
, , ,
1Department of Chemistry,King’s College London

Summary

Spettrometria di massa (MS) è emersa come un importante strumento per lo studio della struttura e dinamica di assembly macromolecolari. Qui, possiamo integrare approcci basati su MS per interrogare la formazione dei complessi della proteina e grippaggio del ligand.

Abstract

Le proteine sono un’importante classe di macromolecole biologiche che svolgono molti ruoli chiave nelle funzioni cellulari tra cui espressione genica, catalizzando reazioni metaboliche, la riparazione del DNA e la replica. Di conseguenza, una conoscenza dettagliata di questi processi fornisce informazioni critiche su come le cellule di funzione. Integrativa strutturale MS metodi offrono informazioni strutturali e dinamiche su assiemi complessi proteina, connettività complessi, stechiometria di subunità, oligomerizzazione di proteina e grippaggio del ligand. Gli avanzamenti recenti nella integrativa MS strutturali hanno consentito la caratterizzazione dei sistemi biologici impegnativi tra cui grandi proteine di legame del DNA e proteine di membrana. Questo protocollo descrive come integrare i diversi dati di MS come nativa MS e spettrometria di massa di mobilità dello ione (IM-MS) con simulazioni di dinamica molecolare per acquisire conoscenze in un DNA elicasi-nucleasi riparazione complesso proteico. L’approccio risultante fornisce un quadro per studi dettagliati del grippaggio del ligand di altri complessi proteici coinvolti in importanti processi biologici.

Introduction

Analisi di spettrometria nativo di proteine intatte e loro complessi viene effettuata utilizzando electrospray e nano-electrospray ionizzazione (nESI), che conservano il protein folding e interazioni non-covalenti durante il processo di ionizzazione1, 2. In nativa MS, la struttura delle proteine e dei loro complessi vengono mantenute in uno stato quasi nativa in fase gas3,4. MS nativa rileva più ioni di carica della proteina, che sono separati secondo la loro massa per caricare il rapporto (m/z) permettendo la massa della proteina o proteina-ligando complesso da calcolare. Questa informazione consente la determinazione della stechiometria di una proteina intatta, composizione in subunità, grippaggio del ligand e interazione reti3,4,5,6. MS nativa ha diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche di questo tipo di spettroscopia cristallografia a raggi x e risonanza magnetica nucleare5. In primo luogo, nativa MS è una tecnica rapida e altamente sensibile, che richiedono solo pochi microlitri (2-3 µ l) di campione a concentrazioni relativamente basse di complesse finale nell’alto nM a µM bassa gamma6. In secondo luogo, MS nativa consente di interrogare i campioni proteici eterogenei che permette di analizzare simultaneamente più proteine e Stati oligomerici. In terzo luogo, nativa MS non richiede campioni proteici da modificare prima dell’analisi di reticolazione chimica o proteina etichettatura. Questi vantaggi hanno reso strutturale MS un potente strumento per l’indagine strutturale dei complessi della proteina.

MS nativa combinabile con mobilità dello ione (IM), una tecnica che misura il tempo di che un ione di proteine porta a viaggiare attraverso un campo elettrico, consentendo la sezione trasversale collisionale (CCS) deve essere determinato. Il CCS fornisce informazioni strutturali a bassa risoluzione, che consente di topologia e informazioni di eterogeneità conformazionale di proteine per essere ottenuti. Inoltre, permette l’esame dei modelli strutturali della proteina generata da approcci computazionali.

Stabilità proteica fase gassosa può essere indagata mediante collisione indotta dispiegarsi (CIU) misurata da IM-MS. Durante il processo di CIU, proteina ioni sono accelerati e attivati attraverso una maggiore accelerazione collisioni con un gas inerte buffer all’interno di una spettrometro di massa7,8,9. Questo processo di attivazione collisionale fa sì che la proteina parzialmente spiegare, che si traduce in un aumento in CCS. Questo cambiamento di CCS e l’energia necessaria per spiegare la proteina può essere misurata IM-MS. utilizzando questo approccio, l’effetto del ligando sulla stabilità della proteina può essere misurato10. Subcomplexes può essere generato in soluzione mediante metodi di perturbazione in soluzione come l’aggiunta di solventi organici per monitorare nativo-come topologie dei complessi della proteina. Rottura dei complessi proteici è pricipalmente dovuto la rottura di interazioni non-covalenti intra. I sub-complessi mantengono nativo-come topologie e, al momento del rilevamento di MS, rivelano informazioni sulla connettività di inter-unità secondaria.

Approcci integranti in biologia strutturale combinano diversi metodi per studiare la struttura e la dinamica delle proteine e loro complessi3,4,5,6. Nativo di MS e IM-MS sono stati utilizzati per scoprire i dettagli molecolari di sistemi biologici impegnativi. Ci sono stati diversi esempi di applicazioni compreso lo studio di proteine Assemblea vie11,12,13,14, studiando l’interazione proteina-proteina reti15 , 16 , 17, membrana proteine6,18,19,20,21e delle interazioni proteina-ligando quali acidi nucleici22,23 ,24.

Tuttavia, MS nativa ha anche i suoi limiti. Nativo MS misure sono spesso eseguite nei buffer di volatili quali l’acetato di ammonio acquoso in cui alcune proteine non manterranno il loro stato nativo piegato3,25. Tuttavia, il lavoro recente ha indicato che questa limitazione può essere superata da ottimizzazione di spruzzatura diametro della punta dell’ago (punte di 0,5 mm) tale che proteine e ioni complessi della proteina possono essere formati direttamente da buffer non volatile con alta forza ionica che meglio imitare l’ ambiente fisiologico26. Inoltre, MS nativa utilizza electrospray per ionizzare e trasferimento non-covalente assembly da soluzione a fase gassosa; Pertanto, la relativa abbondanza dei complessi rilevati non può interamente rappresentare che in soluzione5,27. Inoltre, in confronto alla soluzione, le interazioni idrofobiche di fase gas diventano più deboli e interazioni elettrostatiche diventano più forti e quindi favorito3,28.

In questo articolo, forniamo protocolli, analisi dei dati e interpretazione per identificazione delle proteine e ligand binding utilizzando MS nativa, IM-MS, CIU, rottura in soluzione e modellazione. Il complesso di riparazione del DNA, HerA-NurA, viene utilizzato come sistema modello. Rotture del doppio filamento del DNA (DSBs) sono una delle forme più citotossiche e deleteri di danno del DNA, con conseguente instabilità genetica e lo sviluppo finale del cancro in esseri umani. Ricombinazione omologa è il meccanismo di riparazione che sradica DSBs, un processo che è orchestrata da ATP dipendente helicase-nucleasi complessa, HerA-NurA22.

Combinando nativa MS e IM-MS con saggi funzionali e modellazione ha permesso l’indagine: i) il ruolo della Nurra nell’Assemblea, la conformazione e la stabilità del complesso, ii) l’interazione tra dsDNA e il complesso e la sua influenza sul globale stabilità del complesso e iii) la stechiometria e l’impatto di ATP binding sul Assemblea22. Nel complesso, questo lavoro ha portato a una migliore comprensione della base molecolare del complesso HerA-NurA collegando complessi cambiamenti conformazionali della proteina e la stabilità con l’associazione del nucleotide. Questo protocollo è generico per qualsiasi complex(es) di proteina che interagisce con uno o più tipi di ligandi.

Protocol

1. preparazione del campione per MS nativa di proteine e complessi proteina-ligando Nota: Per ottenere una comprensione della base molecolare di una proteina complessa e ligando utilizzando MS nativa, preparazione del campione adatto è la chiave. Lo scopo di questa sezione è quello di evidenziare i passaggi di preparazione essenziale campione prima dell’analisi MS utilizzando il complesso di HerA-NurA che lega il DNA e nucleotidi come esempio. Preparare 20 aliquote µ l di concentrato e purificato della proteina (in genere 15-30 µM) in una provetta da 1,5 mL. Per l’analisi di associazione di ATP o ADPNota: Aggiungere le concentrazioni aumentanti del non-hydrolyzable ATP analogico adenosina 5 ‘-O-(3-thiotriphosphate), tetralithium sale (ATP-γ-S) o adenosina 5 ‘-difosfato (ADP). Derivati di ATP non hydrolyzable generano un complesso stabile che consentirebbe la proteina ATP-associazione essere catturato. AMP-PNP e ATP-γ-S-Mg2 +sono altri analoghi di ATP non idrolizzabili che potrebbero essere testati. Per gli studi di HerA-NurA, mescolare 5 µM di proteina purificata con ATP-γ-S e ADP alle concentrazioni che variano da 0-1 mM. Per acquisire l’associazione simultanea di ATP-γ-S e ADP, è possibile aggiungere entrambi i nucleotidi alle concentrazioni uguali o diverse. Aggiungete 2 mM MgCl2 e incubare a 25 ° C in un’incubatrice di bagno secco per 1 h.Nota: Analisi di associazione del nucleotide utilizzando nESI che nativa MS può provocare artefactual associazione alle alte concentrazioni, pertanto legame non specifico deve tener conto29. Per studiare il legame non specifico, aggiungere una maggiore concentrazione di nucleotidi tra 2-5 mM). Per l’analisi del DNA binding Mescolare le proteine e il DNA con un rapporto molare che permette per la formazione del complesso proteina-DNA. Per HerA e HerA-NurA, mescolare 5 µM di proteina purificata con il DNA con un rapporto 1:1. Incubare la HerA-NurA o HerA – miscela di DNA per 30 min a 25 ° C in un’incubatrice di bagno secco finché raggiunge l’equilibrio. La durata e la temperatura di incubazione può variare a seconda della proteina in esame. Buffer scambio campioni della proteina ai buffer compatibile MS. Vengono utilizzati comunemente, soluzione di acetato di ammonio acquoso tra 5 mM-1 M a pH 7-8. Altri buffer compatibile MS includono ethylenediammonium diacetato (EDDA) e Triethylammonium acetato (TEAA)30. Per gli studi di HerA-NurA, usare 200 mM ammonio acetato pH 7.Nota: Ci sono diversi metodi per lo scambio di buffer prima dell’analisi di MS come l’utilizzo di un concentratore di spin o colonne cromatografiche. MS nativa è limitata principalmente dalla qualità del campione come buffer e addotti utilizzato durante la purificazione. Pertanto, è essenziale eseguire desalificazione sufficiente per ottenere picchi risolti. Per studi di legame del ligando HerA-NurA, buffer scambio campioni 6 – 8 volte in acetato di ammonio 200 mM utilizzando un concentratore. Anche se questo metodo è molto più tempo, e assicura che risolto picchi vengono raggiunti e permette per la determinazione della massa accurata delle specie associate ATP/ADP. 2. nativo MS acquisizione e l’analisi per lo studio di complessi proteici e complessi proteina-ligando Nota: Condizioni di MS dovrebbero essere ottimizzate per raggiungere picchi altamente risolti per attivare misure accurate di massa. Questo dettagli sezione Ottimizzazione parametri su uno spettrometro di massa Q-ToF con una 32 k limite superiore m/z quadrupolo. Preparare in casa capillari nano-electrospray ed eseguire massa calibrazione dello strumento per misurazioni di massa accurate come dettagliato di Kirshenbaum et al. 1. Selezionare modalità TOF di mobilità, acquisizione di ioni positivi e sensibilità. Accendere il gas della trappola, API e IMS. Per la separazione di IM, utilizzare azoto (60 mL/min) e argon (8,4 mL/min per la regione di trappola) come punti di partenza e quindi regolare. Impostare un intervallo di acquisizione appropriato m/z. Per una proteina sconosciuta, fasi di ottimizzazione iniziale dovrebbero utilizzare una vasta gamma come 500-32.000 m/z. Caricare 2-3 µ l di soluzione di complessi della proteina per essere analizzati in un capillare rivestito d’oro e inserirlo in un supporto capillare. Delicatamente stringere il capillare e posizionare il capillare in fase di sorgente electrospray e spingete la fase nella posizione per avviare l’acquisizione dei dati. Applicare una pressione di gas basso nano-flusso (0.00-0,05 Bar) fino a quando si forma una goccia sulla punta del capillare. La pressione di nano-flusso può essere eliminata quindi fino a quando lo spray viene mantenuto. Regolare il capillare per quanto riguarda il cono spostando il capillare x, y, z le posizioni e monitorare la corrente per ottenere una stabile corrente di ioni di ioni. Applicare una tensione capillare nella gamma di 0.9-1.6 kV. Impostare il cono di campionamento (50-120 V), offset di origine (60,0), temperatura di sorgente (25 ° C) e flusso di gas di cono (0.0 L/h). Questi suggeriti condizioni iniziali possono essere regolate. Per acquisire uno spettro di massa ben risolto e per massimizzare la trasmissione dello ione, regolare i parametri MS e monitorare il cambiamento risultante negli spettri. Questi includono regolando il flusso di gas nella trappola (2-8 mL/min), egli cella (180 mL/min) e cella IMS (90 mL/min) per realizzare la migliore separazione al massimo la trasmissione. Regolare le energie di collisione trappola se offset di tensione sono insufficienti. Punto di partenza ottimo è tra 10-50 V.Nota: Aumentando l’energia di trappola può rimuovere non covalentemente addotti. Tuttavia, fare attenzione a evitare la dissociazione indotta da collisione e svolgimento del complesso proteina-ligando. Eseguire misure di mobilità dello ione per verificare se le condizioni dello strumento mantengono la proteina in stato piegato nativo (passaggio 3). Migliorare desolvatazione ottimizzando la tensione di polarizzazione di trappola. Punto di partenza ottimo è di 20-45 V. Ottimizzare la velocità dell’onda e altezza delle onde per realizzare la migliore mobilità separazione. Una spiegazione dettagliata e protocollo può essere trovati qui31. Per gli studi di HerA-NurA, utilizzare velocità di onda di 40 (m/s) e altezza d’onda di 550-650 (V). Utilizzare tutti gli altri parametri come valori di default dello strumento. Preparare un campione privo di legante per analisi come un controllo per ogni corsa (Figura 1). Per esperimenti di binding del ligando, eseguire almeno tre misurazioni indipendenti. Utilizzare il software Masslynx per misurare le masse di specie generato e identificare il grippaggio del ligand, come associazione di ATP e l’ADP e Stati oligomerici (Figura 2 e 3). Altri software disponibile includono UniDec32, PULSAR33 e34di Amphitrite. Per quantificare l’abbondanza relativa delle specie, utilizzare le corrispondenti intensità di ioni osservate negli spettri ESI-MS non elaborati (ad esempio associati ligando, oligomeri diversi, ecc.). In alternativa, eseguire quantificazione utilizzando software specializzati come UniDec e Massign35 (Figura 1 e 3 ). 3. l’acquisizione e l’analisi IM-MS Nota: IM-MS separa gli ioni in fase gassosa basato sulla loro dimensione (massa), la forma e la carica. Ogni caratteristica risolto nello spettro di m/z è associata con una distribuzione del tempo di deriva. IM-MS misura il tempo di deriva di un ione che può essere utilizzato per calcolare la sezione trasversale di collisione (CCS). Drift tempo valori misurati da IM-MS dati acquisiti tramite che un tubo di drift può essere correlato linearmente a CCS valori36. Per il viaggio misure di onda IM-MS (TWIMS), calcolo dei valori di CCS richiede una curva di calibrazione ottenuta dagli standard di proteine con noti CCS valori37. Strutture compatte viaggiano più veloce della estesa o strutture allungate grazie alla ridotte interazioni con gas tampone in mobilità cella38. Pertanto, IM-MS può essere utilizzato per rilevare se la struttura nativa ripiegata è stata mantenuta in fase gas39,40. Questa sezione illustra come misurare IM-MS e calcolare il CCS di proteina usando TWIMS. Dopo l’ottimizzazione condizioni dello strumento per la trasmissione stabile (passaggio 2), è necessario ridurre l’energia collisionale e cono di campionamento più basso possibile pur mantenendo qualità buona spettri. Utilizzare la velocità dell’onda ottimizzata e altezza d’onda per acquisire IM-MS (passaggio 2). Misurare la deriva dello ione tempo con IM-MS a tre velocità d’onda differente (ad es., 550, 600 e 650 m/s) pur mantenendo la stessa altezza delle onde (ad es., 40 V). Per determinare gli ioni di proteina CCS, misura proteina calibranti sotto le stesse condizioni di strumento utilizzate per la proteina in esame. Tempo di deriva una calibrazione ottimale richiede la misura di proteine con CCS noto. Selezionare quattro calibranti, due con una massa superiore e due con una massa inferiore a quella della proteina sotto indagine37. La cosa più importante, assicurarsi che l’altezza delle onde e la velocità delle onde sono le stesse di quelle registrate per la proteina in esame. Calcolare manualmente CCS41 o utilizzando un software specializzato come PULSAR33 e Amphitrite34 (Figura 5). Per verificare se la proteina è nativo-come in fase gassosa, confronta i CCS sperimentale al CCS teorico ottenuto da strutture ad alta risoluzione. Per HerA-NurA, il calcolo teorico CCS utilizzando il metodo di proiezione approssimazione (PA) usato in MOBCAL42. Altri metodi includono traiettoria metodo (TM)42 ed esatta sfera dura (EHS)43di scattering. 4. in-soluzione rottura dei complessi della proteina per MS nativa e IM-MS ha condotto la determinazione della struttura Nota: In alcuni casi, i sub-complessi proteici possono essere identificati dalla soluzione stessa come il complesso intatto. Tuttavia, ulteriori informazioni strutturali quali Inter-subunità connettività e assiemi complessi possono essere raggiunto da perturbare le interazioni della proteina in soluzione, per formare Sub complessi. Ciò può essere ottenuto in diversi modi come ad esempio l’aggiunta di solvente organico, aumentando la forza ionica o manipolando il pH. Per guadagnare la comprensione nella connettività di subunità del complesso di HerA-NurA e assiemi complessi, Sub-complessi sono stati generati in soluzione con l’aggiunta di solventi che perturbano le interazioni di subunità. Preparare lo scambio di campione e buffer di proteina in acetato di ammonio come descritto nel passaggio 1. Aggiungere 10-40% di solvente in incrementi del 10%. Solventi utilizzati in genere sono metanolo (MeOH), solfossido dimetilico (DMSO) o acetonitrile (ACN).Nota: Questa operazione può essere eseguita all’interno di un tubo del microcentrifuge in polipropilene. Incubare la miscela sul ghiaccio per 1h. Acquisire uno spettro IM-MS per ogni condizione (passaggi 2 e 3) (Figura 4). Utilizzare il software di vertice44 per assegnare sub-complessi proteici e generare reti di interazione della proteina. In alternativa, generare manualmente un elenco delle masse teoriche della specie previsto. Per garantire subcomplexes sono piegati, calcolare i valori sperimentali di CCS per i sub-complessi e confrontare CCS teorico come descritto nel passaggio 3 (tabella 1, Figura 5 e Figura 6). 5. studiare la stabilità del complesso proteina mediante collisione indotta Unfolding (CIU) Nota: Può essere utilizzato CIU sonda la stabilità strutturale delle proteine e dei loro complessi sul grippaggio del ligand. Pacchetti software specializzati come PULSAR33, Amphitrite34 e CIU suite9 quindi possono essere utilizzati per modellare il dispiegarsi della fase gassosa della proteina in esame con e senza legante. Ad esempio, in questa sezione viene descritta la procedura per il monitoraggio di fase gassosa dispiegarsi traiettorie e indagare l’effetto stabilizzante del grippaggio del DNA e l’ATP del complesso di HerA-NurA. Registrare dati IM-MS aumentando la tensione di accelerazione di trappola da 10 V a 200 V con incrementi di 2-10 V a svolgersi progressivamente la proteina in fase gassosa.Nota: Registrazione più piccoli incrementi risultati in più file di dati da elaborare, tuttavia questo approccio fornisce più risolto trama unfolding, che è importante per analizzare i punti di transizione tra le specie di aperto/chiuso. Analizzare i dati acquisiti utilizzando PULSAR33, Amphitrite34 o CIU suite9 e generare trame spiegamento bidimensionale in unità di CCS in funzione di accelerare la tensione (passaggio 3). Per ogni stato di carica, questo viene creato impilando le distribuzioni di CCS intensità-normalizzato a ogni tensione accelerare (Figura 7 A-Bi). Generare una trama unfolding teorica utilizzando uno dei pacchetti software. I dati saranno montati a un modello di spiegamento. Questo rende possibile quantificare l’energia collisionale in cui dispiegarsi transizioni si verificano e determinano la stabilità delle proteine con e senza leganti associato33. Una transizione dispiegarsi è quando una specie passa da uno stato (basato sui loro valori sperimentali di CCS) in un altro stato con una più grande CCS. Per quantificare le transizioni, calcolare la midpoint(s) transitorio tra Stati che utilizzano algoritmi e software come PULSAR33. Ciò è comunemente segnalata come CV50, ovvero il valore di tensione di collisione (trappola) in cui il 50% di uno specifico stato è esaurito. Utilizzando il valore di50 CV, calcolare l’energia interna totale di un ione utilizzando il centro di massa collisione energia (KECOM)45. KECOM è definito dall’energia interna totale disponibile per la transizione di spiegamento di un ione e viene calcolata dall’energia cinetica e masse dei partner collisione (proteina ion e gas neutro) come descritto nell’equazione (1)10KEcom (eV) = (equazione 1).Dove Z è la carica dello ione, MN è la massa del gas neutro e Mdello ione è la massa dello ione della proteina.Nota: Questo è perché CIU delle proteine è carica dependent46, 47. Si consiglia di eseguire l’analisi KECOM a più di uno stato di carica ( Figura 7Aii). 6. procedure di modellazione per simulazioni di dinamica molecolare differenziale usato in MS integrativa Nota: Utilizzando modelli di subunità proteiche o complessi come da strutture cristalline, simulazioni MD differenziale (complesso con e senza legante proteico) utilizzabile per determinare gli effetti della presenza di ligando ad esempio sulla struttura della proteina e dinamica. In questa sezione i dettagli di un flusso di lavoro e gli strumenti necessari per modellare le procedure necessarie per simulazioni di dinamica molecolare differenziale di set-up. Identificare le subunità che compongono il complesso (Figura 8A, nei passaggi 2 e 3). Modelli esistenti di origine delle unità secondarie, ad esempio, strutture di cristallo da databank RCSB (https://www.rcsb.org). La UniProt voce della proteina conterrà un elenco di conoscere strutture cristallografiche/RMN (http://www.uniprot.org). Se questi non sono disponibili, la sequenza teorica può essere input per BLAST per identificare modelli adatti per omologia modellazione (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Assemblare il complesso nella corretta topologia (Figura 8A-ii). Questo può essere fatto attraverso vari metodi. Le diverse unità secondarie possono essere installate in microscopia elettronica disponibili mappe trovate sul EMDB per assemblare il complesso intatto (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). Un tutorial per montare i file PDB nella EM mappe utilizzando Molecular Dynamics flessibile raccordo (MDFF) può essere trovato qui: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/. Identificare le aree mancante del complesso (Figura 8A-iii). Eseguire l’allineamento multiplo di sequenza (MSA) tra il PDB e sequenza teorica per identificare i residui che possono essere unfitted in strutture cristalline, o eventuali mutazioni ereditate dagli esperimenti di cristallografici. MSA può essere eseguita utilizzando il server Web come il T-caffè (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular). Rigenerare i residui mancanti tramite homology modelling (Figura 8A-iv). Mancante di residui del complesso proteico può essere costruito utilizzando il programma MODELLER (https://salilab.org/modeller/). MODELLER può produrre un insieme di n modelli in diverse configurazioni rigenerate. Buoni modelli possono essere identificati sulla base di loro punteggio discreti ottimizzato proteine energia (stimolante). Un tutorial completo è fornito sul sito Web del software (https://salilab.org/modeller/tutorial/). Eseguire simulazioni di dinamica molecolare differenziale (MD) del complesso proteico (Figura 8B) per identificare le aree delle proteine che rispondono ad un cambiamento ambientale particolare, ad esempio, la presenza di un ligando. In tali simulazioni, parametri comportamentali da simulazione A (solo la porzione proteica) che agisce come un riferimento, viene sottratta dalla simulazione B (proteina + ligando). La fluttuazione di differenziale medio quadrato della radice (RMSF) calcolata tra simulazioni A e B può informare sulle regioni della proteina che aumentano o diminuiscono della flessibilità in un modo dipendente dal ligando. Eseguire simulazioni MD e analisi a valle utilizzando GROMACS (http://www.gromacs.org). Un tutorial può essere trovata a: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. A elimate pregiudizi da modello, la struttura del complesso-ligando deve essere generata in primo luogo. La proteina viene quindi copiata da questo senza il ligando, per produrre un modello di proteina identico al complesso-ligando.

Representative Results

Nativo MS risultati hanno rivelato lo stato oligomerico, la composizione e la topologia del complesso HerA-NurA (Figura 1). Come interazioni non-covalenti sono conservati in fase gassosa, MS nativa di esperimenti di titolazioni di ADP e ATP-γ-S determinata l’associazione del nucleotide pairwise da HerA-NurA (Figura 2) e che l’aumento della concentrazione di ATP-γ-S aumenta la relativa intensità di esamerica HerA (Figura 3). Informazioni strutturali per quanto riguarda subunità interazioni sono state ottenute dalle interruzioni nella soluzione seguita da MS nativa e furono d’accordo con e masse teoriche (Figura 4 e tabella 1). I valori sperimentali di CCS di proteine e loro complessi è stato derivato dagli esperimenti IM-MS (Figura 5). Questi valori sono gassoso rotazionale media calcoli della sezione trasversale della forma molecolare e descrivono lo stato dimensionale della proteina. Valori di CCS sono confrontati alle misure teoriche dalla cristallografia a raggi x e un buon accordo ne deduce che la forma nativa in conservati in fase gassosa (tabella 1). Questa convalida utilizzando i valori di CCS per la costruzione di modelli a bassa risoluzione delle proteine Assemblea48. CCSs sperimentale può essere calcolato per ogni ione di stato di carica. Un modellatore di nativo-come proteina può dar luogo a dichiarano gli ioni di carica con valori simili di CCS. Tuttavia, gli ioni dello stato di carica superiori aumentato coulombiane repulsioni che possono portare a proteina fase gassosa dispiegarsi più grandi CCS valori e rispetto il CCSS teorica. Il valore di CCS del più basso stato di carica degli ioni sono quindi solitamente utilizzato49. Per HerA-NurA, esperimenti di rottura in soluzione su HerA e HerA-NurA con e senza DNA richiesto la generazione di un percorso di assembly a partire da monomeri poi formando l’intero esamerica HerA (HerA6)-dimerica NurA (NurA2) complesso con il DNA (Figura 6). Differenze nelle trame dispiegarsi CIU la apo (senza legante) e ligando associato definiscono il cambiamento nella stabilità del complesso al grippaggio del ligand. Una maggiore CV50 o valore KECOM implica un più stabilizzato agli ioni in fase gassosa. Analisi diCOM di CIU e KE ha rivelato che DNA associato HerA-NurA è più stabile del complesso DNA-free (Figura 7Aii). Da analisi di CIU-MS nei rispettivi Stati di trifosfato di adenosina-legante, stato legato quattro-ATP-γ-S ridotta stabilità del complesso in fase gassosa e sei stato legato -ATP-γ-S dove sono tutti i siti è occupati era il più stabile (Figura 7Bii). MS nativa può rivelare il nucleotide discreto vincolano Stati di HerA; Tuttavia, non può distinguere quali subunità di HerA sono vincolanti ATP e dove si svolge questa associazione. Queste informazioni possono essere derivate da simulazioni MD solvente espliciti su esamerica HerA e il HerA-NurA seguendo il flusso di lavoro di sintesi (Figura 8). Figura 1. Interrogando lo stato oligomerico, la composizione e la topologia del complesso non covalente HerA-NurA. (A) spettri di massa di HerA, HerA-NurA e HerA-NurA in presenza di DNA (DNA double-stranded di 15,4 kDa 25 bp). Il sub-complesso di HerA esiste come un hexamer sia un heptamer. NurA dimero si lega e a un hexamer HerA imponente oligomerici conversione. Il DNA lega il complesso formato di HerA – NurA (risultati adattati da Z. Ahdash et al., 201722). (B) relative intensità delle specie identificate sono calcolati utilizzando UniDec32. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nella figura 2. Nativo di ESI-MS rivela il meccanismo di associazione del nucleotide di HerA-NurA. Spettri di massa (A) HerA-NurA e (B) HerA-NurA-DNA con aumento delle concentrazioni di (i) ATP-γ-S e (ii) ADP. Masse misurate sono rispetto alle masse teoriche e la quantità di ATP-γ-S o ADP associato sono determinati. Masse misurate e numero di nucleotidi associati vengono visualizzati sugli spettri. Esperimenti di titolazioni ATP-γ-S e ADP determinato l’associazione pairwise del nucleotide di HerA-NurA da solo e quando nel complesso con il DNA che indica un meccanismo di reazione ciclica (risultati adattati da Z. Ahdash et al., 201722). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nella figura 3. Misurare l’effetto di aumento delle concentrazioni di ATP-γ-S sullo stato oligomerico HerA. (A) spettri di massa di HerA all’aumento delle concentrazioni di ATP-γ-S. (B) grafico che mostra le intensità relative di specie diverse da nativa MS calcolata utilizzando UniDec deconvoluzione software32. La concentrazione di ATP-γ-S aumenta, aumenta anche l’intensità relativa di esamerica HerA. Numero di molecole di ATP-γ-S associato viene visualizzato sugli spettri (risultati adattati da Z. Ahdash et al., 201722). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nella figura 4. Massa spettri e prodotti di dissociazione sub-complesso di HerA (A) e (B) HerA-NurA (i) da solo e in presenza di sequela (ii) del DNA di rottura nella soluzione. Sono stati eseguiti esperimenti di rottura nella soluzione utilizzando 10-40% di Acetonitrile, metanolo (MeOH) o solfossido dimetilico (DMSO) e ha provocato la formazione di vari subcomplexes. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nella figura 5. Distribuzioni di ioni mobilità arrivo tempo mostrate su un asse di CCS per complessi e sub-complessi generati. Icona per ogni sub-complessi in correlazione con quelli annotati su spettri nella Figura 4. Masse sperimentale e calcolate e valori di CCS di Sub-complessi sono elencati in tabella 1 che ha mostrato un accordo tra i valori sperimentali e calcolati (dopo aver considerato l’incertezza tipica nella risoluzione di viaggio dello ione dell’onda spettrometria totale mobilità di ± 5 – 8). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nella figura 6. Via di assemblaggio del complesso HerA-NurA generato dalle interruzioni nella soluzione native cerchi MS e IM-signora colorate indicano condizioni dove è stata osservata ogni sub-complesso: nativo (verde, prima della rottura), metanolo (giallo), DMSO (viola) o Acetonitrile (rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nella figura 7. Studiando l’effetto stabilizzante di (A) DNA su HerA-NurA e (B) ATP binding a HerA-NurA-DNA. (i) gassoso CIU-MS trame e calcolo di energie (KEcom) (ii) centro-di-massa collisione mostrano che che la presenza di dsDNA stabilizza il complesso di HerA-NurA e che l’ATP-γ-S sei associato dello stato è il più stabile. Viene visualizzata la finestra di stabilizzazione per stati di carica differenti. Appezzamenti sono stati generati utilizzando PULSAR 33. Risultati da (A) adattati da Z. Ahdash et al., 201722. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8. Flusso di lavoro per le procedure di modellazione per simulazioni di dinamica molecolare differenziale. (A) generando il complesso sotto indagine dalla creazione della topologia da esistenti subunità e ricostruzione mancante residui. (B) flusso di lavoro per l’esecuzione di simulazioni di dinamica molecolare sulla proteina complessa con e senza legante. Sono simulazioni di dinamica molecolare correva per la proteina solo che agisce come un riferimento e che viene sottratto dalla simulazione della proteina più ligando. Questa è seguita da calcolare la fluttuazione differenziale medio quadrato della radice (RMSF) tra le simulazioni e determinare l’effetto del grippaggio del ligand. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Complessi / Sub-complessi Massa teorica (kDa) Massa sperimentale (kDa) CCS teorica (Å2) CCS sperimentale (Å2) [carica] Condizione HN HerA6- NurA2 416.22 417.85 14531 14577 [42 +]14599 [43 +]14608 [44 +]14637 [45 +] 10-20% ACN, DMSO 10-40%, 10% MeOH HerA6- NurA2- dsDNA 431.72 432.27 – 14661 [39 +]14728 [40 +]14781 [41 +]14837 [42 +] ACN 10%, 10% MeOH NurA1 39.12 38,18 3254 2618 [10 +]2746 [11 +]2878 [12 +] 10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO NurA2 78,24 78.36 4890 4903 [16 +]4614 [17 +]4537 [18 +]4666 [19 +] 10-40% MeOH, 20-40% DMSO HerA1 56,33 56.32 4131 3647 [14 +]3792 [15 +]3950 [16 +] ACN DI 10-40%, 40% DMSO HerA2 112.66 112.95 6475 5648 [20 +]5747 [21 +]5842 [22 +]5996 [23 +] 40% meth, ACN 10-40% HerA3 168.99 169.39 8607 7501 [25 +]7616 [26 +]7717 [27 +]7867 [28 +] 10-40% MeOH, CAN 10-40%, 40% DMSO HerA3 + DNA 183.99 184.976 – 7655 [26 +]7990 [27 +]8107 [28 +] 10-30% ACN HerA4 225.32 226.2 10477 9205 [30 +]9287 [31]9493 [32 +]9961 [33 +] 10-40% MeOH, ACN 10-40% HerA4 + DNA 240.82 241.33 – 9637 [31 +]9756 [32 +]9830 [33 +] 10-30% ACN HerA5 281.65 282.75 11853 10847 [36 +]10958 [37 +]11161 [38 +] 30-40% ACN HerA6 337.98 339.3 12517 12335 [38 +]12386 [39 +]12498 [40 +]12590 [41 +]12676 [42 +]13019 [43 +] 10-40% MeOH, ACN 10-40% HerA6 + DNA 353,48 354.626 – 12890 [40 +]13081 [41 +]13184 [42 +]13273 [43 +]13463 [44 +]13576 [45 +] 30% ACN HerA7 394,3 395.85 13901 14154 [42 +]14219 [43 +]14261 [44 +]14285 [45 +]14335 [46 +] 10-40% MeOH, ACN 10-40%, 10-40% DMSO HerA7 + DNA 409,8 410.62 – 14414 [41 +]14510 [42 +]14558 [43 +]14598 [44 +]14630 [45 +]14641 [46 +] 10% ACN Tabella 1. Masse sperimentale e calcolate e valori di CCS di HerA-NurA e suoi sub-complessi generato studi di rottura in soluzione forma.

Discussion

MS sta giocando un ruolo sempre più importante nel caratterizzare la stechiometria, interazioni e l’architettura di subunità dei complessi della proteina. IM-MS dati possono essere utilizzati a definire modalità topologica di unità secondarie all’interno di complessi multicomponente. Rispetto ad altri metodi di biologia strutturale esistente, MS ha diversi vantaggi. Nativa MS è una tecnica rapida e altamente sensibile e può essere utilizzata per campioni eterogenei della proteina della sonda. Quando accoppiato con esperimenti di rottura in soluzione, vie di dissociazione delle assemblee della proteina possono essere monitorate. Insieme ai modelli di omologia o strutture di cristallo, le informazioni offerte da MS strutturali offre uno strumento per lo studio di interazioni proteina-ligando e fornire modelli quasi nativa e assemblaggio vie11.

Qui, descriviamo le procedure sperimentali necessarie per analizzare la stechiometria e la composizione delle interazioni proteina-ligando, con uno o più ligandi, usando MS integrativa. Questo include la preparazione del campione di MS, acquisizione dati, analisi dei dati e l’integrazione dei dati di MS utilizzando strumenti computazionali. Per fare questo, abbiamo usato il DNA-resezione HerA-NurA etero-oligomeri proteina complessa, legata a tre ligandi (DNA, ATP e ADP), come il nostro sistema di modello. Il protocollo viene illustrato l’utilizzo del software attualmente disponibile per facilitare la presentazione e l’analisi dei dati.

L’acquisizione di spettri di alta qualità è importante per l’analisi di associazione del ligando, quindi, la procedura di preparazione del campione attento è critica, purificazione della proteina, titolazione del ligando e del cambio di buffer. Una limitazione di nESI nativa MS quando si studia il grippaggio del ligand è legame non specifico. Legame non specifico si verifica durante la gocciolina desolvatazione durante tutto il processo di electrospray. Questo aumenta la concentrazione del ligando e quindi altera il rapporto proteina/ligando29. L’associazione di nucleotidi si traduce in una relativamente piccola differenza di massa tra apo e proteina del nucleotide-che non altera l’ionizzazione efficienza50,51.

Abbiamo usato il sistema MS G2-Si Synapt per il nostro lavoro, ma i protocolli sono applicabili per le indagini differenti di altri complessi proteina-ligando utilizzando altri spettrometri di massa di nano-electrospray commercialmente disponibili. Integrativa MS strutturali sempre più sta giocando un ruolo importante nell’affrontare problemi biologici di maggiore complessità. Il flusso di lavoro e le tecniche qui descritte sono particolarmente adatti per capire le conseguenze strutturali e la costruzione di meccanismi di complesso di proteine e formazione di proteina-ligando che altrimenti sono difficili da studiare tecniche strutturali convenzionali .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Peter Karl Hopfner e Robert Thomas Byrne per campioni di proteine fornendo gentilmente di HerA e HerA-NurA e per il loro aiuto con disegno sperimentale. Ringraziamo anche Dr. Eamonn Reading per la sua revisione del manoscritto. Noi riconosciamo con gratitudine i nostri organismi di finanziamento: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] e Royal Society [RG150216 a A.P.].

Materials

Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt Merck Millipore 119120-25MG
Adenosine 5′-diphosphate  Sigma-Aldrich 20398-34-9
Ammonium acetate solution Sigma-Aldrich A2706
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad 7326204
Vivaspin concentrator Sartorius Z614041-25EA
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Water TraceSelect Sigma-Aldrich 95305
Borosilicate Capillaries Harvard Apparatus 300060
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Ahdash, Z., Lau, A. M., Martens, C., Politis, A. Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e57966, doi:10.3791/57966 (2018).
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