Analyse des Architectures de protéine et Complexes protéine-Ligand par spectrométrie de masse structurelle intégrative

1. préparation pour MS Native des protéines et des Complexes protéine-Ligand NOTE : Pour mieux comprendre les bases moléculaires d’une protéine complexe et liaison de ligand à l’aide de MS native, préparation de l’échantillon adéquat est la clé. Cette section vise à mettre en évidence les étapes de préparation indispensable échantillon avant l’analyse MS utilisant le complexe HerA-NurA qui lie l’ADN et des nucléotides à titre d’exemple. Préparer 20 µL d’extraits de concentré de protéine purifié (généralement 15 à 30 µM) dans un tube de 1,5 mL. Pour les analyses de liaison ATP ou ADPNOTE : Ajouter des concentrations croissantes de la non hydrolysables ATP adénosine analogique 5′-O-(3-thiotriphosphate), tetralithium sel (ATP-γ-S) ou 5′ adénosine-diphosphate (ADP). Dérivés de ATP non hydrolysables génèrent un complexe stable qui permettrait à la protéine de liaison ATP à capturer. Autres non hydrolysables analogues d’ATP qui pourraient être testés comprennent AMP-PNP et ATP-γ-S-Mg2 +. Pour les études HerA-NurA, mélanger 5 µM de protéine purifiée avec ATP-γ-S et ADP à des concentrations allant de 0-1 mM. Pour capturer une liaison ATP-γ-S et ADP simultanée, ajouter les deux nucléotides à des concentrations identiques ou différentes. Ajouter 2 mM MgCl2 et incuber à 25 ° C dans une étuve à bain sec pendant 1 h.Remarque : Analyse de liaison de nucléotides à l’aide de nESI que Native MS peut se traduire par liaison artéfactuelles à des concentrations élevées, donc non-spécifiques doit prendre en compte29. Afin d’étudier les liaisons non spécifiques, ajouter une concentration plus élevée des nucléotides entre 2-5 mM). Pour analyse de liaison génétique Mélanger les protéines et l’ADN à un rapport molaire qui prévoit la formation d’un complexe protéine-ADN. Pour HerA et HerA-NurA, mélanger 5 µM de protéine purifiée avec de l’ADN à un ratio de 1:1. Incuber le HerA-NurA ou HerA – mélange d’ADN pendant 30 min à 25 ° C dans une étuve à bain sec jusqu’à ce qu’il atteint l’équilibre. La durée et la température d’incubation peuvent varier selon la protéine incriminés. Mémoire tampon échange des échantillons de protéines aux tampons compatibles MS. Solution d’acétate d’ammonium aqueux entre 5 mM-1 M à pH 7 et 8 sont généralement utilisés. Autres tampons compatibles MS comprennent ethylenediammonium diacétate (EDDA) et triéthylammonium acétate (TEAA)30. Pour les études HerA-NurA, utiliser 200 mM d’ammonium acétate pH 7.Remarque : Il existe plusieurs méthodes pour l’échange de la mémoire tampon avant l’analyse par SM comme l’utilisation d’un concentrateur de spin ou colonnes de chromatographie. Native MS est principalement limitée par la qualité de l’échantillon, tels que les adduits et met en mémoire tampon utilisée durant la purification. Par conséquent, il est essentiel pour effectuer le dessalage suffisante pour obtenir des pics résolus. Pour les études de liaison de ligand HerA-NurA, tampon échange échantillons 6 – 8 fois en acétate d’ammonium de 200 mM à l’aide d’un concentrateur. Bien que cette méthode est beaucoup plus de temps, il veille à ce que soit résolu sommets sont atteints et permettant la détermination de la masse exacte des espèces dépendant de l’ATP/ADP. 2. native MS Acquisition et analyse pour l’étude des Complexes protéiques et des Complexes protéine-Ligand Remarque : Les conditions SM doivent être optimisées pour atteindre des pics très résolues afin de permettre des mesures précises de massives. Ce paragraphe détails optimisé paramètres sur un spectromètre de masse Q-ToF avec un quadripôle de m/z 32 k limite supérieure. Préparer les capillaires internes nano-electrospray et effectuer d’étalonnage des masses instrument pour des mesures précises de massives comme indiqué par Kirshenbaum et al. 1. Sélectionnez la sensibilité, l’acquisition de l’ion positif et modes TOF de mobilité. Allumez les gaz piège, API et IMS. Pour la séparation de l’IM, utilisent l’azote (60 mL/min) et argon (8,4 mL/min pour la région de piège) comme points de départ et ensuite ajuster. Définissez une plage d’acquisition approprié m/z. Pour une protéine inconnue, étapes d’optimisation initiale doivent utiliser une large gamme telle que 500-32 000 m/z. Charger 2 ou 3 µL de la solution complexe de protéines à doser dans un capillaire or couché et l’insérer dans un support capillaire. Doucement, serrer le tube capillaire et placez le tube capillaire au stade de la source électrospray et glissez la scène en position de commencer à acquérir des données. Appliquez une pression de gaz de nano-débit faible (0,00 à 0,05 Bar) jusqu’à ce qu’une goutte d’eau est formée à l’extrémité du capillaire. La pression d’alimentation-nano peut ensuite être supprimée jusqu’à ce que le spray est maintenu. Ajuster le capillaire en ce qui concerne le cône en déplaçant le capillaire x, y, z les positions et surveiller l’ion actuelle pour atteindre un ion stable actuel. Appliquer une tension capillaire de l’ordre de 0,9 à 1,6 kV. Définissez le cône d’échantillonnage (50-120 V), température (25 ° C) de la source et l’offset source (60,0), débit de gaz cône (0.0 L/h). Les suggérées conditions initiales peuvent être ajustées. Pour acquérir un spectre de masse bien résolu et maximiser la transmission de l’ion, régler les paramètres de MS et de surveiller le changement qui en résulte dans les spectres. Ceux-ci incluent le réglage du débit de gaz dans le piège (2 à 8 mL/min), la cellule il (180 mL/min) et la cellule IMS (90 mL/min) qui permet la meilleure séparation à transmission maximale. Ajuster les énergies de collision de piège si les offsets de tension sont insuffisantes. Un point de départ optimal est entre 10 et 50 V.NOTE : Augmenter l’énergie de piège peut supprimer lié de façon non covalente adduits. Cependant, prendre soin d’éviter la dissociation induite par collision et déroulement du complexe protéine-ligand. Effectuer des mesures de mobilité ionique pour vérifier si des conditions aux instruments conservent la protéine à l’état natif plié (étape 3). Améliorer la désolvatation en optimisant la tension de polarisation de piège. Un point de départ optimal est V 20-45. Optimiser la vitesse de l’onde et la hauteur des vagues qui permet la meilleure mobilité séparation. Une explication détaillée et protocole peuvent être trouvés ici31. Pour les études HerA-NurA, utiliser la vitesse de l’onde de 40 (m/s) et la hauteur des vagues de 550-650 (V). Utiliser tous les autres paramètres comme valeurs par défaut d’instrument. Préparer un échantillon exempt de ligand pour l’analyse comme un contrôle pour chaque série (Figure 1). Pour des expériences de liaison de ligand, effectuer au moins trois mesures indépendantes. Utilisez le logiciel Masslynx pour mesurer les masses des espèces générées et identifier la liaison du ligand, telles que la liaison de l’ATP et l’ADP et États oligomériques (Figure 2 et 3). Autres logiciels disponibles incluent UniDec32, PULSAR33 et Amphitrite,34. Afin de quantifier l’abondance relative des espèces, utiliser l’ion correspondant des intensités observées dans les spectres de ESI-MS bruts (par exemple ligand lié, oligomères différents, etc..). Vous pouvez également exécuter quantification à l’aide de logiciels spécialisés comme UniDec et Massign35 (Figure 1 et 3 ). 3. acquisition et l’analyse IM-MS NOTE : IM-MS sépare les ions dans la phase gazeuse issu de leur taille (masse), la forme et la charge. Toutes les fonctionnalités résolue dans spectre de m/z sont associée à une distribution de temps de dérive. IM-MS mesure la durée de dérive d’un ion qui peut être utilisée pour calculer la section efficace de collision (CCS). Les valeurs de date dérive mesurées de données acquises IM-MS à l’aide de qu’un tube en dérive peut être linéairement corrélé à CCS valeurs36. Pour voyager de mesures d’ondes IM-MS (TWIMS), calculer des valeurs de CCS nécessite une courbe d’étalonnage obtenue à partir des normes de protéine connus CCS valeurs37. Structures compactes voyagent plus vite que l’étendue ou structures allongées due à réduit les interactions avec les gaz de tampon dans la mobilité cellulaire38. Par conséquent, IM-MS peut être utilisé pour détecter si la structure plissée native a été retenue dans le gaz phase39,40. Cette section décrit comment mesurer IM-MS et calculer le CCS de protéine à l’aide de TWIMS. Après l’optimisation des conditions d’instruments pour une transmission stable (étape 2), réduire l’énergie de collision et le cône d’échantillonnage aussi bas que possible tout en conservant une qualité bonne de spectres. Utiliser la vitesse de l’onde optimisée et la hauteur des vagues à acquérir IM-MS (étape 2). Mesurer la dérive d’ion temps avec IM-MS à trois vitesses des ondes différentes (par exemple, 550, 600 et 650 m/s) tout en conservant la même hauteur de vague (par exemple, 40 V). Pour déterminer les ions de protéines CCS, calibrants de protéine de mesure dans les mêmes conditions d’instrument utilisées pour la protéine incriminés. Calibration de dérive-temps optimale requiert la mesure des protéines avec CCS connus. Sélectionnez les quatre calibrants, deux avec une masse supérieure et deux avec une masse inférieure à celle de la protéine sous enquête37. Surtout, assurez-vous que la hauteur des vagues et la vitesse de l’onde sont les mêmes que ceux enregistrés pour la protéine incriminés. Calculer CCS manuellement41 ou à l’aide d’un logiciel spécialisé tel que le PULSAR33 et Amphitrite34 (Figure 5). Pour vérifier si la protéine est comme un natif dans la phase gazeuse, CCS expérimentale compare au CSC théorique obtenu à partir des structures de haute résolution. Pour HerA-NurA, calculer CCS théorique en utilisant la méthode de Projection rapprochement (PA) utilisée dans MOBCAL42. Autres méthodes incluent la trajectoire méthode (TM)42 et des sphères dures exacte diffusion (EHS)43. 4. en-Solution les perturbations des Complexes de protéine Native MS et IM-MS a conduit la détermination de la Structure Remarque : Des complexes de protéine peuvent dans certains cas être identifiées à la même solution que le complexe intact. Toutefois, davantage d’informations structurelles telles que la sous-unité inter connectivité et complexes d’assemblage peuvent être assurées de perturber les interactions des protéines en solution, pour former des complexes sous. Ceci peut être réalisé de plusieurs façons, telles que l’ajout de solvant organique, augmente la force ionique ou en manipulant le pH. Pour avoir un aperçu de la connectivité de sous-unité complexe HerA-NurA et assemblage complexe, secondaires complexes ont été produites en solution en ajoutant des solvants qui perturbent les interactions de sous-unité. Préparer l’échange de sample et tampon de protéine dans l’acétate d’ammonium comme décrit à l’étape 1. Ajouter 10 à 40 % de solvant par incréments de 10 %. Solvants utilisés généralement sont le méthanol (MeOH), le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou acétonitrile (ACN).Remarque : Ceci peut être effectuée dans un tube en polypropylène microcentrifugeuse. Incuber le mélange sur la glace pendant 1 h. Acquérir un spectre d’IM-MS pour chaque affection (étapes 2 et 3) (Figure 4). Utilisez le logiciel SUMMIT44 pour assigner des complexes de protéine et de générer des réseaux d’interactions protéiques. Vous pouvez également générer manuellement une liste de masses théoriques de l’espèce attendue. Afin de subcomplexes sont pliées, calculer les valeurs expérimentales de CCS pour les complexes sous et comparer à CCS théoriques, comme l’a expliqué à l’ étape 3 (tableau 1, Figure 5 et Figure 6). 5. enquête sur la stabilité des protéines complexes à l’aide de dépliage induite par Collision (CIU) Remarque : CIU permet la stabilité structurale des protéines et leurs complexes sur la liaison du ligand de la sonde. Spécialiste des progiciels tels que PULSAR33, Amphitrite34 et CIU suite9 puis peuvent être utilisés que pour modéliser le déroulement phase gazeuse de la protéine étudiée avec et sans ligand. À titre d’exemple, cette section décrit les modalités de la surveillance de phase gazeuse qui se déroulent de trajectoires et d’étudier l’effet stabilisant de liaison ADN et ATP sur le complexe de HerA-NurA. Enregistrer des données IM-MS tout en augmentant la tension d’accélération de piège de 10 V à 200 V en incréments de V 2-10 de se déployer progressivement de la protéine dans la phase gazeuse.NOTE : Enregistrement petits incréments résultats dans plusieurs fichiers de données à traiter, cependant, cette approche fournit plus résolu intrigue qui se déroule, qui est important pour analyser les points de transition entre les espèces plié/déplié. Analyser les données recueillies à l’aide de PULSAR33, Amphitrite34 ou SDI suite9 et générer des parcelles qui se déroule à deux dimensions en unités du CSC en fonction de la tension (étape 3) d’accélération. Pour chaque État de charge, celle-ci est créée par empilement les distributions de CCS intensité-normalisé à chaque tension d’accélération (Figure 7 A-Bi). Générer une intrigue qui se déroule théorique en utilisant l’un des progiciels. Les données seront dotées un modèle qui se déroule. Cela rend possible de quantifier l’énergie de collision de transitions qui se déroule se produisent et déterminer la stabilité des protéines avec et sans des ligands liés33. Une transition qui se déroule est lorsqu’une transition de l’espèce d’un État (selon leurs valeurs expérimentales de CCS) vers un autre État avec un CCS plus grande. Pour doser les transitions, calculer les midpoint(s) transition entre États à l’aide d’algorithmes et logiciels tels que PULSAR33. Ceci est fréquemment signalé comme CV50, qui est la valeur de tension de collision (trap) au cours de laquelle 50 % d’un État donné est épuisée. À l’aide de la valeur de50 CV, calculer l’énergie interne totale d’un ion en utilisant le centre de masse collision énergie (KECOM)45. KECOM est défini par l’énergie interne totale disponible pour la transition qui se déroule d’un ion et est calculée à partir l’énergie cinétique et les masses des partenaires collision (protéine ion et gaz neutre) comme décrit dans l’équation (1)10KEcom (eV) = (équation 1).Où Z est la charge ionique,N est la masse de gaz neutre et MION est la masse de l’ion de protéine.NOTE : C’est parce que CIU de protéines est frais dependent46, 47. Il est recommandé d’effectuer l’analyse KECOM à plus d’un état de charge ( Figure 7Aii). 6. modélisation des procédures pour des Simulations de dynamique moléculaire différentiels utilisés dans Integrative MS Remarque : L’utilisation de modèles de sous-unités protéiques ou complexes tels que des structures cristallines, différentiel MD simulations (protéines complexes avec et sans ligand) peuvent être utilisées pour déterminer les effets de par exemple présence de ligand sur la dynamique et la structure des protéines. Cette section décrit en détail un flux de travail et les outils nécessaires pour la modélisation des procédures nécessaires pour les simulations de dynamique moléculaire différentielle de Set-up. Identifier les sous-unités qui composent le complexe (Figure 8A, aux étapes 2 et 3). Source des modèles existants de sous-unités, par exemple, les structures cristallines de la Banque de données RCSB (https://www.rcsb.org). Le UniProt, entrée de la protéine contiendra une liste des savons structures cristallographiques/NMR (http://www.uniprot.org). Si ce ne sont pas disponibles, la séquence théorique peut être entrée à BLAST pour identifier des modèles appropriés d’homologie modélisation (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Assembler le complexe dans la topologie correct (Figure 8A-ii). Cela peut être fait par le biais de diverses méthodes. Les sous-unités individuelles peuvent être montées dans la microscopie électronique disponible cartes trouvées sur le EMDB pour assembler le complexe intact (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). Un tutoriel pour le montage des fichiers PDB EM des cartes à l’aide du raccord souple dynamique moléculaire (MDFF) peut être trouvé ici : http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/. Identifier les régions manquantes du complexe (Figure 8A-iii). Effectuer des alignements multiples de séquences (MSA) APB / séquence théorique visant à identifier les résidus qui peuvent être non ajustées dans les structures cristallines, ou n’importe quel mutations héritées d’expériences cristallographiques. MSA peut être effectuée en utilisant les serveurs Web tels que le T-café (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular). Régénérer les résidus manquants par homologie de modélisation (Figure 8A-iv). Manque de résidus de la protéine complexe peut être construit en utilisant le programme modeleur (https://salilab.org/modeller/). Modeleur peut produire un ensemble de modèles n dans différentes configurations régénérées. Les bons modèles peuvent être identifiés selon leur score de discrètes optimisé protéine énergie (DOPE). Un tutoriel complet est disponible sur le site du logiciel (https://salilab.org/modeller/tutorial/). Réaliser des simulations de différentiel dynamique moléculaire (DM) de la protéine complexe (Figure 8B) pour identifier les régions de protéines qui répondent à un changement environnemental particulier, par exemple, la présence d’un ligand. Dans ces simulations, paramètres comportements de Simulation A (protéine uniquement) qui agit comme une référence, est soustraite de la Simulation B (protéine + ligand). La fluctuation de différentielle quadratique moyenne (FPMR) calculée entre les Simulations A et B peut informer sur les régions de la protéine qui augmentent ou diminuent sur la souplesse d’une manière dépendante du ligand. Effectuer des simulations de MD et analyse en aval à l’aide de GROMACS (http://www.gromacs.org). Un tutoriel peut être trouvé à : http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. Biais d’elimate de modèle, la structure du complexe ligand-limite devrait être générée tout d’abord. La protéine est ensuite copiée à partir cela sans le ligand, pour produire un modèle de protéines identique au complexe ligand lié.