JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Published: October 15, 2018
doi:
10.3791/57966
, , ,
1Department of Chemistry,King’s College London

Summary

De Spectrometrie van de massa (MS) heeft ontpopt als een belangrijk instrument voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van macromoleculaire assemblages. Hier, wij op basis van MS om te ondervragen eiwit complexvorming en ligand bindende benaderingen worden geïntegreerd.

Abstract

Eiwitten zijn een belangrijke klasse van biologische macromoleculen die vele spelen een belangrijke rol in de cellulaire functies spelen, met inbegrip van genexpressie, katalyseren metabole reacties, DNA-reparatie en replicatie. Daarom biedt een gedetailleerd inzicht in deze processen kritische informatie over hoe cellen functie. Integratieve structurele MS-methoden bieden structurele en dynamische informatie over eiwit complex vergadering, complexe connectiviteit, subeenheid stoichiometrie, eiwit oligomerisatie en ligand bindend. Recente vooruitgang in integratieve structurele MS hebben toegestaan voor de karakterisatie van uitdagende biologische systemen, met inbegrip van grote DNA-bindende proteïnen en membraaneiwitten. Dit protocol wordt beschreven hoe diverse MS om gegevens te integreren, zoals native MS en ion mobiliteit-massaspectrometrie (IM-MS) met moleculaire dynamica simulaties inzichten te krijgen in een helicase-nuclease DNA herstellen eiwit complex. De daaruit voortvloeiende aanpak biedt een kader voor gedetailleerde studies van ligand binding met andere eiwitcomplexen betrokken bij belangrijke biologische processen.

Introduction

Native massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten en hun complexen wordt uitgevoerd met behulp van electrospray en nano-electrospray ionisatie (nESI), die behouden vouwing van eiwitten en niet-covalente interacties tijdens de behandeling door ionisering proces1, 2. In native MS, de structuur van eiwitten en hun complexen worden bewaard in een in de buurt van-native staat in de gasfase3,4. Native MS detecteert meerdere geladen eiwitten ionen, die worden gescheiden volgens hun massa verhouding (m/z) waardoor de massa van het eiwit of eiwit-ligand opladen complex moet worden berekend. Deze gegevens kunnen de bepaling van een intact eiwit stoichiometrie, subeenheid samenstelling ligand bindende en interactie netwerken3,4,5,6. Native MS heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere technieken dergelijke röntgendiffractie en nucleaire magnetische resonantie spectroscopie5. Ten eerste, inheemse MS is een snelle en uiterst gevoelige techniek, vereisen slechts een paar microliters (2-3 µL) van monster bij relatief lage complexe eindconcentraties in de hoge nM tot lage µM bereik6. Anderzijds kan inheemse MS ondervragen heterogene EiwitSteekproeven waardoor het analyseren van meerdere eiwitten en valt bestuurlijk gezien onder oligomere gelijktijdig kan worden gebruikt. Ten derde, inheemse MS vereist geen EiwitSteekproeven te worden gewijzigd vóór de analyse door chemische crosslinking of eiwit etikettering. Deze voordelen hebben structurele MS een krachtig hulpmiddel voor het structurele onderzoek van eiwitcomplexen gemaakt.

Native MS kan worden gecombineerd met ion mobiliteit (IM), een techniek die meet de tijd dat een eiwit-ion neemt om te reizen door middel van een elektrisch veld, waardoor het collisional doorsnede (CCS) te bepalen. Het CCS biedt lage resolutie structuurgegevens, waarmee topologie en conformationele heterogeniteit informatie van eiwitten kunnen worden verkregen. Bovendien kan het de behandeling van structurele modellen eiwit gegenereerd door computationele benaderingen.

Gas-fase eiwitstabiliteit kan worden onderzocht met behulp van botsing geïnduceerde ontvouwen (ICB) gemeten door IM-MS. Tijdens het proces van de ICB, zijn eiwit ionen versneld en geactiveerd door middel van verhoogde versnellende botsingen met een gas inerte buffer binnen een massaspectrometer7,8,9. Dit collisional activeringsproces zorgt ervoor dat het eiwit te gedeeltelijk ontvouwen, wat zich in een toename van CCS vertaalt. Deze verandering in CCS en de energie die nodig is te ontvouwen van het eiwit kan worden gemeten met behulp van IM-MS. deze aanpak, kan het effect van ligand eiwitstabiliteit bindt gemeten10. Subcomplexes kunnen worden gegenereerd in oplossing in-oplossing verstoring methoden zoals de toevoeging van organische oplosmiddelen gebruiken voor het controleren van native-achtige topologieën van eiwitcomplexen. Verstoring van de eiwitcomplexen is voornamelijk te wijten aan de verstoring van de niet-covalente interacties binnen. De sub complexen native-achtige topologieën handhaven en, na MS detectie, onthullen informatie over Inter subeenheid connectiviteit.

Integratieve benaderingen in de structurele biologie combineren verschillende methoden om te bestuderen van de structuur en de dynamiek van eiwitten en hun complexen3,4,5,6. Native MS en IM-MS zijn gebruikt om te ontdekken de moleculaire details van uitdagende biologische systemen. Er zijn verschillende voorbeelden van toepassingen met inbegrip van de studie van eiwit vergadering trajecten11,12,13,14, bestuderen van de eiwit-eiwit interactie netwerken15 , 16 , 17, membraan eiwitten6,18,19,20,21, en eiwit-ligand interacties zoals nucleïnezuren22,23 ,24.

Native MS heeft echter ook haar beperkingen. Native MS metingen worden vaak uitgevoerd in vluchtige buffers zoals waterige ammoniumacetaat waarin sommige eiwitten niet hun gevouwen geboortestaat3,25 behouden. Niettemin, recente onderzoek heeft aangetoond dat deze beperking kan worden overwonnen door optimalisatie van het spuiten van naald tip diameter (0,5 mm tips) zodanig dat eiwit en eiwit complexe ionen kunnen gevormd worden rechtstreeks vanuit niet-vluchtig buffers met hoge-Ionische-sterkte die beter de fysiologische omgeving26na te bootsen. Daarnaast inheemse MS gebruikt electrospray ioniseren en overbrengen van niet-covalente verzamelingen van oplossing naar de gasfase; derhalve kan de relatieve overvloed van gedetecteerde complexen niet geheel vertegenwoordigen die in oplossing5,27. Bovendien in vergelijking met in oplossing, de gas fase hydrofobe interacties worden zwakker en elektrostatische interacties sterker geworden en daarom favoriet3,28.

In dit artikel geven wij protocollen, data-analyse en interpretatie voor eiwit identificatie en ligand bindende gebruik van inheemse MS, IM-MS, ICB, verstoring van de in-oplossing, en modellering. Het DNA repair complex, HerA-NurA, wordt gebruikt als een modelsysteem. Onderbrekingen van de double-stranded DNA (DSBs) zijn een van de meest cytotoxische en schadelijke vormen van DNA-schade, wat resulteert in genetische instabiliteit en de uiteindelijke ontwikkeling van kanker bij de mens. Homologe recombinatie is het mechanisme van de reparatie die DSBs, een proces dat is georkestreerd door de ATP afhankelijke helicase-nuclease complex, HerA-NurA22uitroeit.

Native MS en IM-MS combineren met functionele testen en modelleren toegestaan de onderzoek van: i) de rol van NurA in de vergadering bevleesdheid en de stabiliteit van het complex, ii) de interactie tussen dsDNA en het complex en de invloed daarvan op de algemene stabiliteit van het complex, en iii) de stoichiometrie en impact van ATP bindt de vergadering22. Globaal, is dit werk leidde tot een beter begrip van de moleculaire basis van de HerA-NurA complex door het koppelen van eiwit complexe conformationele veranderingen en stabiliteit met de nucleotide-bindende. Dit protocol is algemeen voor alle eiwit-complex(es) die samenwerkt met één of meerdere ligand(s) typen.

Protocol

1. monstervoorbereiding voor inheemse MS voor eiwit en eiwit-Ligand complexen Opmerking: Als u wilt krijgen een goed begrip van de moleculaire basis van een complexe eiwitten en ligand bindende met behulp van inheemse MS, is geschikt monstervoorbereiding sleutel. Het doel van deze sectie is om te benadrukken de essentiële monster voorbereiding stappen voorafgaand aan MS-analyse met behulp van de HerA-NurA complex die DNA en nucleotiden als voorbeeld bindt. Bereiden 20 µL aliquots van geconcentreerde gezuiverde eiwit (meestal 15-30 µM) in een 1,5 mL-buis. P.a. ATP of ADP bindendeOpmerking: Voeg toenemende concentraties van de niet-hydrolyseerbare ATP analoge adenosine 5 ‘-O-(3-thiotriphosphate), tetralithium zout (ATP-γ-S) of 5 ‘-adenosinedifosfaat (ADP). Niet-hydrolyseerbare ATP derivaten genereren een stabiele complex waardoor het eiwit van de ATP-gebonden worden vastgelegd. Andere niet-hydrolyseerbaar analogen van ATP die zou kunnen worden getest omvatten AMP-PNP en ATP-γ-S-Mg2 +. Voor HerA-NurA studies, Meng 5 µM van gezuiverde eiwit met ATP-γ-S en ADP in concentraties variërend van 0-1 mM. Toevoegen wilt vastleggen gelijktijdige ATP-γ-S en ADP binding, beide nucleotiden in dezelfde of verschillende concentraties. Voeg 2 mM MgCl2 en Incubeer bij 25 ° C in een droge Bad incubator voor 1 h.Opmerking: Analyse van de nucleotide-bindende met behulp van inheemse MS in artefactual inbinden op hoge concentraties resulteren kan nESI, daarom aspecifieke bindend moet worden genomen in rekening29. Om te onderzoeken niet-specifieke binding, voeg een hogere concentratie van nucleotiden tussen 2-5 mM). Voor de analyse van DNA-bindende Meng de eiwitten en DNA met een molaire onderlinge verhouding die het mogelijk voor eiwit-DNA complexvorming maakt. Voor HerA en HerA-NurA, Meng 5 µM van gezuiverde eiwit met DNA op een 1:1 verhouding. Incubeer de HerA-NurA of HerA – DNA mengsel gedurende 30 minuten bij 25 ° C in een droge Bad incubator totdat het evenwicht is bereikt. De duur en de temperatuur van de incubatie kunnen variëren afhankelijk van het eiwit onderzocht. Buffer uitwisseling EiwitSteekproeven aan MS compatibel buffers. Algemeen, waterige ammonium acetaat oplossing tussen 5 mM-1 M met een pH van 7-8 worden gebruikt. Andere MS compatibel buffers omvatten ethylenediammonium DIACETAAT (EDDA) en Triethylammonium acetaat (TEAA)30. Gebruik voor HerA-NurA studies, 200 mM ammonium acetaat pH 7.Opmerking: Er zijn verschillende methoden voor buffer uitwisseling vóór de analyse door MS zoals het gebruik van een spin-concentrator of Chromatografiekolommen. Native MS wordt meestal beperkt door de kwaliteit van het monster zoals buffers en adducten tijdens het zuiveringsproces ongehinderd gebruikt. Daarom is het essentieel om te voeren voldoende ontzouten om te verkrijgen van de opgelost pieken. Voor HerA-NurA ligand bindende studies, buffer uitwisseling monsters 6 – 8 keer in 200 mM ammoniumacetaat met behulp van een concentrator. Hoewel deze methode meer tijdrovend is, het zorgt ervoor dat opgelost pieken zijn bereikt en zorgt voor nauwkeurige bepaling van de massa van ATP/ADP afhankelijke soorten. 2. inheemse MS verwerving en analyse voor het onderzoeken van eiwitcomplexen en eiwit-Ligand complexen Opmerking: MS voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd om zeer opgelost toppen zodat nauwkeurige metingen van de massa. Deze sectie details geoptimaliseerd parameters op een Q-ToF massa spectrometer met een 32 k bovengrens m/z vierpolige. In-house haarvaten voor nano-electrospray voorbereiden en uitvoeren van massa kalibreren van het instrument voor nauwkeurige massa metingen als gedetailleerde door Kirshenbaum et al. 1. Gevoeligheid, positieve ion verwerving en mobiliteit TOF modi selecteren. Inschakelen van de Trap, API en IMS gassen. IM scheiding, stikstof (60 mL/min) en argon (8,4 mL/min voor de regio val) als uitgangspunt gebruiken en vervolgens aanpassen. Stel een passende m/z overname bereik. Voor een onbekende proteïne, eerste optimization stappen moeten gebruiken een breed scala zoals 500-32.000 m/z. Laden 2-3 µL van het eiwit complexe oplossing te worden geanalyseerd in een gouden gecoate capillair en plaatst u deze in een capillaire houder. Zachtjes draai het capillair en plaats het capillair in het stadium van de bron electrospray en schuif het podium in de positie om te beginnen het verwerven van gegevens. Lage nano-stroom gasdruk van toepassing (0,00-0,05 Bar) totdat een druppel wordt gevormd op het puntje van het capillair. De nano-waterdruk kan dan gedropt worden tot de spray wordt gehandhaafd. Het capillair met betrekking tot de kegel aanpassen door het bewegen van het capillair x, y, z posities en controleren van de huidige om een huidige stabiele ion ion. Toepassing van een capillaire spanning in het bereik van 0,9-1.6 kV. Stel de bemonstering kegel (50-120 V), de verschuiving van de bron (60,0), de bron temperatuur (25 ° C) en de kegel gasstroom (0,0 L/h). Deze voorgesteld oorspronkelijke voorwaarden kunnen worden aangepast. Verkrijgen van een goed opgelost massaspectrum en het maximaliseren van ion transmissie, MS parameters aanpassen en monitor de resulterende wijzigingen in de spectra. Deze omvatten aanpassing van de gasstroom in de Trap (2-8 mL/min), hij cel (180 mL/min) en IMS cel (90 mL/min) om de beste scheiding op maximale transmissie. Pas de val botsing energieën als spanning offsets ontoereikend zijn. Een optimale uitgangspunt is tussen 10-50 V.Opmerking: Verhoging van de val-energie kan verwijderen niet-covalente adducten. Zorg om te voorkomen botsing veroorzaakte echter dissociatie en ontplooiing van de eiwit-ligand-complex. Uitvoeren van ion mobiliteit metingen om te controleren als instrument voorwaarden de proteïne in de gevouwen geboortestaat (stap 3 behouden). Desolvation verbeteren door het optimaliseren van de val bias spanning. Een optimale uitgangspunt is 20-45 V. Optimaliseer de snelheid van de Golf en golfhoogte tot beste mobiliteit scheiding. Een gedetailleerde uitleg en protocol kunnen worden gevonden hier31. Gebruik voor de HerA-NurA studies, Golf snelheid van 40 (m/s) en golfhoogte van 550-650 (V). Alle andere parameters gebruiken als instrument standaardwaarden. Bereiden een ligand-gratis monster voor analyse als een besturingselement voor elke run (Figuur 1). Voor ligand bindende experimenten, ten minste drie onafhankelijke metingen uit te voeren. De Masslynx-software gebruiken voor het meten van massa geproduceerde soorten en identificeren van de ligand-binding, zoals ATP en ADP bindende en oligomere Staten (Figuur 2 en 3). Andere software beschikbaar omvatten UniDec32, PULSAR33 en Amphitrite34. Gebruiken om te kwantificeren van de relatieve rijkdom aan soorten, de bijbehorende ion intensiteiten waargenomen in de ruwe ESI-MS-spectra (bijvoorbeeld ligand gebonden, verschillende oligomeren, enz.). U kunt ook uitvoeren kwantificering met behulp van gespecialiseerde software zoals UniDec en Massign35 (Figuur 1 en 3 ). 3. verwerven en analyseren van IM-MS Opmerking: IM-MS scheidt ionen in de gas-fase op basis van hun grootte (massa), de vorm en de kosten. Elke functie opgelost in m/z spectrum wordt geassocieerd met een drift time distributie. IM-MS meet de drift-tijd van een ion die kan worden gebruikt voor het berekenen van de doorsnede van de botsing (CCS). Drift tijdwaarden gemeten vanaf IM-MS verkregen gegevens met behulp van die een drift-buis kan lineair worden gecorreleerd aan CCS waarden36. Voor reizen Golf IM-MS (TWIMS) metingen, vereist berekening van CCS waarden een ijkcurve die is verkregen uit eiwit normen met bekende CCS waarden37. Compacte structuren sneller reizen dan uitgebreide of langgerekte structuren wijten aan interacties met buffer gas in de cel mobiliteit38verminderd. Daarom, IM-MS kan worden gebruikt om op te sporen als de inheemse gevouwen structuur is bewaard gebleven in de gas fase39,40. Deze sectie wordt beschreven hoe u kunt IM-MS meten en berekenen van het CCS van eiwit met behulp van TWIMS. Na het optimaliseren instrument voorwaarden voor stabiele transmissie (stap 2), de collisional energie en verminderen bemonstering kegel zo laag mogelijk met behoud van goede spectra-kwaliteit. Gebruik de geoptimaliseerde Golf snelheid en golfhoogte te verwerven IM-MS (stap 2). Meten van de ion-drift tijd met IM-MS op drie verschillende Golf snelheden (bijv, 550, 600 en 650 m/s), met behoud van dezelfde golfhoogte (bijvoorbeeld 40 V). Om de eiwit ionen CCS, maatregel eiwit kalibranten onder dezelfde voorwaarden instrument gebruikt voor eiwit onderzochte. Optimale kalibratie van de drift-tijd vereist meting van eiwitten met bekende CCS. Selecteer vier kalibranten, twee met een massa boven en twee met een massa beneden die van het eiwit onder onderzoek37. Belangrijker nog, ervoor te zorgen dat de golfhoogte en de snelheid van de Golf hetzelfde als die opgenomen voor het eiwit onderzocht zijn. Berekenen CCS handmatig41 of via een gespecialiseerde software zoals PULSAR33 en Amphitrite34 (Figuur 5). Om te controleren of het eiwit native-achtige in de gasfase, vergelijk experimentele CCS theoretische CCS verkregen hoge resolutie structuren. Berekenen voor HerA-NurA, theoretische CCS met behulp van de methode van de onderlinge aanpassing van de projectie (PA) gebruikt in de MOBCAL42. Andere methoden omvatten traject methode (TM)42 en exacte harde bol verstrooiing (EHS)43. 4. in-oplossing verstoring van eiwitcomplexen voor inheemse MS en IM-MS leidde structuurbepaling Opmerking: Sub eiwitcomplexen kunnen in sommige gevallen worden geïdentificeerd van dezelfde oplossing als de intact complex. Verdere structurele informatie zoals Inter subeenheid connectiviteit en complexe assemblage kan echter worden bereikt van verstoren eiwitinteractie in oplossing, formulier sub complexen. Dit kan worden bereikt op verschillende manieren zoals de toevoeging van organisch oplosmiddel, verhoging van de Ionische sterkte of manipuleren van de pH. Om inzicht te krijgen in de HerA-NurA complexe subeenheid connectiviteit en complexe assemblage, werden sub complexen gegenereerd in oplossing door het toevoegen van de oplosmiddelen die erover subeenheid interacties. De eiwit monster en buffer uitwisseling in ammoniumacetaat bereiden zoals beschreven in stap 1. Voeg 10-40% oplosmiddel in stappen van 10%. Meestal gebruikte oplosmiddelen zijn dimethylsulfoxide (DMSO), Methanol (MeOH) of acetonitril (ACN).Opmerking: Dit kan worden uitgevoerd binnen een polypropyleen microcentrifuge buis. Incubeer het mengsel op het ijs gedurende 1 uur. Verwerven van een IM-MS spectrum voor elke voorwaarde (stap 2 en 3) (Figuur 4). Gebruik de software Top44 toewijzen sub eiwitcomplexen en eiwit-interactienetwerken genereren. U kunt ook een lijst van theoretische massa’s van de verwachte soorten handmatig genereren. Om ervoor te zorgen dat subcomplexes worden gevouwen, de experimentele CCS-waarden voor de sub complexen berekenen en vergelijken met de theoretische CCS, zoals uitgelegd in stap 3 (tabel 1, Figuur 5 en Figuur 6). 5. het onderzoeken van complexe eiwitstabiliteit met behulp van botsing veroorzaakte ontvouwen (ICB) Opmerking: ICB inzetbaar sonde van de structurele stabiliteit van eiwitten en hun complexen op ligand bindend. Gespecialiseerde softwarepakketten zoals PULSAR33, Amphitrite34 en ICB suite9 kunnen vervolgens worden gebruikt om het model de gasfase ontplooiing van het eiwit onderzochte met en zonder ligand. Als voorbeeld, deze sectie wordt beschreven procedure voor de controle van de gas-fase ontvouwen trajecten en onderzoeken van het stabiliserende effect van DNA en ATP bindt het HerA-NurA complex. IM-MS recordgegevens terwijl het verhogen van de spanning van het val versnelling van 10 V tot 200 V in stappen van 2-10-V te ontvouwen geleidelijk de proteïne in de gas-fase.Opmerking: Het opnemen van kleinere stappen resultaten in meer gegevensbestanden te verwerken, maar deze aanpak biedt meer opgelost ontplooiing perceel, dat is belangrijk voor het analyseren van de punten van de overgang tussen soorten gevouwen/ontvouwd. Analyseren van de gegevens verkregen via PULSAR33, Amphitrite34 of ICB suite9 en genereren van tweedimensionale ontvouwen percelen in eenheden van CCS als een functie van de versnelling van de spanning (stap 3). Voor elke verantwoordelijke staat, wordt dit gemaakt door stapelen de intensiteit-genormaliseerd CCS distributies bij elke versnelling spanning (Figuur 7 A-Bi). Het genereren van een theoretische ontplooiing perceel met behulp van een van de softwarepakketten. De gegevens zullen worden gemonteerd op een zich ontwikkelende model. Dit maakt het mogelijk om te kwantificeren van de collisional energie waartegen ontvouwen overgangen optreden en de stabiliteit van eiwitten met en zonder afhankelijke liganden33bepalen. Een ontvouwen overgang is als een soort overgangen van de ene staat (gebaseerd op hun experimentele CCS-waarden) naar een andere staat met een grotere CCS. Berekenen om te kwantificeren van de overgangen, de tijdelijke midpoint(s) tussen staten met behulp van algoritmen en software zoals PULSAR33. Dit wordt vaak gerapporteerd als CV50, dat is namelijk de botsing (trap) spanning waarde waartegen 50% van een bepaalde status is uitgeput. Met behulp van de waarde van CV50 , berekenen het totale interne energie van een ion met behulp van de center-van-mass botsing energie KE (COM)45. KECOM wordt bepaald door de totale inwendige energie beschikbaar is voor de zich ontvouwende overgang van een ion, is berekend op basis van de kinetische energie en massa’s van de partners van de botsing (eiwit ion en neutraal gas) zoals beschreven in vergelijking (1)10KEcom (eV) = (vergelijking 1).Waar Z is de lading van het ion, M,N = de massa van de neutrale gas en MION is de massa van de eiwit-ion.Opmerking: Dit is omdat de ICB van eiwitten is gratis dependent46, 47. Het is aanbevolen om de KECOM analyses aan meer dan één gratis staat ( Figuur 7Aii) uit te voeren. 6. modellering Procedures voor differentiële moleculaire dynamica simulaties gebruikt in Integrative MS Opmerking: Het gebruik van modellen van eiwit subeenheden of complexen zoals van kristalstructuren, kunnen differentiële MD simulaties (eiwit complex met en zonder ligand) worden gebruikt om te bepalen van de effecten van bijvoorbeeld ligand aanwezigheid op eiwitstructuur en dynamiek. Deze sectie details een werkstroom en hulpmiddelen die nodig zijn voor de modellering van procedures om set-up differentiële moleculaire dynamica simulaties. Het identificeren van de subeenheden waarvan componeren van het complex (Figuur 8A, in stap 2 en 3). Bron bestaande modellen van subeenheden, bijvoorbeeld kristalstructuren van de RCSB databank (https://www.rcsb.org). De vermelding van het eiwit zal bevatten een lijst van UniProt weten kristallografische/NMR structuren (http://www.uniprot.org). Als deze niet beschikbaar zijn, kan de theoretische volgorde worden ingevoerd tot ONTPLOFFING te identificeren van geschikte sjablonen voor homologie modellering (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Monteren van het complex in de juiste topologie (Figuur 8A-ii). Dit kan gebeuren door middel van verschillende methoden. De individuele subeenheden kunnen worden gemonteerd in beschikbaar elektronenmicroscopie kaarten gevonden op de EMDB te monteren de intact complex (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). Een tutorial voor het aanbrengen van PDBs in EM kaarten met behulp van moleculaire dynamica flexibele montage (MDFF) kan hier worden gevonden: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/. Identificeren ontbrekende regio’s van het complex (Figuur 8A-iii). Meerdere sequentie alignering (MSA) tussen de VOB en theoretische volgorde te identificeren van residuen die mogelijk ongeschikt in kristalstructuren, of mutaties overgenomen van kristallografische experimenten uitvoeren MSA kan worden uitgevoerd met behulp van de webservers zoals T-Coffee (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular). Regenereren ontbrekende residuen via homologie modellering (Figuur 8A-iv). Ontbreken van residuen van het eiwit complex kan worden gebouwd met behulp van het programma MODELLER (https://salilab.org/modeller/). MODELLER kan een ensemble van n modellen in verschillende formaties, geregenereerde output. Goede modellen kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun score Discrete geoptimaliseerd proteïne energie (DOPE). Een uitgebreide handleiding is beschikbaar op de website van de software (https://salilab.org/modeller/tutorial/). Differentiële moleculaire dynamica (MD) simulaties van het eiwit complex (Figuur 8B) uitvoeren ter identificatie van de regio’s van eiwitten die op een bepaalde veranderingen in het milieu, bijvoorbeeld de aanwezigheid van een ligand reageren. In deze simulaties, gedrags parameters van simulatie A (alleen eiwit) die fungeert als een verwijzing, wordt afgetrokken van de simulatie B (eiwitten + ligand). De differentiële kwadratische gemiddelde schommelingen (RMSF) berekend tussen simulaties A en B kan informeren over de regio’s van de proteïne die vergroten of verkleinen in flexibiliteit in een ligand afhankelijke wijze. Het uitvoeren van MD simulaties en downstream-analyse met behulp van GROMACS (http://www.gromacs.org). Een tutorial kan worden gevonden op: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. Te elimate model bias, moet de structuur van het ligand-gebonden complex eerst worden gegenereerd. Het eiwit is het vervolgens gekopieerd van dit zonder de ligand, een identiek aan het complex ligand-gebonden eiwit-model opleveren.

Representative Results

Native MS resultaten bleek de oligomere staat, de samenstelling en de topologie van de HerA-NurA complex (Figuur 1). Als niet-covalente interacties worden bewaard in de gasfase, inheemse MS van ATP-γ-S en ADP titraties experimenten bepaald de paarsgewijze nucleotide binding aan HerA-NurA (Figuur 2) en die verhoging van de ATP-γ-S-concentratie stijgt de relatieve intensiteit van hexameer HerA (Figuur 3). Structurele informatie met betrekking tot subeenheid interacties werden verkregen-oplossing verstoring gevolgd door inheemse MS en werden in overleg met en theoretische massa (Figuur 4 en tabel 1). De experimentele CCS waarden van eiwitten en hun complexen was afgeleid van IM-MS experimenten (Figuur 5). Deze waarden zijn rotatie gemiddelde gasfase transversale berekeningen van de moleculaire vorm, en beschrijven de dimensionale staat van het eiwit. CCS waarden worden vergeleken met theoretische metingen van röntgendiffractie en een goed akkoord afleidt dat de inheemse vorm in bewaard in de gas-fase (tabel 1). Dit wordt gevalideerd met behulp van CCS waarden voor het bouwen van lage-resolutie modellen voor de vergadering eiwit48. Experimentele CCSs kunnen worden berekend voor elke tenlastelegging staat ion. Een native-achtige eiwitten conformer kan aanleiding geven tot opladen staat ionen met gelijkaardige waarden van CCS. Echter verhoogd hogere kosten staat ionen coulombic repulsions die tot eiwit gasfase openende en grotere CCS waarden ten opzichte van de theoretische CCSs leiden kunnen. De CCS-waarde van de laagste kosten staat ionen daarom meestal zijn gebruikt49. Voor HerA-NurA, experimenten van de verstoring van de in-oplossing met HerA en HerA-NurA met en zonder DNA gevraagd de generatie van het traject van een vergadering starten met monomeren dan vormen de hele hexameer HerA (HerA6)-dimeric NurA (NurA2) complex met DNA (Figuur 6). Verschillen in de ICB ontvouwen percelen apo (ligand-vrij) en ligand gebonden definiëren de verandering in complexe stabiliteit op ligand bindend. Een hogere CV50 of KECOM waarde impliceert een meer gestabiliseerde ion in de gas-fase. ICB en KECOM -analyse bleek dat DNA-gebonden HerA-NurA is stabieler dan het complex van DNA-gratis (Figuur 7Aii). Uit de analyse van de ICB-MS in de respectieve staten van de ATP-binding, de vier-ATP-γ-S gebonden staat minder complexe stabiliteit in de gas-fase en de zes -ATP-γ-S gebonden staat waar zijn alle sites zijn bezet was het meest stabiel (Figuur 7Bii). Native MS kan onthullen de discrete nucleotide bindend Staten van HerA; echter niet kan het onderscheiden welke HerA subeenheden ATP bindend zijn en waar deze binding plaatsvindt. Deze informatie kan worden afgeleid uit de expliciete oplosmiddel MD simulaties op de hexameer HerA en de HerA-NurA na de samengevatte Workflow (Figuur 8). Figuur 1. Ondervragen de oligomere staat, de samenstelling en de topologie van de HerA-NurA niet-covalente complex. (A) massaspectra van HerA, HerA-NurA en HerA-NurA in aanwezigheid van DNA (15,4 kDa 25 bp double-stranded DNA). Het HerA sub complex bestaat zowel een hexamer als een heptamer. NurA dimeer bindt en een hexamer van de HerA opleggen van oligomere conversie. Het DNA bindt het gevormde HerA – NurA complex (aangepast uit Z. Ahdash et al., 201722resultaten). (B) de relatieve intensiteiten van de geïdentificeerde soorten zijn berekend aan de hand van UniDec32. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2. Native ESI-MS blijkt het mechanisme waarmee het HerA-NurA nucleotide binden. Massaspectra (A) HerA-NurA en (B) HerA-NurA-DNA met toenemende concentraties van (i) ATP-γ-S en (ii) ADP. Gemeten massa’s worden vergeleken met theoretische massa’s en de hoeveelheid ATP-γ-S of ADP gebonden worden bepaald. Gemeten massa’s en aantal afhankelijke nucleotiden worden weergegeven op de spectra. ATP-γ-S en ADP titraties experimenten bepaald de paarsgewijze nucleotide-bindende HerA-NurA alleen en bij complex met DNA die aangeeft van een cyclische reactiemechanisme (aangepast uit Z. Ahdash et al., 201722resultaten). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3. Het meten van het effect van de toenemende concentraties van de ATP-γ-S op HerA oligomere staat. (A) massaspectra van HerA op toenemende concentraties van ATP-γ-S. (B) grafiek waarin de relatieve intensiteiten van verschillende soorten van inheemse MS berekend aan de hand van UniDec deconvolutie software32. Aangezien de ATP-γ-S-concentratie stijgt, verhoogt de relatieve intensiteit van hexameer HerA ook. Aantal moleculen van ATP-γ-S gebonden wordt getoond op de spectra (aangepast uit Z. Ahdash et al., 201722resultaten). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4. Massa spectra en sub complexe dissociatie producten van HerA (A) en (B) HerA-NurA (i) alleen en in de aanwezigheid van (ii) DNA volgende van verstoring van de-oplossing. In-oplossing verstoring experimenten werden uitgevoerd met behulp van 10-40% van acetonitril, Methanol (MeOH) of dimethylsulfoxide (DMSO) en resulteerde in de vorming van verschillende subcomplexes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5. Ion mobiliteit aankomst tijd distributies komt te staan op de as van een CCS voor complexen en gegenereerde sub complexen. Pictogram voor elk sub complexe correlaat met die aantekeningen op de spectra in Figuur 4. Experimentele en berekende massa’s en CCS waarden van sub complexen zijn vermeld in tabel 1 die allemaal een overeenkomst tussen experimentele en berekende waarden toonde (na bestudering van de typische onzekerheid in de resolutie van de reizen van Golf ion mobiliteit massaspectrometrie ±5 – 8). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6. Vergadering traject van het complex van de HerA-NurA gegenereerd vanuit native MS en IM-MS. gekleurde cirkels geven voorwaarden waar elke sub complex werd waargenomen van de verstoring van de-oplossing: native (groen, voorafgaand aan de verstoring), Methanol (geel), DMSO (paars) of Acetonitril (rood). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 7. Onderzoeken van het stabiliserende effect van (A) DNA op HerA-NurA en (B) ATP-binding aan HerA-NurA-DNA. (i) gas-fase ICB-MS Staanplaatsen en (ii) center-van-mass botsing energieën (KEcom) berekening blijkt dat de aanwezigheid van dsDNA het HerA-NurA complex stabiliseert en dat de zes ATP-γ-S staat gebonden de meest stabiele is. Stabilisatie voor verschillende gratis Staten wordt weergegeven. Percelen werden gegenereerd met behulp van PULSAR 33. De resultaten van (A) uit Z. Ahdash et al., 201722aangepast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 8. Workflow voor de modellering procedures voor differentiële moleculaire dynamica simulaties. (A) het genereren van het complex onder onderzoek door het bouwen van de topologie van bestaande subeenheden en herbouw van de ontbrekende residuen. (B) workflow voor het uitvoeren van moleculaire dynamica simulaties op het eiwit complex met en zonder ligand. Moleculaire dynamica simulaties zijn liep voor de proteïne alleen die handelt als een referentie en die wordt afgetrokken van de simulatie van eiwit plus ligand. Dit wordt gevolgd door het berekenen van de differentiële kwadratische gemiddelde schommelingen (RMSF) tussen de simulaties en vaststellen van het effect van ligand bindend. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Complex / sub complex Theoretische massa (kDa) Experimentele massa (kDa) Theoretische CCS (Å2) Experimentele CCS (Å2) [gratis] Voorwaarde HN HerA6- NurA2 416.22 417.85 14531 14577 [42 +]14599 [43 +]14608 [44 +]14637 [45 +] 10-20% ACN, 10-40% DMSO, 10% MeOH HerA6- NurA2- dsDNA 431.72 432.27 – 14661 [39 +]14728 [40 +]14781 [41 +]14837 [42 +] 10% ACN, 10% MeOH NurA1 39.12 38.18 3254 2618 [10 +]2746 [11 +]2878 [12 +] 10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO NurA2 78.24 78.36 4890 4903 [16 +]4614 [17 +]4537 [18 +]4666 [19 +] 10-40% MeOH, 20-40% DMSO HerA1 56.33 56.32 4131 3647 [14 +]3792 [15 +]3950 [16 +] 10-40% ACN, 40% DMSO HerA2 112.66 112.95 6475 5648 [20 +]5747 [21 +]5842 [22 +]5996 [23 +] 40% meth, 10-40% ACN HerA3 168.99 169.39 8607 7501 [25 +]7616 [26 +]7717 [27 +]7867 [28 +] 10-40% MeOH, kan 10-40%, 40% DMSO HerA3 + DNA 183.99 184.976 – 7655 [26 +]7990 [27 +]8107 [28 +] 10-30% ACN HerA4 225.32 226,2 10477 9205 [30 +]9287 [31]9493 [32 +]9961 [33 +] 10-40% MeOH, 10-40% ACN HerA4 + DNA 240.82 241.33 – 9637 [31 +]9756 [32 +]9830 [33 +] 10-30% ACN HerA5 281.65 282.75 11853 10847 [36 +]10958 [37 +]11161 [38 +] 30-40% ACN HerA6 337.98 339.3 12517 12335 [38 +]12386 [39 +]12498 [40 +]12590 [41 +]12676 [42 +]13019 [43 +] 10-40% MeOH, 10-40% ACN HerA6 + DNA 353.48 354.626 – 12890 [40 +]13081 [41 +]13184 [42 +]13273 [43 +]13463 [44 +]13576 [45 +] 30% ACN HerA7 394.3 395.85 13901 14154 [42 +]14219 [43 +]14261 [44 +]14285 [45 +]14335 [46 +] 10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO HerA7 + DNA 409.8 410.62 – 14414 [41 +]14510 [42 +]14558 [43 +]14598 [44 +]14630 [45 +]14641 [46 +] 10% ACN Tabel 1. Experimentele en berekende massa en CCS waarden van HerA-NurA en haar sub complexen gegenereerd formulier in-oplossing verstoring studies.

Discussion

MS speelt een steeds belangrijkere rol in het karakteriseren van de stoichiometrie, interacties en subeenheid architectuur van eiwitcomplexen. IM-MS gegevens kunnen worden gebruikt om te definiëren van topologische regelingen van subeenheden binnen multicomponent complexen. Vergeleken met andere bestaande structurele biologiemethodes, heeft MS verschillende voordelen. Native MS is een snelle en uiterst gevoelige techniek en kan worden gebruikt om de heterogene EiwitSteekproeven sonde. Wanneer gekoppeld aan in-oplossing verstoring experimenten, kunnen dissociatie trajecten van eiwit samenstellingen worden gecontroleerd. Samen met kristalstructuren of homologie modellen, de informatie die wordt aangeboden door structurele MS biedt een instrument voor het onderzoeken van eiwit-ligand interacties en bieden in de buurt van-native modellen en vergadering trajecten11.

Hier beschrijven we de nodige experimentele procedures voor het analyseren van de stoichiometrie en de samenstelling van eiwit-ligand interacties, met één of meer liganden, met behulp van integratieve MS. Het gaat hierbij om de bereiding van de monsters van de MS, data-acquisitie, data-analyse en de integratie van MS gegevens met behulp van computerhulpmiddelen. Om dit te doen, hebben we gebruikt de DNA-resectie HerA-NurA hetero-oligomere eiwit complex, gebonden aan drie liganden (DNA, ATP en ADP), als ons modelsysteem. Het protocol wordt het gebruik van de momenteel beschikbare software om te helpen gegevensanalyse en presentaties.

Het verkrijgen van hoge kwaliteit spectra is belangrijk voor ligand bindende analyse, dus voorzichtig monster voorbereiding stappen zijn kritisch, met inbegrip van EiwitReiniging, ligand titratie en buffer uitwisseling. Een beperking van nESI native MS bij de studie van ligand bindende aspecifieke bindend is. Niet-specifieke binding treedt op tijdens de druppel desolvation gedurende het gehele proces electrospray. Dit verhoogt de ligand-concentraties en daarom verandert de verhouding van eiwit/Ligand29. De binding van nucleotiden resulteert in een relatief kleine massa verschil tussen apo en nucleotide-gebonden eiwit dat niets aan de ionisatie efficiëntie50,51 verandert.

We gebruikten de Synapt G2-Si MS systeem voor ons werk, maar de protocollen voor verschillende onderzoeken van andere complexen van de eiwit-ligand met behulp van andere verkrijgbare nano-electrospray massaspectrometers toepasselijk zijn. Integratieve structurele MS speelt steeds een belangrijke rol bij het aanpakken van biologische problemen van grotere complexiteit. De workflow en de hier beschreven technieken zijn zeer geschikt voor de structurele gevolgen te begrijpen en de opbouw van mechanismen voor complexe eiwit en eiwit-ligand vorming die anders moeilijk te bestuderen met behulp van conventionele structurele technieken .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij zou willen bedanken Karl-Peter Hopfner en Robert Thomas Byrne voor vriendelijk bieden HerA en HerA-NurA EiwitSteekproeven en voor hun medewerking aan de proefopzet. Wij danken ook Dr. Eamonn Reading voor zijn beoordeling van het manuscript. We mijn dankbaarheid uitspreken aan onze financierende instanties: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] en Royal Society [RG150216 naar A.P.].

Materials

Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt Merck Millipore 119120-25MG
Adenosine 5′-diphosphate  Sigma-Aldrich 20398-34-9
Ammonium acetate solution Sigma-Aldrich A2706
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad 7326204
Vivaspin concentrator Sartorius Z614041-25EA
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Water TraceSelect Sigma-Aldrich 95305
Borosilicate Capillaries Harvard Apparatus 300060
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilm, M., Mann, M. Analytical Properties of the Nanoelectrospray Ion Source. Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).
  2. Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecule. Science. 246 (4926), 64-71 (1989).
  3. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (3), 715-726 (2007).
  4. Heck, A. J., Van Den Heuvel, R. H. Investigation of intact protein complexes by mass spectrometry. Mass Spectrom Review. 23 (5), 368-389 (2004).
  5. Boeri Erba, E., Petosa, C. The emerging role of native mass spectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes. Protein Science. 24 (8), 1176-1192 (2015).
  6. Laganowsky, A., Reading, E., Hopper, J. T. S., Robinson, C. V. Mass spectrometry of intact membrane protein complexes. Nature. 8 (4), 639-651 (2013).
  7. Benesch, J. L. Collisional activation of protein complexes: picking up the pieces. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 20 (3), 341-348 (2009).
  8. Tian, Y., Han, L., Buckner, A. C., Ruotolo, B. T. Collision Induced Unfolding of Intact Antibodies: Rapid Characterization of Disulfide Bonding Patterns, Glycosylation, and Structures. Analytical Chemistry. 87 (22), 11509-11515 (2015).
  9. Eschweiler, J. D., Rabuck-Gibbons, J. N., Tian, Y., Ruotolo, B. T. CIUSuite: A Quantitative Analysis Package for Collision Induced Unfolding Measurements of Gas-Phase Protein Ions. Analytical Chemistry. 87 (22), 11516-11522 (2015).
  10. Hopper, J. T., Oldham, N. J. Collision induced unfolding of protein ions in the gas phase studied by ion mobility-mass spectrometry: the effect of ligand binding on conformational stability. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 20 (10), 1851-1858 (2009).
  11. Politis, A., et al. Topological models of heteromeric protein assemblies from mass spectrometry: application to the yeast eIF3:eIF5 complex. Chemical Biology. 22 (1), 117-128 (2015).
  12. Morgner, N., et al. Hsp70 forms antiparallel dimers stabilized by post-translational modifications to position clients for transfer to Hsp90. Cell Reports. 11 (5), 759-769 (2015).
  13. Lai, Y. T., et al. Structure of a designed protein cage that self-assembles into a highly porous cube. Nature Chemistry. 6 (12), 1065-1071 (2014).
  14. Levy, E. D., Boeri Erba, E., Robinson, C. V., Teichmann, S. A. Assembly reflects evolution of protein complexes. Nature. 453 (7199), 1262-1265 (2008).
  15. Sharon, M., et al. Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality. Structure. 17 (1), 31-40 (2009).
  16. Jurneczko, E., Barran, P. E. How useful is ion mobility mass spectrometry for structural biology? The relationship between protein crystal structures and their collision cross sections in the gas phase. Analyst. 136 (1), 20-28 (2011).
  17. Politis, A., Schmidt, C. Structural characterisation of medically relevant protein assemblies by integrating mass spectrometry with computational modelling. Journal of Proteomics. 175, 34-41 (2017).
  18. Zhou, M., et al. Mass spectrometry of intact V-type ATPases reveals bound lipids and the effects of nucleotide binding. Science. 334 (6054), 380-385 (2011).
  19. Barrera, N. P., Booth, P. J., Robinson, C. V. Micelles Protect Membrane Complexes from Solution to Vacuum. Science. 321 (5886), 243-246 (2008).
  20. Konijnenberg, A., et al. Global structural changes of an ion channel during its gating are followed by ion mobility mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17170-17175 (2014).
  21. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Mohammed, S., Robinson, C. V. Acetylation and phosphorylation control both local and global stability of the chloroplast F1 ATP synthase. Scientific Reports. 7, 44068 (2017).
  22. Ahdash, Z., et al. Mechanistic insight into the assembly of the HerA-NurA helicase-nuclease DNA end resection complex. Nucleic Acids Research. 45 (20), 12025-12038 (2017).
  23. Pagel, K., Natan, E., Hall, Z., Fersht, A. R., Robinson, C. V. Intrinsically disordered p53 and its complexes populate compact conformations in the gas phase. Angewandte Chemie. 52 (1), 361-365 (2013).
  24. Afonso, J. P., et al. Insights into the structure and assembly of the Bacillus subtilis clamp-loader complex and its interaction with the replicative helicase. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5115-5126 (2013).
  25. van Duijn, E. Current limitations in native mass spectrometry based structural biology. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (6), 971-978 (2010).
  26. Susa, A. C., Xia, Z., Williams, E. R. Native Mass Spectrometry from Common Buffers with Salts That Mimic the Extracellular Environment. Angewandte Chemie. 56 (27), 7912-7915 (2017).
  27. Breukera, K., McLafferty, F. W. Stepwise evolution of protein native structure with electrospray into the gas phase, 10 to 10 s. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18145-18152 (2008).
  28. Robinson, C. V., et al. Probing the Nature of Noncovalent Interactions by Mass Spectrometry. A Study of Protein-CoA Ligand Binding and Assembly. Journal of the American Chemical Society. 118 (36), 8646-8653 (1996).
  29. Shimon, L., Sharon, M., Horovitz, A. A method for removing effects of nonspecific binding on the distribution of binding stoichiometries: application to mass spectroscopy data. Biophysical Journal. 99 (5), 1645-1649 (2010).
  30. Dyachenko, A., Gruber, R., Shimon, L., Horovitz, A., Sharon, M. Allosteric mechanisms can be distinguished using structural mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7235-7239 (2013).
  31. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. 19 (40), (2010).
  32. Marty, M. T., et al. Bayesian deconvolution of mass and ion mobility spectra: from binary interactions to polydisperse ensembles. Analytical Chemistry. 87 (8), 4370-4376 (2015).
  33. Allison, T. M., et al. Quantifying the stabilizing effects of protein-ligand interactions in the gas phase. Nature Communications. 6, 8551-8561 (2015).
  34. Sivalingam, G. N., Yan, J., Sahota, H., Thalassinos, K. Amphitrite: A program for processing travelling wave ion mobility mass spectrometry data. International Journal of Mass Spectrometry. 345-347, 54-62 (2013).
  35. Morgner, N., Robinson, C. V. Massign: an assignment strategy for maximizing information from the mass spectra of heterogeneous protein assemblies. Analytical Chemistry. 84 (6), 2939-2948 (2012).
  36. Bush, M. F., et al. Collision Cross Sections of Proteins and Their Complexes: A Calibration Framework and Database for Gas-Phase Structural Biology. Analytical Chemistry. 82, 9557-9565 (2010).
  37. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L., Sandercock, A. M., Hyung, S. J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  38. Lanucara, F., Holman, S. W., Gray, C. J., Eyers, C. E. The power of ion mobility-mass spectrometry for structural characterization and the study of conformational dynamics. Nature Chemistry. 6 (4), 281-294 (2014).
  39. Wyttenbach, T., Bowers, M. T. Structural stability from solution to the gas phase: native solution structure of ubiquitin survives analysis in a solvent-free ion mobility-mass spectrometry environment. Journal of Physical Chemistry B. 115 (42), 12266-12275 (2011).
  40. Marcoux, J., Robinson, C. V. Twenty years of gas phase structural biology. Structure. 21 (9), 1541-1550 (2013).
  41. Michaelevski, I., Kirshenbaum, N., Sharon, M. T-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  42. Mesleh, M. F., Hunter, J. M., Shvartsburg, A. A., Schatz, G. C., Jarrold, M. F. Structural Information from Ion Mobility Measurements: Effects of the Long-Range Potential. Journal of Physical Chemistry A. 100, 16082-16086 (1996).
  43. Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chemical Physics Letters. 261, 86-91 (1996).
  44. Taverner, T., Hernández, H., Sharon, M., Ruotolo, B. T., Matak-Vinković, D., Devos, D., Russell, R. B., Robinson, C. V. Subunit Architecture of Intact Protein Complexes from Mass Spectrometry and Homology Modeling. Accounts of Chemical Research. 41 (5), 617-627 (2008).
  45. Wysocki, V. H., Joyce, K. E., Jones, C. M., Beardsley, R. L. Surface-induced dissociation of small molecules, peptides, and non-covalent protein complexes. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (2), 190-208 (2008).
  46. Hall, Z., Politis, A., Bush, M. F., Smith, L. J., Robinson, C. V. Charge-state dependent compaction and dissociation of protein complexes: insights from ion mobility and molecular dynamics. Journal of the American Chemical Society. 134 (7), 3429-3438 (2012).
  47. Hyung, S. J., Robinsons, C. V., Ruotolo, B. T. Gas-Phase Unfolding and Disassembly Reveals Stability Differences in Ligand-Bound Multiprotein Complexes. Chemistry & Biology. 16, 382-390 (2009).
  48. Hall, Z., Politis, A., Robinson, C. V. Structural modeling of heteromeric protein complexes from disassembly pathways and ion mobility-mass spectrometry. Structure. 20 (9), 1596-1609 (2012).
  49. Woods, L. A., Radford, S. E., Ashcroft, A. E. Advances in ion mobility spectrometry-mass spectrometry reveal key insights into amyloid assembly. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1257-1268 (2013).
  50. Daubenfeld, T., Bouin, A. P., van der Rest, G. A deconvolution method for the separation of specific versus nonspecific interactions in noncovalent protein-ligand complexes analyzed by ESI-FT-ICR mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 17 (9), 1239-1248 (2006).
  51. Loo, J. A. Studying noncovalent protein complexes by electrospray ionization mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 16, 1-23 (1997).

Tags

Protein ArchitectureProtein-ligand ComplexStructural Mass SpectrometryNative Mass SpectrometryBiomolecular AssembliesHeterogeneous Protein SamplesOligomeric StateNanoelectrosprayAmmonium AcetateIon Mobility SeparationCapillary HolderNano-flow Gas PressureCapillary VoltageSampling ConeSource OffsetSource TemperatureCone Gas FlowTrap Collision EnergyTrap Voltage

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ahdash, Z., Lau, A. M., Martens, C., Politis, A. Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e57966, doi:10.3791/57966 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image