Iniziazione di generazione e On-Demand di attività Ictal acuta nel tessuto umano e del roditore

Modelli di sequestro acuta è in grado di riprodurre con successo elettrografiche firme ricorda eventi ictal osservati nell’elettroencefalogramma (EEG) di individui che avvertono un attacco epilettico. I ricercatori usano questi eventi ictal-come (di seguito definiti ‘ictal eventi’) come surrogati per il grippaggio evento¹. Clinicamente, eventi ictal servono come un proxy affidabile per gli eventi di sequestro, poiché i sequestri sono un disturbo neurologico che proviene dal cervello. In unità di monitoraggio di epilessia, neurologi si basano sulla rilevazione di eventi ictal per confermare regione epilettogena del cervello e isolarlo per resezione². In unità di cure intensive, i medici controllano attività ictal per valutare se qualsiasi attività convulsiva persiste in pazienti sedati³. Controllo delle crisi epilettiche rimane per essere un problema impegnativo per la comunità medica, come 30% dei pazienti di epilessia sono farmaco resistenti al farmaco disponibile^4,5, e 10% di casi medici che coinvolgono i sequestri di droga-indotto sono non risponde al trattamento standard³. Questo presenta una seria preoccupazione per la società, come 10% della popolazione americana è prospezione per sperimentare un sequestro evento nella loro vita e 3% sono tenuti a sviluppare l’epilessia⁶.

Studiando i sequestri in modelli di epilessia cronica è costoso, faticoso e spesso impiegano mesi per preparare⁷. È anche difficile effettuare registrazioni elettrofisiologiche in animali liberi di muoversi. Test clinici umani affrontano problemi simili, come pure ulteriori complessità relative al consenso del paziente, variabilità in ambiti di provenienza dei partecipanti e le considerazioni etiche e morali coinvolti⁸. Modelli di crisi acuta, d’altra parte, sono favorevole perché sono relativamente conveniente da preparare, costo-efficiente e in grado di generare grandi volumi di eventi ictal per Studio⁹. Inoltre, il tessuto è fissato in una posizione stabile, quindi le condizioni sono ideali per eseguire le registrazioni elettrofisiologiche necessarie studiare dinamiche di grippaggio e la patofisiologia di fondo correlata. Modelli di acuta crisi restano favorevoli rispetto ai modelli in silico (computer) perché sono basati su materiale biologico composto costituente rete neuronale del cervello con tutti i suoi fattori e connettività sinaptica, che non può essere catturata ¹⁰i modelli di computer anche le più dettagliate. Queste caratteristiche rendono modelli acuta sequestro pronte ad per essere efficienti a screening per potenziali terapie anti-sequestro e rendendo i risultati preliminari prima di loro avanzare per ulteriori indagini nei modelli di epilessia cronica e studi clinici.

In genere, modelli di sequestro acuta sono derivati dal tessuto normale del cervello che è stato sottoposto a condizioni di iper-eccitabile. Per indurre gli eventi ictal clinicamente rilevanti nel tessuto cerebrale sano, è importante capire che il cervello funziona in modo ottimale in un stato critico¹¹ dove eccitazione (E) e l’inibizione (I) sono equilibrato¹². Una perturbazione del E-ho equilibrio può portare allo stato iper-eccitabile sequestro in cui precipitano eventi ictal. Di conseguenza, all’interno di questo quadro concettuale, esistono due strategie principali per generare eventi ictal nelle fette del cervello (in vitro) o nelle preparazioni del intero-cervello (in vivo): sia diminuita inibizione (“disinibizione”) o aumentata eccitazione (“non-disinibizione”). Tuttavia, eventi ictal sono altamente ordinati e sincronizzati gli eventi che richiedono l’influenza di interneuroni GABAergici di orchestrare la rete neurale attività^13,14. Per questo motivo, non-disinibizione modelli sono i più efficaci per la generazione di eventi ictal isolato di reti neurali, come in un in vitro cervello affettare¹⁵, considerando che in vitro disinibizione modelli comunemente conducono a chiodare l’attività ricorda di interictal-come chiodare. Inoltre, all’interno di questo quadro concettuale, un evento di sincronizzazione momentaneo anche in modo affidabile può innescare un evento ictal¹⁶. Infatti, può essere attivato un evento ictal mediante qualsiasi perturbazione minori applicato al sistema neurale¹⁷ quando è a un punto di transizione (“biforcazione”) stato critico¹⁸. Tradizionalmente, queste perturbazioni sono state indotte da stimolazione elettrica. Lo sviluppo recente di optogenetica in neuroscienza, tuttavia, offre ora una strategia più elegante per indurre lo stato critico transizioni¹⁶.

I metodi descritti in questo documento viene illustrato come generare eventi ictal su richiesta nei modelli di sequestro acuta sia in vitro (passaggio 1 del protocollo) e in vivo studi (punto 2 del protocollo). Essi comportano la scelta della regione del cervello, metodo di induzione del sequestro, studio tipo e specie; Tuttavia, il focus sarà sulla scelta consigliata di un modello acuto 4-AP corticale sequestro a causa della sua versatilità in un’ampia varietà di tipi di studio. Il modello di 4-AP sequestro acuta in vitro è basato sul protocollo standard per preparare fettine di cervello di alta qualità per registrazioni elettrofisiologiche e formazione immagine studia¹⁹. Questi protocolli sono già stati utilizzati per rendere in vitro fette coronali del cervello dalla corteccia somatosensory-motor di topi^16,20 e gli esseri umani²¹. Modifiche per generare eventi ictal in questi tipi di fette del cervello sono state dimostrate in precedenza¹⁶ e tutti i dettagli sono descritti nel protocollo sotto. Il modello di 4-AP sequestro corticale acuta in vivo è basato sul protocollo standard per preparare un craniotomy per imaging studies²². La modifica è che nessuna finestra (vetrino) è installata dopo il craniotomy. Invece, agenti proconvulsivante (4-AP) vengono applicati per via topica alla corteccia esposta per indurre eventi ictal mentre l’animale è in anestesia generale. A nostra conoscenza, il nostro gruppo è stato il primo a sviluppare questo modello di grippaggio corticale acuta in vivo in topi^16,23. Acuta in vivo 4-AP corticale sequestro modello preparato da topi adulti è stato sviluppato per completare il modello in vitro fetta dal tessuto giovanile. La replica dei risultati del modello di grippaggio adulto in vivo consente di generalizzare i risultati dai modelli di fetta di affrontare le preoccupazioni inerenti per quanto riguarda le condizioni di non-fisiologica di una fetta di cervello 2D (contro un 3-d del intero-cervello struttura) e le differenze fisiologiche tra tessuto giovanile e adulto.

Il metodo di apertura su richiesta evento ictal è dimostrato usando entrambi sbuffi di neurotrasmettitori con un picospritzer o optogenetica strategie. Al meglio della nostra conoscenza, il nostro gruppo è il primo ad avviare eventi ictal nel tessuto umano usando neurotrasmettitori tramite un picospritzer¹⁶. Per le strategie di optogenetica, il ceppo di topi C57BL/6 è il ceppo convenzionale utilizzato per esprimere i transgeni. L’espressione di channelrhodopsin-2 (ChR2) in interneuroni GABAergici o cellule piramidali glutamatergic fornirà la possibilità opzionale di generare eventi ictal on-demand con brevi impulsi di luce. Ceppi di topi optogenetica adatto comprendono la variante C57BL/6 disponibile in commercio che esprime la ChR2 in entrambi interneuroni, utilizzando il mouse vescicolare GABA trasportatore promotor (VGAT)²⁴, o cellule piramidali, utilizzando l’antigene delle cellule di timo del mouse 1 Promotor (Thy1)²⁵. Questi topi VGAT-ChR2 e Thy1-ChR2 disponibili in commercio offrono la possibilità di attivare i neuroni GABAergici o neuroni glutamatergici, rispettivamente, nella neocorteccia con blu (470 nm) luce. La capacità di generare gli eventi ictal on demand in modelli di sequestro acuta può offrire nuove opportunità per studiare la dinamica l’inizio di grippaggio e in modo efficiente valutare potenziali terapie anti-sequestro.