JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Deutsch

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Autopsie-basierte Wildfisch Gesundheitsprüfung

Published: September 11, 2018
doi:
10.3791/57946
, , ,
1National Fish Health Research Laboratory, Leetown Science Center,U.S. Geological Survey, 2School of Natural Resources,West Virginia University

Summary

Die Gesundheit der wilde Fische kann als Indikator für aquatische Ökosystem Gesundheit verwendet werden. Autopsie-basierte Fisch Gesundheit Bewertungen dokumentieren sichtbare Läsionen oder Anomalien, Daten zur Berechnung des Zustand-Indizes sowie die Möglichkeit, Gewebe für mikroskopische Beurteilung, Genexpression und andere tiefer gehende sammeln Analysen.

Abstract

Anthropogener Einflüsse von mehr Nährstoffe und chemische Schadstoffe, Lebensraum Änderungen und Klimawandel, können erhebliche Auswirkungen auf die Fischbestände haben. Nebenwirkungen, Überwachung, Verwendung Biomarker von die organismal auf die molekulare Ebene lässt sich die kumulative Auswirkungen auf Fische und andere Organismen zu beurteilen. Gesundheit der Fische wurde weltweit als ein Indikator für aquatische Ökosystem Gesundheit verwendet. Die Autopsie-basierte Fisch gesundheitliche Bewertung liefert Daten zur sichtbaren Auffälligkeiten und Läsionen, Parasiten, Zustand und Organosomatic Indizes. Diese können nach Standort, Jahreszeit und Geschlecht, sowie zeitlich, Belegänderung im Laufe der Zeit verglichen werden. Bewertungen des Schweregrads können verschiedene Beobachtungen zugeordnet werden, ein Fisch Gesundheitsindex für weitere quantitative Bewertung zu berechnen. Ein Nachteil der Autopsie-basierte Bewertung ist, dass es basiert auf visuelle Beobachtungen und Zustand Faktoren, die nicht so empfindlich wie Gewebe und subzelluläre Biomarker für subletale Effekte sind. Darüber hinaus ist es selten möglich, Ursachen oder Risikofaktoren im Zusammenhang mit beobachteten Anomalien zu identifizieren. So kann beispielsweise eine erhöhte Läsion oder “Tumor” auf den Flossen, der Lippen oder der Körperoberfläche ein Neoplasma sein. Es könnte jedoch auch eine Reaktion auf einen Parasiten, chronische Entzündungen oder Hyperplasie von normalen Zellen als Reaktion auf ein Reizmittel. Umgekehrt, Neoplasmen, bestimmte Parasiten und anderen Krankheitserregern viele Gewebeveränderungen sind nicht sichtbar und können so unterschätzt werden. Jedoch können während der Autopsie-basierte Bewertung, Blut (Plasma), Gewebe für die Histopathologie (mikroskopische Pathologie), Genomik und andere Molekulare Analysen und Otolithen für das Altern gesammelt werden. Diese nachgelagerten Analysen zusammen mit raumbezogenen Analysen, Lebensraum Bewertungen können Qualität und Schadstoffbelastung Wasseranalysen alle umfassendes Ökosystem Auswertungen wichtig sein.

Introduction

Menschliche Aktivitäten haben zahlreiche negative Auswirkungen auf aquatische Umgebungen. Fische bewohnen verschiedene Gewässer, die die menschliche Bevölkerung erschafft und oft verwendet als eine Trinkwasserquelle und daher sind wichtige Indikatoren für die Gesundheit der aquatischen Umwelt. Wildlebende Fische, die Leben und reproduzieren in einem bestimmten Lebensraum sind im Laufe ihres Lebens auf verschiedene Stressoren auch Krankheitserreger, Parasiten, schlechte Wasserqualität und chemischen Verunreinigungen ausgesetzt. Tausende von Chemikalien geben unsere Wasserstraßen durch menschliche und industrielle Abwässer, s-Bahn/urban Regenwasser und landwirtschaftliche Abfluss. Diese komplexe Mischungen von Chemikalien können additive, synergistische oder antagonistische Wirkungen auf Organismen1,2,3ausgesetzt. Darüber hinaus andere Umweltstressfaktoren wie z. B. erhöhte Nährstoffe, erhöhter Temperatur, niedrige gelösten Sauerstoff oder schwankenden pH-Wert kann die Wirkungen von chemischen Verunreinigungen4,5verschlimmern. Umweltstressfaktoren können auch Infektionskrankheiten Ergebnisse direkt durch Erhöhung der Zahl der Infektionserreger6, die Steigerung der Virulenz der opportunistische Krankheitserreger7 oder unterdrücken die Immunantwort und Krankheit beeinflussen. Widerstand der Host8,9,10. Aus diesen Gründen ist es zunehmend Interesse an biologischen oder nachteilige Auswirkungen Überwachung11,12,13,14, Verwendung von Fischen und anderen Wasserlebewesen zu identifizieren Populationen und Ökosystemen gefährdet.

Nebenwirkungen, die Überwachung nutzt Biomarker auf verschiedenen Ebenen der Organisation, von der die organismal subzelluläre oder molekulare, subletale Effekte zu identifizieren, die möglicherweise Einfluss auf Populationen und indikative der Exposition gegenüber verschiedenen Stressoren. Indikatoren auf der Ebene des Organismus gehören sichtbare Anomalien und Bedingungen. Zustand-Indizes basierend auf Länge und Gewicht werden berechnet, Wohlbefinden oder Fitness von Fischpopulationen zu bewerten. Die häufigste ist Fultons Zustand Faktoren (K) = (Gewicht/Länge3) 15. Ein weiterer Indikator ist die Anwesenheit von sichtbaren Auffälligkeiten. Eine Vielzahl von Methoden wurden in einzelnen Studien und monitoring-Programme verwendet, um bewerten, Dokument, und sichtbare Anomalien. Bewertung basierend nur auf externe Anomalien, d. h. der Anteil der Personen mit Krankheiten, Flossenschäden, Tumoren und Skelettanomalien, ist eines der Metriken für den Index der biotischen Integrität (IBI), die Gemeinschaft Gesundheit16auswertet. Eine ähnliche Einschätzung bezeichnet Deltas (Missbildungen, Erosionen, Verletzungen, Tumoren) wurde auch verwendet, um die Gesundheit der Fische Gemeinschaften17zu bewerten. Diese Methoden schätzen aber nur externe visuelle Anomalien und nicht interne Läsionen oder subletalen Frühindikatoren.

Autopsie-Bewertungen sind externe und interne Beobachtungen und die Messung der Zusatzbedingung Indizes ermöglichen. Hepatosomatic Index (Körpergewicht Leber Gewicht/gesamt) wird auch als Indikator für Fitness oder Energiereserven15 ein höherer Indexwert für die gesündere Fische gibt. Eine Reihe von Studien haben jedoch gezeigt, dass Hypertrophie oder eine Zunahme der Größe der Leber aufgrund der Exposition gegenüber verschiedenen Verunreinigungen, die von der Leber18,19,20metabolisiert auftritt. In diesem Fall würde ein höherer Index Exposition gegenüber bestimmten chemischen Klassen hindeuten. Der Gonadosomatic Index (Gonade Gewicht/gesamt Körpergewicht) ist ein weiterer Konditionsindex auf reproduktive Gesundheit21gerichtet. Beobachtungen während der Autopsie-basierte Bewertung können verwendet werden, um die Verteilung der einzelnen Läsion Arten oder Prozentsatz der normalen Individuen zu vergleichen. Sie können jedoch auch in eine mehr quantitative Gesundheit Einschätzung22,23verwendet werden.

Die standardisierte Autopsie-Einschätzung des hier beschriebenen kann verwendet werden, um die grob sichtbar Bewertung in vielfältiger Weise abhängig von der Frage(n) zu beantworten, Know-how und anderen verfügbaren Ressourcen zu erweitern. Unsere Routine Ansatz besteht darin, sammeln biometrische Daten (Länge, Gewicht, Leber Gewicht, Gonade Gewicht), Blut-Plasma/Serum Analysen, Dokument externe und interne sichtbare Anomalien, Stücke von Organen für mikroskopische Analysen bewahren und sammeln Otolithen für Alter-Analysen. Autopsie-basierte Bewertung plus altersanalyse und Histopathologie der verschiedenen Organe können für die Berechnung und Vergleich der verschiedenen Zustand Indizes, Prävalenz von mikroskopischen Gewebeveränderungen sichtbar Anomalien sowie nach Geschlecht, Alter, Ort und Abtastperiode. Zusätzliche Gewebe Sammlungen können für viele andere Analysen einschließlich der Elektronen-Mikroskopie, Bakteriologie, Virologie, Parasitologie und chemischen Konzentrationen erfolgen. Diese Methoden können auch Bestandteil mehr vertiefte Analysen verwendet, um die Ursache der Fisch tötet24 diagnostizieren oder Todesfälle von gefangenen Fische25. Methoden zur Sammlung des Gewebes für zwei zusätzliche Analysen, gen-Expression und funktionelle immun werden dargestellt.

Protocol

Hier beschriebene Methoden wurden von der Leetown Science Center institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt. 1. die Fischsammlung Lebende Fische mit einem Minimum an Stress zu sammeln. Verwenden Sie Boot oder Rucksack elektrobefischung, Haken und Linie oder Netze. Halten Sie Fisch in live Brunnen oder belüfteten Behälter bis Probenahme.Hinweis: The American Fisheries Society veröffentlichte eine Reihe von Leitfäden für Anästhesie/Euthanasie26,27,28, Fischsammlung und Handhabung. Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Fisch. (2) Fische Autopsie Einschläfern eines Fisches. Legen Sie Fisch in der Narkose bis Kiemendeckel Bewegung aufhört und der Fisch Gleichgewicht verliert. Nach einer anderen 2 – 10 min wird der Fisch eingeschläfert werden; Dies kann jedoch auch durch Arten variieren.Hinweis: Fische können mit einer Reihe von Anästhetika eingeschläfert werden (siehe Tabelle der Materialien für die am häufigsten verwendet). Die Euthanasie-Methode hängt von der Labor-Messungen, die auf dem Gewebe gesammelt29durchgeführt werden. Biometrische Merkmale zu messen. Wiegen Sie die Fische bis aufs Gramm. Messen Sie die Länge der Fische auf den Millimeter. Messen Sie die Gesamtlänge von der Spitze der Schnauze mit dem Mund geschlossen bis zum Ende der Rute wenn zusammen geklemmt. Messen der Gabellänge von der Gabelung des Schwanzes an der Spitze der Schnauze und der Standardlänge von der Spitze der Schnauze bis zum Ende des Körpers (Anfang der Rute). Berechnen Sie den Zustand-Faktor mit folgender Formel:Zustand-Faktor = (gesamte Körpergewicht – Gonade Gewicht) / Gesamt Länge3.Hinweis: Gonade Gewicht ist das gesamte Körpergewicht subtrahiert Gonaden deutlich auf das gesamte Körpergewicht, besonders in prespawn Rogner beitragen können. Erhalten Sie eine Blutprobe.Hinweis: Blut wird am häufigsten die Caudale Vene entnommen aber auch aus der dorsalen Aorta zurückgezogen werden oder durch Herzstillstand Punktion30. Extrahieren einer peripheren Blutprobe aus der kaudalen Vene mit einer 22 oder 23 G-Nadel auf eine 1 bis 5 mL Spritze, je nach Größe des Fisches. Stechen Sie die Nadel anterior der kaudalen Bereich unterhalb der Seitenlinie (Abbildung 1A und 1 b). Angeln sie nach oben bis auf die Wirbelsäule und dann zurückziehen Sie etwas. Die Vene ist ventral der darüberliegenden Wirbelsäule.Hinweis: Wenn Blut Abstriche gemacht werden oder Serum erforderlich ist, wird keine Gerinnungshemmer verwendet. In den meisten Fällen Plasma gesammelt werden und somit ein Antigerinnungsmittel wie Natrium Heparin, EDTA oder Lithium wird verwendet, um die Nadel und Spritze Mantel und ist auch in dem Blut Sammelrohr (z.B. Vacutainer). Entfernen Sie die Nadel und legen Sie in eine Kleie Entsorgungsbehälter vor der Inbetriebnahme des Bluts in das sammelröhrchen.Hinweis: Blut auf dem Eis stattfinden kann aber je nach weiteren Analysen sollten so bald wie möglich30zentrifugiert werden. Wenn nukleare Anomalien oder differential Blutbild ausgewertet wird, geben Sie einen Tropfen Blut sofort auf doppelte sauberes Glas-Objektträger. Eine zweite Folie in einem 45°-Winkel in die Tropfen, die dann über die Oberfläche durch Kapillarwirkung gezogen wird zurück. 31an der Luft trocknen lassen. Zentrifugieren Sie Blut bei 1.500-2.500 X g für 15 min zu sedimentieren die Zellen. Plasma/Serum mit einer sterilen transferpipette, aliquoten in kryogenen Fläschchen zu entfernen und speichern bei-80 ° C. Abbildung 1 : Eine Blutprobe von einem Fisch erhalten. (A) A vor kurzem eingeschläfert Fisch ist auf seiner Seite und die Seitenlinie befindet sich gelegt. (B) ein Nadel ist eingefügten Ventral, lateral Line (Pfeil), schräg nach oben bis Nadel berührt das Rückgrat. Er zieht sich dann leicht zurück, und Saug initiiert, um Blut zu entziehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Durchführung einer Autopsie-basierte Diagnostik auf jeden Fisch.Hinweis: Eine Reihe von Publikationen zur Veranschaulichung und Beschreibung von Läsionen und Anomalien sind verfügbar32,33,34,35. Dokumentieren Sie externe Störungen einschließlich Läsionen an Körperoberfläche und Flossen (Abbildung 2), Augen und Kiemen (Abbildung 3), äußere Parasiten wie Blutegel (Abb. 2D), Larven oder Trematode Metacercarial Zysten (Abb. 2D, 3 b) und gill Parasiten (Abbildung 3D). Wenn möglich auch als fotografisch, Art, Lage und Größe der beobachteten Anomalien auf Datenblätter, dokumentieren. Öffnen der Bauchhöhle (Abb. 4A) mit einer Schere durch Schneiden aus dem Analbereich auf die Kiemendeckel und entfernen dann die Klappe des Muskels, um die inneren Organe verfügbar zu machen.Hinweis: Wenn die vorderen Niere gesammelt werden für Immune Funktion (siehe Schritt 5 unten) oder Proben für Bakteriologie und Virologie, die äußere Körperoberfläche sollte mit 70 % Alkohol desinfiziert werden und diese Proben gesammelt werden, bevor die Autopsie durchgeführt. Wenn Gewebe nur zur visuellen Beobachtungen, Plasma-Analysen dienen und Histopathologie steriler Technik nicht notwendig ist. Dokuments interne Anomalien (Abbildung 4) einschließlich allgemeine oder fokale Verfärbungen der verschiedenen Organe (Abbildung 4 b-4D), Vorhandensein von angehoben (Abb. 4E), Zysten, die Parasiten und Anomalien (Größe vergrößert, verkümmert). Abbildung 2 : Beispiele für sichtbare Läsionen auf Körperoberfläche und die Flossen des Fisches beobachtet. (A) A kleine, leicht erodierten Läsion (Pfeil) an der seitlichen Körperoberfläche. (B) ein großer geröteten Bereich (Pfeil) unter Einbeziehung der kaudalen Körperoberfläche. (C) erhaben, schwarzen Läsionen (Pfeile) auf der Oberfläche des Körpers und die Flossen. (D) Blutegel (weißer Pfeil) und kleinen schwarzen Flecken (Schwarze Pfeile) auf der Flosse. Maßstabsleiste = 3 mm. (E) A angehoben, multilobed, blasse Läsion (Pfeil) auf der Oberfläche des Körpers. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Beispiele für sichtbare Läsionen der Kiemen und Augen der Fische. (A) A pale Bereich (Pfeil) innerhalb der Linse des Auges. Maßstabsleiste = 5 mm. (B) weiße Zysten (weisse Pfeile) und kleine schwarze Flecken (Schwarze Pfeile) verursacht durch Trematode Parasiten auf die Kiemendeckel über die Kiemen (a). Maßstabsleiste = 1 cm. (C) A blasse, erodierte Bereich (Pfeil) auf die Kieme (a). Maßstabsleiste = 5 mm. (D) ein Gill, der entfernt wurde mit Parasiten (Pfeile) an die Gill-Filamente. Maßstabsleiste = 2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Beispiele für eine Autopsie und interne Anomalien der Fische. (A) während einer Autopsie der Fische ist aufgeschnitten (entlang der weiße Pfeil) und eine Klappe des Muskels (schwarzer Pfeil) entfernt, um die Gonade (a) und der Milz, von Pinzetten und Scheren verfügbar zu machen. (B) fleckige Leber (a), Hoden (b), Darm, umgeben von adipösen Fett (c) und Magen (d). Maßstabsleiste = 5 mm. (C) (a) mit einem dunklen roten Bereich (Pfeil), Eierstock (b) und (c) Darm Leber. Maßstabsleiste = 5 mm. (D) Leber mit grünlich verfärbte Bereiche (Pfeile). Maßstabsleiste = 1 cm. (E) Beispiel (a) eines normalen und abnormalen (b) Hoden mit angehoben Knötchen. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Hepatosomatic Index (HSI) erhalten. Entfernen Sie Leber durch Durchtrennung der leberarterie und das Bindegewebe der vorderen Ende. Heben Sie vorsichtig heraus beim Trimmen Verwachsungen und andere Verbindungen in Darm und adipösen Fett. Achten Sie darauf, keine Punktion die Gallenblase. Wiegen Sie die Leber.Hinweis: Einige Fische, wie z. B. Cypriniden, keine diskrete Leber eher hepatischen Gewebe umwickelt Darm und anderen Organen haben. Für diese Arten möglicherweise es nicht möglich, Leber Gewichte zu erhalten. Berechnen Sie Hepatosomatic Index (HSI) mit der Formel:HSI = Körpergewicht Leber Gewicht/gesamt Den Gonadosomatic-Index zu berechnen. Entfernen der Keimdrüsen und wiegen es. Berechnen Sie Gonadosomatic Index (GSI) mit der Formel:GSI = Körpergewicht Gonade Gewicht/gesamt 3. bewahren Sie Gewebe für mikroskopische Pathologie Hinweis: Eine Reihe von Fixiermittel einschließlich 10 % neutral gepuffertem Formalin und Z-Fix, Formalin-basierte Fixiermittel mit Zink, für die Erhaltung des Gewebes im Bereich einsetzbar. Letzteres wird bevorzugt, wenn Methoden wie in Situ Hybridisierung oder fluoreszierende Antikörper Färbung verwendet werden können. Sorgfältig geschnitten sondern Gewebeproben nicht herausziehen. Halten einzelner Gewebe Stücke < 2 cm groß und < 5 mm Dicke für die ordnungsgemäße Fixierung. Als Faustregel gilt verwenden Sie ca. 10 x mehr Fixiermittel nach Volumen als das Gewebe für Pflege und Bewahrung. Legen Sie alle Gewebeproben aus einem Fisch in einem auslaufsicheren Behälter der entsprechenden Größe, abhängig von der Größe der Fische wird abgetastet. Legen Sie keine externen Auffälligkeiten im Fixativ Container. Darüber hinaus enthalten Sie eine angrenzende Stück des normalen Gewebes.Hinweis: Unsachgemäße Handhabung wie Kompression oder andere mechanische Beschädigungen, Langzeitbelichtung, Luft oder Sonnenlicht, und Einfrieren können Artefakte verursachen. Mindestens fünf 3 – 4 mm Dicke Stücke Leber aus verschiedenen Regionen und in den Fixativ Behälter. Sind normal und abnormal, wenn beobachtet. Je nach Größe legen Sie eine ganze Gonade oder mehrere Stücke entlang eine Gonade in Fixativ Container. Legen Sie entweder ganze Organe, wenn kleine, oder Stücke von allen anderen Organen (Milz, vordere und hintere Niere, Kiemen, Herz, Darm und Magen) in den Fixativ Behälter. Wenn krankhaftes Gewebe beobachtet wird, erhalten Sie eine angrenzende Stück des normalen Gewebes sowie. 4. entfernen Sie die Otolithen für Alter Analysen Hinweis: Alter kann eine wichtige Variable in Fisch Krankheit/Fische Gesundheitsstudien sein. Während eine Reihe von Strukturen, einschließlich Skalen und Stacheln, für Altersbestimmung verwendet wurden, haben die meisten Studien zum Vergleich der Strukturen der Otolithen geben die besten Resultate36,37gefunden. Teleost Fische haben drei Paare der Otolithen – Lapilli, Sagitta und Asteriscus. Im Allgemeinen sind die sagittalen oder Lapilli Otolithen für das Altern gesammelt, obwohl die Arten variieren. Entfernung und Alterung Techniken wurden zuvor beschriebenen38. Schnitt durch den Isthmus Gill und den Kopf nach hinten beugen. Streifen entfernt Binde- und muskulären Gewebe um die minderwertige Teile des Neurocranium, Prootic Bullae, einen erhöhten knöchernen Bereich zu finden. Punkten Sie oder mit Knochen Messer geschnitten Sie und knacken Sie, die Otolithen aussetzen. Sie können mit dem bloßen Auge gesehen werden. Legen Sie Otolithen in einem beschrifteten Fläschchen oder eine Münze Umschlag und bei Raumtemperatur bis auf Alter analysiert durch zählen der Ringe oder Schritten38lagern. Wenn Platzierung in einer Durchstechflasche einmal zurück an das Labor den Verschluss öffnen und lassen Sie gründlich trocknen Sie vor der Lagerung. Abbildung 5 : Entfernung von Otolithen. (A) die Landenge wird geschnitten und das Bindegewebe und Muskulatur zog Weg, um die Basis der Wirbelsäule und Neurospinal Bereich setzen. (B) der Knochen ist gebrochen, um die Otolithen verfügbar zu machen. (C) Lapillar Otolithen werden entfernt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. (5) Gewebe für Immunfunktion Assays erhalten Hinweis: Die vordere Niere ist die wichtigen blutbildenden Organ, die Quelle der Lymphozyten und Makrophagen für funktionelle Assays und aseptisch entfernt werden, wenn Zellen für funktionelle Assays, wie mitogenese, phagocytic und Tötung Fähigkeit kultiviert wird Makrophagen39,40. Sprühen Sie die äußere Oberfläche des Fisches mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie sterile Schere und eine Pinzette und Skalpell Öffnen der Bauchhöhle und Entfernen der vorderen nierengewebe, die eine dunkle rote Orgel anterior der Schwimmblase ist. Legen Sie die vorderen Niere Probe in Medien (z. B. Leibovitz L-15), die Zellen lebendig zu halten. Niere Proben mit einem sterilen Handheld Gewebe Schleifer (z. B. Tenbroeck Gewebe Grinder) in einzelne Zellsuspensionen zu homogenisieren. Halten Sie auf nassem Eis bis zum Labor zurückgegeben. 6. bewahren Sie Gewebe für Nukleinsäure-Analysen Hinweis: Wenn nachgeschaltete molekulare Analyse durchgeführt werden, z. B. Genexpression mit Transkript Fülle41 oder quantitative PCR42 (Polymerase-Kettenreaktion), legen Sie die Stücke des Gewebes in einem geeigneten Konservierungsmittel ( beurteilt werden z.B., RNAlater Stabilisierung Lösung) so bald wie möglich. Legen Sie für RNA-Konservierung zwei bis drei klein (2 – 3 mm) Stücke in den entsprechenden Konservierungsmittel im Verhältnis 10:1 Konservierungsmittel Volumen an Gewebe.Hinweis: Proben sollten geschützt vor Sonneneinstrahlung und Hitze und auf nassem Eis transportiert werden. Legen Sie für DNA-Konservierung zwei bis drei kleine Stücke des Gewebes in 95 % igem Ethanol (10:1 Ethanol zu Gewebe nach Volumen). Halten Sie dann die Proben auf nassem Eis und dann speichern bei-20 ° C.

Representative Results

Great Lakes Bereiche der Sorge (AOC) sind geografische Gebiete, die aufgrund von Beeinträchtigungen der verschiedenen sinnvolle Nutzungsmöglichkeiten vorgesehen waren. Die Nutzniessung Beeinträchtigungen (BUIs) bei vielen AOC gehört die Fisch-Tumoren oder anderen Fehlbildungen. Millionen von Dollar wurden für die Sanierung und Restaurierung von jedem dieser Bereiche ausgegeben, um die verschiedenen BUIs und letztlich der AOC43Delisting. Die Kriterien für das delisting des Fisch Tumors BUI von Staat zu Staat unterscheidet (siehe epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf und dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); wie das delisting urkundlich erwähnt, ist jedoch eine Verpflichtung zur Bestimmung der Prävalenz von Tumoren der Leber und in einigen Fällen Hauttumoren. In vielen Fällen die Prävalenz im Vergleich zu einer nicht-AOC-Referenz-Website. Der Fisch Tumor BUI war an drei AOC (St. Louis River, Milwaukee River und Sheboygan River) und eine nicht-AOC-Referenz-Website (Kewaunee River) auf Seen Superior und Michigan, unter Verwendung einer Autopsie-Beurteilung der weißen Sauger (Catostomus Commersonii ausgewertet. ), gefolgt von mikroskopische Pathologie der Haut und Lebergewebe. Fische wurden gesammelt, von den Flüssen Milwaukee, Sheboygan und Kewaunee in 2012 und 201344 bis St. Louis River im Jahr 2015 (unveröffentlichte Daten). Zweihundert weisse Sauger wurden aus Milwaukee, Kewaunee und St. Louis und 193 von Sheboygan bewertet. Per Definition kann ein Tumor Schwellungen oder erhöhten Bereich, obgleich es im Allgemeinen gilt, dass eine Schwellung verursacht durch eine abnorme Wachstum von Gewebe mit abnormen Zellen entweder gutartig oder bösartig Neoplasma ist. Weißen Sauger gesammelt von allen Seiten stellte eine Vielzahl von externen erhabene Läsionen wie kleine, diskrete weiße Flecken, größere weiße Flächen, leicht erhöhte schleimigen Läsionen und multilobed erhöhten Flächen auf der Oberfläche des Körpers und Lippen (Abbildung 6). Fische wurden gewogen und gemessen, um eine Bedingung-Faktor zu erhalten, externe und interne Anomalien wurden dokumentiert und Haut und Leber Gewebe wurde für die Histopathologie gesammelt. Abbildung 6 : Erhabene Hautveränderungen beobachtet auf weißen Sauger von den großen Seen. (A) eine diskrete weißer Fleck auf der Oberfläche des Körpers. Maßstabsleiste = 5 mm. (B) ein leicht angehoben Mucoid (Pfeile) und multilobed Läsionen (a) auf der Oberfläche des hinteren Körpers. Maßstabsleiste = 1 cm. (C) A große, multilobed Läsion auf der Oberfläche des Körpers. Maßstabsleiste = 1 cm. (D) zahlreiche Multi-gelappte Läsionen auf den Lippen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Prozent von Fisch mit externen Tumoren oder erhöhten verfärbt Bereichen reichte von 15,5 % auf die St. Louis AOC bis 58,0 % bei den Milwaukee AOC. Im allgemeinen waren die diskrete weißen Flecken die kleinste gemeinsame visuelle Läsion während der multilobed Lippe und Körper Oberfläche Läsionen am häufigsten waren. Die Anzahl der Fische mit beobachtbaren Leber Knötchen war gering, von 1,5 % bei Kewaunee und St. Louis bis hin zu 2,5 % in Milwaukee (Tabelle 1). Flüsse und Jahr abgetastet Sichtbare Läsionen Kewaunee 2013 St. Louis-2015 Sheboygan 2012 Milwaukee 2013 Diskrete weiße Flecken 16 3 3.1 5 Mucoid 20 9.5 9.8 30,5 Multilobed 22.5 3 29.5 40 Insgesamt wuchs Haut Anomalieneine 46 15.5 38,3 58 Sichtbare Leber Knötchen 1.5 1.5 1.6 2.5 ein Gesamtzahl der Fisch mit erhöhten Läsionen. Einige Fische hatten mehrere Arten von Anomalien. Tabelle 1: Autopsie-Beobachtungen von weißen Sucker gesammelt an großen Seen Problembereiche und eine Referenz-Website (Kewaunee River), als Prozentsatz dargestellt.Visuelle Untersuchung kann verwendet werden, um den Prozentsatz der Fisch mit verschiedenen Anomalien zu dokumentieren. Aber, um das Vorhandensein und die Art der Neoplasie endgültig zu diagnostizieren, Gewebe müssen werden mikroskopisch untersucht (Histopathologie). Bei der mikroskopischen Untersuchung wurde festgestellt, dass nicht alle der erhabenen Läsionen neoplastischen waren. Viele der diskrete weißen Flecken und die schleimigen Läsionen, vor allem in Kewaunee, waren eher hyperplastische Läsionen als Neoplasie (Tabelle 2). Darüber hinaus wurden alle die Hauttumoren beobachtet Kewaunee und St. Louis, gutartige Papillome. In Sheboygan und Milwaukee beobachtet Papillome und Squamous Zelle Karzinome, maligne Hauttumoren (Tabelle 2). Flüsse, die Stichprobe Neoplasma-Typ Kewaunee 2013 St. Louis-2015 Sheboygan 2012 Milwaukee 2013 Papilloma 21 5.2 30,5 37,5 Squamous Zelle Krebsgeschwür 0 0 2.1 10.5 Gesamte Haut Neoplasmen 21 5.2 32,6 48 Gallengang Neoplasmenein 2.5 4 6.2 9.5 Hepatische Zelle Neoplasmenb 1 0 2.1 8 Insgesamt Leber-Tumoren 3.5 4 8.3 15,0c ein Beinhaltet Cholangioma und Gallengangskarzinom b Enthält hepatischen Zellen Adenom und Leber-Karzinom c Einige Fische hatten Gallengang und hepatische Neoplasmen Tabelle 2: Mikroskopisch überprüft neoplastische Läsionen der weißen Sauger an großen Seen Problembereiche und eine Referenz-Website (Kewaunee River), dargestellt als Prozentsatz erhoben.Die histopathologische Analyse identifiziert auch Tumoren der Leber, die nicht durch visuelle Beobachtung identifiziert wurden. Während nur 1,5 % der Fische von Kewaunee und St. Louis gesammelt sichtbare Leber Knötchen (Tabelle 1) hatte, hatte 3,5 % und 4,0 % bzw. mikroskopisch Neoplasmen (Tabelle 2) identifiziert. Eine größere Differenz wurde in Sheboygan (1,6 % gegenüber 8,3 % mikroskopisch sichtbar) und Milwaukee (2,5 % 15,0 % mikroskopisch sichtbar) gesehen. Mikroskopische Untersuchung bietet auch eine Differenzierung der Tumoren der Gallenwege gegenüber hepatischen Zellen-Ursprung (Tabelle 2) und gutartigen und bösartigen Tumoren.

Discussion

Die Autopsie-Beurteilung der Gesundheit der Fische kann auf alle Fischarten genutzt werden, für die Ermittler ein Verständnis für die normale Darstellung von externen und internen Strukturen hat. Mit einem standardisierten Ansatz ermöglicht Vergleiche zwischen den Standorten und Arten sowie saisonale und zeitliche Änderungen in einer Bevölkerung. Die Ergebnisse einsetzbar, Auswirkungen im Zusammenhang mit Punkt und Nonpoint Quellen von Schadstoffen zu identifizieren und Maßnahmen des Managements zu informieren. Es kann auch verwendet werden, um Verbesserungen zu verfolgen, wenn Maßnahmen des Managements initiiert werden. Die Methodik kann geändert werden, um die Dokumentation der visuellen externe Anomalien in eine Vielzahl von Möglichkeiten zu erweitern. Bewertungen, basierend nur auf visuelle Beobachtungen können nicht-tödliche, relativ kostengünstig und Daten schnell für eine große Anzahl von Personen erzeugt werden können. Infolgedessen ist sie nützlich für explorativen oder erste Einschätzungen, um Änderungen zu überwachen im Laufe der Zeit oder in Kombination mit anderen Indikatoren. Wenn die Länge und Gewicht des Fisches während visuelle Beobachtungen gemessen werden, kann der Zustand-Faktor auch berechnet werden. Obwohl nur auf visuelle Beobachtung Einschätzungen nicht Aufschluß über Ursache oder damit verbundenen Risikofaktoren, langfristige Trends von bestimmten Haut Anomalien45 und biometrischen Parameter46 zeigten Verbesserungen in einigen Bereichen im Zusammenhang mit Wasser Qualitätsverbesserungen.

Die Autopsie-basierte Bewertung enthält weitere Informationen wie die inneren Organe sind auch geprüft und andere Zustand Faktoren wie Hepatosomatic und Gonadosomatic Index berechnet werden können. Goede und Barton22 entwickelte eine Feld-Autopsie-Methode, die enthalten Blutparameter, biometrische Faktoren, den Prozentsatz der Anomalien und Index-Werte für bestimmte Anomalien. Eine Verfeinerung der Methode enthalten eine Bewertung des Schweregrads für einige Variablen, die für Berechnung eines Gesundheitsindex Bewertung, die statistisch23im Vergleich zulässig. Diese Bewertung Gesundheitsindex wurde in den regionalen Standort Vergleiche23,47,48 in Kombination mit anderen biologischen Indikatoren einschließlich Plasma und Histopathologische Untersuchungen in die US Geological verwendet und Umfrage des Biomonitoring Umweltzustand und Trends Programm Bewertung der potenzielle Auswirkungen der Schadstoff-Exposition in großen Flüssen bundesweit49,50,51. Ein Fisch-Krankheit-Index basiert auf äußerlich erkennbare Krankheiten und Parasiten, sichtbaren Tumoren der Leber und anderen erkannt histopathologisch Leber Läsionen entwickelt und ausgiebig genutzt, in der Nordsee, Ostsee, und aus Island. Dieser Index erwies sich als ein Ökosystem Gesundheit Anzeige52ein wichtiges Instrument sein.

Bei der Durchführung der Autopsie-basierte Bewertung auf Fisch gibt es einige entscheidende Faktoren. Erstens müssen Bewertungen auf Fische sofort nach dem Tod durchgeführt werden. Veränderungen im Organ Farbe und Konsistenz können ziemlich schnell nach dem Tod auftreten. Darüber hinaus können einige Parasiten die Gastgeber bald nach Tod verlassen. Zweitens ist es wichtig zu wissen, was normal für die Arten von Interesse ist. Zum Beispiel, einige Fische haben in der Regel fetthaltige und infolgedessen Lebern, blass, während bei den meisten Arten eine blasse Leber anormal wäre. Es ist auch wichtig, jahreszeitliche Veränderungen zu erkennen, die natürlich vorkommen. Einige Fische haben Farbänderungen oder Zucht Tuberkel während der Laichzeit zu entwickeln.

Die Grenzen der Autopsie-basierte Bewertung als eine Methode zur Beurteilung der Gesundheit der Fische enthalten die Unfähigkeit, 1) konsequent die “Ursache” für spezifische Läsionen und (2) identifizieren-Effekte, die mit dem bloßen Auge nicht sichtbar sind. Diese Nachteile können mit dem Zusatz der Histopathologie, Molekulare oder kulturelle Identifikation von Krankheitserregern und Parasiten und Genexpression überwunden werden. Zum Beispiel ein “Tumor” oder erhöhten Läsion (Schwellung) kann tatsächliche Neoplasie oder kann es sein, ein Parasit, Entzündung, Ödem oder Hyperplasie (Zunahme von normalen Zellen), verursacht durch Exposition gegenüber chemischen Stoffen, Krankheitserreger oder andere Reizstoffe. Wie die repräsentativen Ergebnisse zeigt, erfordert definitive Tumor oder Neoplasie Diagnose mikroskopische Pathologie, die Läsion Typ und Schweregrad (d.h., gutartig oder bösartig) zu identifizieren. Bewertung der externen weißen Sauger “Tumoren” durch visuelle Beobachtung überschätzt die Prävalenz, besonders bei der Referenz-Website. Viele der erhabenen Läsionen waren nicht Neubildungen aber eher hyperplastische Läsionen. Es ist derzeit nicht bekannt, ob diese hyperplastische Läsionen bereits neoplastische sind. Umgekehrt, unterschätzt die Beobachtung der Erhabene Knötchen in der Leber deutlich die Prävalenz der Leber Tumoren. Sammlung des Gewebes für mikroskopische Pathologie war daher notwendig, das Potenzial für das delisting in angemessener Weise gerecht.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der United States Geological Survey Ökosysteme (Chesapeake Bay Umgebungen und Fischerei) und Umwelt und Gesundheit (Verunreinigungen Biologie) Programme und die West Virginia Department of Natural Resources finanziert. Verwendung von Markennamen ist nur zu Identifikationszwecken und nicht die Billigung der US-Regierung.

Materials

Folding tables Any
Folding chairs Any
Dissecting boards Any
Measuring board (in mm increments) Any
Battery powered scale (in gm) for fish weight Any
Battery powered scale (in mg) for organ weights Any
Dissecting forceps Any
Bone cutters Any
Scalpel and blades Any
Disposable gloves Any
Buckets Any
Leak-proof Nalgene bottles (250 ml) ThermoFischer Scientific 02-924-5C
Vacutainer tubes with sodium heparin ThermoFischer Scientific 02-689-6 For blood collection
Disposable  3 ml syringes with 23 gauge needle ThermoFischer Scientific 14-826-11
1 – 2ml cryovials Any Used for plasma and RNAlater samples
Invitrogen RNAlater Stabilization solution ThermoFischer Scientific AM7021
Z-Fix Formaldehyde Zinc fixative Anatech LTD SKU-174
Tricaine-S (MS-222) Syndel USA fish anesthetic
Coin Envelopes Any for otoliths
Pencils and pens Any
70% alcohol Any
Data sheets Any
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Celander, M. C. Cocktail effects on biomarker responses in fish. Aquatic Toxicology. (105 Supplement), 72-77 (2011).
  2. Liney, K. E., et al. Health effects in fish of long-term exposure to effluents from wastewater treatment works. Environmental Health Perspectives. 114, 81-89 (2006).
  3. Silva, E., Rajapakse, N., Kortenkamp, A. Something from "nothing" – eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environmental Science & Technology. 36, 1751-1756 (2002).
  4. Noyes, P. D., et al. The toxicology of climate change: environmental contaminants ina warming world. Environment International. 35, 971-986 (2009).
  5. Witeska, M., Jezierska, B. The effect of environmental factors on metal toxicity to fish. Fresenius Environmental Bulletin. 12, 824-829 (2003).
  6. Wedekind, C., Gessner, M. O., Vazquez, F., Maerki, M., Steiner, D. Elevated resource availability sufficient to turn opportunistic into virulent fish pathogens. Ecology. 91, 1251-1256 (2010).
  7. Penttinen, R., Kinnula, H., Lipponen, A., Bamford, J. K. H., Sundberg, L. R. High nutrient concentration can induce virulence factor expression and cause higher virulence in an environmentally transmitted pathogen. Microbial Ecology. 72, 955-964 (2016).
  8. Bols, N. C., Brubacher, J. L., Ganassin, R. C., Lee, L. E. J. Ecotoxicology and innate immunity in fish. Developmental & Comparative Immunology. 25, 853-873 (2001).
  9. Dunier, M., Siwicki, A. K. Effect of pesticides and other organic pollutants in the aquatic environment on immunity of fish: a review. Fish and Shellfish Immunology. 3, 423-438 (1993).
  10. Milla, S., Depiereux, S., Kestemont, P. The effects of estrogenic and androgenic endocrine disruptors on the immune system of fish: a review. Ecotoxicology. 20, 305-319 (2011).
  11. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12, 12741-12771 (2012).
  12. Eckman, D. R., et al. Biological effects-based tools for monitoring impacted surface waters in the Great Lakes: A multiagency program in support of the Great Lakes restoration initiative. Environmental Practice. 15, 409-426 (2013).
  13. Khan, M. Z., Law, F. C. P. Adverse effects of pesticides and related chemicals on enzyme and hormone systems of fish, amphibians and reptiles: A review. Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences. 42, 315-323 (2005).
  14. Wernersson, A. S., et al. The European technical report on aquatic effect-based monitoring tools under the water framework directive. Environmental Sciences Europe. 27, (2015).
  15. Bolger, T., Connolly, P. L. The selection of suitable indices for the measurement and analysis of fish condition. Journal of Fish Biology. 34, 171-182 (1989).
  16. Karr, J. R. Biological integrity: A long-neglected aspect of water resource management. Ecological Applications. 1, 66-84 (1991).
  17. Sanders, R. E., Miltner, R. J., Yoder, C. O., Rankin, E. T., Simon, I. n. T. P. The use of external deformities, erosions, lesions, and tumors (DELT anomalies) in fish assemblages for characterizing aquatic resources: a case study of seven Ohio stream. Assessing the sustainability and biological integrity of water resources using fish communities. , 225-246 (1999).
  18. Bervoets, L., et al. Bioaccumulation of micropollutants and biomarker responses in caged carp (Cyprinus carpio). Ecotoxicology and Environmental Safety. 72, 720-728 (2009).
  19. Schulte-Hermann, R. Adaptive liver growth induced by xenobiotic compounds: its nature and mechanism. Archives of Toxicology. Supplement. 2, 113-124 (1979).
  20. Slooff, W., van Kreijl, C. F., Baars, A. J. Relative liver weights and xenobiotic-metabolizing enzymes of fish from polluted surface waters in the Netherlands. Aquatic Toxicology. 4, 1-14 (1983).
  21. Brewer, S. K., Rabeni, C. F., Papoulias, D. M. Comparing histology and gonadosomatic index for determining spawning condition of small-bodied riverine fishes. Ecology of Freshwater Fish. 17, 54-58 (2003).
  22. Goede, R. W., Barton, B. A. Organismic indices and an autopsy-based assessment as health and condition of fish. American Fisheries Society Symposium. 8, 93-108 (1990).
  23. Adams, S. M., Brown, A. M., Goede, R. W. A quantitative health assessment index for rapid evaluation of fish condition in the field. Transactions of the American Fisheries Society. 122, 63-73 (1993).
  24. Kane, A. S., et al. Field sampling and necropsy examination of fish. Virginia journal of science. 50, 345-363 (1999).
  25. Yanong, R. P. E. Necropsy techniques for fish. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 12, 89-105 (2003).
  26. . American Fisheries Society (AFS) Use of Fishes in Research Committee, American Institute of Fishery Research Biologists and the Society of Ichthyologists and Herpetologists. Guidelines for the Use of Fishes in Research. , (2004).
  27. Bonar, S. A., Hubert, W. A., Willis, D. W. . Standard methods for sampling North American freshwater fishes. , (2009).
  28. Zale, A. V., Parrish, D. L., Sutton, T. M. . Fisheries Techniques, third edition. , 1009 (2013).
  29. Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, anesthesia, analgesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. , 343-360 (2009).
  30. Clark, T. D., et al. The efficacy of field techniques for obtaining and storing blood samples from fishes. Journal of Fish Biology. 795, 1322-1333 (2011).
  31. Adewoyin, A. S., Nwogoh, B. Peripheral blood film – a review. Annals of Ibadan Postgraduate Medicine. 12, 71-79 (2014).
  32. Smith, S. B., et al. Illustrated field guide for assessing external and internal anomalies in fish. Information and Technology Report USGS/BRD/ITR. 2002-007, 46 (2002).
  33. Kane, A. S. . Descriptive guide to observing fish lesions. , (2005).
  34. Rafferty, S. D., Grazio, J. . Field manual for assessing internal and external anomalies in brown bullhead (Ameiurus nebulosus). , (2018).
  35. . European Association of Fish Pathologists. Necropsy manual. , (2018).
  36. Buckmeier, D. L., Irwin, E. R., Betsill, R. K., Prentice, J. A. Validity of otoliths and pectoral spines for estimating ages of channel catfish. North American Journal of Fisheries Management. 22, 934-942 (2002).
  37. Maceina, M. J., Sammons, S. M. An evaluation of different structures to age freshwater fish from a northeastern US river. Fisheries Management and Ecology. 13, 237-242 (2006).
  38. Secor, D. H., Dean, J. M., Laban, E. H., Stevenson, D. K., Campana, S. E. Otolith removal and preparation for microstructural examination. Otolith Microstructure Examination and Analysis. 117, 19-57 (1992).
  39. Gauthier, D. T., Cartwrwight, D. D., Densmore, C. L., Blazer, V. S., Ottinger, C. A. Measurement of in vitro leucocyte mitogenesis in fish: ELISA based detection of the thymidine analogue 5′-bromo-2′-deoxyuridine. Fish and Shellfish Immunology. 14, 279-288 (2003).
  40. Zelikoff, J. T., et al. Biomarkers of immunotoxicity in fish:from the lab to the ocean. Toxicology Letters. , 325-331 (2000).
  41. Hahn, C. M., Iwanowicz, L. R., Corman, R. S., Mazik, P. M., Blazer, V. S. Transcriptome discovery in non-model wild fish species for the development of quantitiative transcript abundance assays. Comparative Biochemistry and Physiology – Part D: Genomics and Proteomics. 20, 27-40 (2016).
  42. Harms, C. A., et al. Quantitative polymerase chain reaction for transforming growth factor-B applied to a field study of fish health in Chesapeake Bay tributaries. Environmental Health Perspectives. 108, 1-6 (2000).
  43. Braden, J. B., et al. Economic benefits of remediating the Sheboygan River, Wisconsin Area of Concern. Journal of Great Lakes Research. 34, 649-660 (2008).
  44. Blazer, V. S., et al. Tumours in white suckers from Lake Michigan tributaries: pathology and prevalence. Journal of Fish Diseases. 40, 377-393 (2017).
  45. Vethaak, A. D., Jol, J. G., Pieters, J. P. F. Long-term trends in the prevalence of cancer and other major diseases among flatfish in the southeastern North Sea as indicators of changing ecosystem health. Environmental Science & Technology. 43, 2151-2158 (2009).
  46. Teubner, D., Paulus, M., Veith, M., Klein, R. Biometric parameters of the bream (Abramis brama) as indicators for long-term changes in fish health and environmental quality – data from the German ESB. Environmental Science and Pollution Research. 22, 1620-1627 (2015).
  47. Schleiger, S. L. Fish health assessment index study of four reservoirs in north-central Georgia. North American Journal of Fisheries Management. 24, 1173-1180 (2004).
  48. Sutton, R. J., Caldwell, C. A., Blazer, V. S. Health assessment of a tailwater trout fishery associated with a reduced winter flow. North American Journal of Fisheries Management. 20, 267-275 (2000).
  49. Blazer, V. S., Schmitt, C. J., Dethloff, G. M. The necropsy-based fish health assessment. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: selected methods for monitoring chemical contaminants and their effects in aquatic ecosystems. , 18-21 (2000).
  50. Schmitt, C. J. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: Environmental contaminants and their effects on fish in the Mississippi River basin. Biological Science Report USGS/BRD/BSR. 2002-0004, 241 (2002).
  51. Hinck, J. E., et al. Chemical contaminants, health indicators, and reproductive biomarker responses in fish from rivers in the Southeastern United States. Science of the Total Environment. 390, 538-557 (2008).
  52. Lang, T., et al. Diseases of dab (Limanda limanda): Analysis and assessment of data on externally visible diseases, macroscopic liver neoplasms and liver histopathology in the North Sea, Baltic Sea and off Iceland. Marine Environmental Research. 124, 61-69 (2017).

Tags

NecropsyWild Fish Health AssessmentFish HealthStressorsAbnormalitiesBlood CollectionHistopathologyOtolithImmune FunctionGene ExpressionStandardized EvaluationFish Necropsy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Blazer, V. S., Walsh, H. L., Braham, R. P., Smith, C. Necropsy-based Wild Fish Health Assessment. J. Vis. Exp. (139), e57946, doi:10.3791/57946 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image