JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Характеристика человека Моноцит подмножеств по цельной крови Cytometry анализ потока

Published: October 17, 2018
doi:
10.3791/57941
, , , , ,
1Department of Surgery, Vascular Biology Research Centre,Westmead Hospital, 2Westmead Clinical School, Department of Surgery,The University of Sydney, 3Westmead Research Hub,Westmead Institute for Medical Research, 4Institute for Clinical Pathology and Medical Research,Westmead Hospital

Summary

Здесь мы представляем протокол для характеризующие Моноцит подмножеств подачей cytometry цельной крови. Это включает в себя описанием как ворота подмножества и оценить их выражение поверхностных маркеров и дает пример оценки выражения (воспалительных) М1 и м2 маркеры (противовоспалительное).

Abstract

Моноциты являются важнейшими действующими лицами в различных воспалительных заболеваниях и изменения этих ячеек, включая их подмножество пропорции и функции, может иметь патологическое значение. Идеальный способ для изучения изменения моноциты является цельной крови: проточная цитометрия, как минимальной обработки образцов этим методом ограничивает активации артефакты клеток. Однако многие применяются различные подходы для ворот Моноцит подмножеств, ведущих к несовместимым идентификации подмножеств между исследованиями. Здесь мы показываем методом проточной цитометрии цельной крови для выявления и характеризуют человека Моноцит подмножеств (классический, промежуточные и неклассические). Мы приводим как подготовить образцов крови для проточной цитометрии, ворота подмножеств (обеспечение загрязняющих клетки были удалены) и определить выражение подмножество Моноцит поверхностных маркеров — в этом примере M1 и M2 маркеров. Этот протокол может распространяться на другие исследования, которые требуют стробирования стандартный метод для оценки Моноцит подмножество пропорции и Моноцит подмножество выражение других функциональных маркеров.

Introduction

Моноциты являются тип белых кровяных клеток, которые играют важную роль в поощрении и урегулировании воспаления. Существует три основных подмножество моноциты признанных, классическая (~ 85%), средний (~ 5%) и неклассические моноцитов (~ 10%), которые характеризуются их уровень Кластер дифференцировки (CD) 14 и CD16 выражение1. Пропорции Моноцит подмножеств могут отличаться с наличием болезней, например увеличение доли интермедиатов в различных воспалительных заболеваниях2,3 , включая сердечно-сосудистые заболевания, где уровень промежуточных является связанные с клинических явлений4,5. Кроме того в условиях заболевания, моноциты можно также пройти функциональные изменения, со многими изменениями, обнаруживаемых разница в поверхности маркер выражения6,7. Одним из таких примеров является Моноцит M1-наклон, увеличение маркеров, связанных с M1 макрофагов, который наблюдается в сердечно-сосудистых заболеваний и диабета, ожирение, метаболический синдром7,8,9 , 10.

Несмотря на популярность проточной цитометрии для оценки доли подмножество Моноцит и функции существует значительная изменчивость в пробоподготовки и подмножество стробирования между исследованиями, которые делает его трудным для сравнения результатов между такими исследованиями. Главное не существует консенсуса в демаркации Моноцит подмножеств, но стандартизированный подход необходим ввиду клиническую значимость изменений в пропорциях подмножества в нескольких заболеваний. Часть трудностей в стробирования проистекает из того факта, что моноциты дифференцировать от классической через промежуточные для неклассических подмножество11 и как таковой, моноциты существует как непрерывный спектр, а не отдельных популяций12 . Интересно, что Завада et al. показал, что использование либо прямоугольной или трапециевидные стробирования промежуточных подмножества, оба в результате подмножество выше промежуточных, предсказал сердечно конечной13. Это подчеркивает, что, по крайней мере для расчета пропорции, ключевым вопросом применение последовательной стробирования стратегии между различными образцы (исследования), вместо того, чтобы окончательно различать подмножеств. Хотя окончательное стробирования может быть более важным при оценке функции, изменения в маркер выражения между подмножествами добавочный12,14, и таким образом снова, последовательность в стробирования возможно является ключевым. Таким образом необходим объективный стробирования метод, который можно воспроизвести раскладками Моноцит подмножеств между различными образцами. Цель метода, представленные здесь заключается в ворота Моноцит подмножества с четкое объяснение и обоснование метода стробирования занятых и оценить подмножества для поверхности маркер выражения, обеспечивая тем самым метод, который позволяет исследователям иметь уверенность в использовании этой техники при оценке различных образцов.

Protocol

Это исследование был одобрен Комитетом WSLHD человеческой этики научных исследований (HREC) (утверждение АС Красного HREC/15/WMEAD/289). 1. Пробоподготовка для цельной крови: проточная цитометрия Примечание: Как кровь человека потенциально инфекционные, пример настройки должны выполняться в биологической Худ. Сбор проб крови от участников в 3 мл этилена диамин тетра уксусной кислоты (ЭДТА) трубы. Определите количество белых кровяных телец (Лейкоцитов), с помощью гематологический анализатор или Горяева. Разбавляют-фосфатный буфер (PBS) (рН ~ 7,4) для регулировки концентрации до ~ 5 x 106 WBC/мл. Подготовить достаточно мастер смесь для количество трубок (например, для 14 труб, подготовить 16 x Мастер микс) путем объединения 16 x объем 50 мкл крови, 0,75 мкл анти CD14-V450, 0.5 мкл анти CD16-APC и 0,625 мкл анти-HLA-DR-PerCP. Вортекс и пипетки 51,9 мкл смеси в каждую пробирку (Таблица 1).Примечание: Антитела должны быть титруют определить оптимальные концентрации окрашивания для флуоресцентные антитела, которые используются. Добавить маркер поверхности (M1 и M2 или изотипа управления, фикоэритрин (PE) помечены) антител (например, согласно таблице 2) и PE помечены маркерами для Т-клетки (CD3), лимфоцитов (CD19), нейтрофилов (CD66b), и природные убийца (НК) клетки (CD56) (Таблица 3). Вортекс и Инкубируйте 30 мин., 4 ° C в темноте.Примечание: Маркеры для лимфоциты, нейтрофилы и НК-клеток включены только для проверки метода стробирования. 250 мкл раствора комбинированных красных кровяных клеток лизис/WBC крепления, вихревой мягко немедленно и проинкубируйте втечение 10 мин в темноте при 4 ° C. 250 мкл PBS и спин клеток вниз, на 260 x g 10 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант, вновь приостановить клетки в 300 мкл 1% формальдегида.Примечание: Формальдегид токсичных. Используйте перчатки из нитрила и в зонта. Хранить при 4 ° C, защищенном от света, до тех пор, пока выполняется анализ.Примечание: Анализ потока рекомендуется быть сделано в течение 48 ч пробоподготовки. 2. проточной цитометрии Проверка потока цитометр журнал для обеспечения сотрудников Фонда выполнили проверок контроля качества.Примечание: Обеспечить согласованность между анализа, инструмент контроля качества и поддержание постоянной интенсивностью флюоресценции цели с помощью управления бусы рекомендуется. Чтобы настроить поток цитометрии эксперимента, нажмите на «новый эксперимент, то «новый образец» и «новые трубки» для добавления трубы. Выберите двумерных участков, нажав на иконку и используйте выпадающее меню для выбора Параметры оси. Обеспечить включение CD16/CD14 участок и участок отображения детектор наряду с время для наблюдения за приобретение. Вставить трубку и нажмите кнопку «Получить». Проверьте настройки напряжения инструмент обеспечения того, чтобы сигналы детектора не зашкаливать. Соблюдайте клеток, входящих в ворота моноцитов CD14/CD16 участка. Порога запись 5000 событий для классической Моноцит ворот и нажмите на «Рекорд». Продолжить запись данных для остальных трубок. После того, как был записан данных для всех труб, экспорт потока данных в виде файлов .fcs для анализа.Примечание: Для обеспечения точности, один цвет компенсации элементы управления должны быть записаны. Матрицу компенсации можно рассчитать и применяется к данным до анализа для учета спектральных разлива над15,16. 3. Моноцит стробирования Открытые файлы в программное обеспечение для анализа. Дважды щелкните имя трубки и выберите параметры из выпадающих меню чтобы визуализировать клетки на площади вперед разброс FSC (A) / вперед высоты точечная FSC(H). Создание исключения ворота Дуплет, нажав на пиктограмму инструмента ворота полигона и ограждающих клетки как (рис. 1A). Выделите ячейки, закрытый (двойным щелчком на жилой район) и на новом дисплее поле скорректировать выпадающем меню параметров для отображения ячеек на FSC (A) / стороне разброс SSC(A) участок. Нажмите на иконку прямоугольные ворота и щедро выберите Моноцит населения на основе вперед и боковых разброс свойств исключить большинство лимфоцитов, НК-клеток и гранулоцитов (рис. 1B). Выделите ячейки, закрытом и отобразить на участке CD14/CD16, выбрав параметры с помощью выпадающих меню. Нажмите на полигон ворота для выбора моноцитов, основанные на их характеристика «┐» форму (рис. 1 c). Выделите ячейки, закрытом и отображать моноциты на участке CD16/HLA-DR, используя выпадающее меню для выбора параметров. Нажмите на полигон ворота для выбора HLA-DR позитивных клеток и исключить любые оставшиеся NK клеток и нейтрофилы17 (рис. 1 d). Выделите ячейки, закрытом и отображать HLA-DR позитивные клетки на участке CD14/HLA-DR, используя выпадающее меню для выбора параметров. Нажмите на полигон ворота и нарисуйте ворота для исключения HLA-DR высокой/CD14 низкой клетки (клетки B Экспресс высокий уровень HLA-DR, но не CD14) (Рисунок 1E).Примечание: клетки B заражение может произойти и поэтому должны быть расследованы. Если неклассических населения в Рисунок 1 c не отличается от клетки слева, загрязнение, вероятно. Шаг 3.5 можно пропустить, если клетки B не перекрываются с неклассической моноцитов. Выделите ячейки, закрытом и использовать выпадающее меню для отображения их на участке CD16/CD14. Параметры печати выберите «Зебра сюжет», которая позволит Моноцит подмножество ворота привлекается для определения подмножества пропорции (Рисунок 1F).Примечание: если зебра печати недоступна на анализ программного обеспечения, псевдо цвет (гладкие) или контурное изображение может быть подходящим. Нажмите на иконку прямоугольные ворота и выберите Классический моноцитов, нарисовав приблизительно прямоугольная ворота вокруг населения высокий/CD16 низкий, классическая Моноцит CD14. В разделе «Отображение» выберите «Показать Медиан» для отображения средний флуоресценции интенсивности для классической моноцитов. Отрегулируйте ворота, таким образом, что население имеет равное распределение от медианы на левый и правый, охватывающих все ячейки слева. Выберите промежуточный населения путем рисования прямоугольных ворота, которая охватывает ячейки справа от ворот классической. Настроить в нижней части ворот исключить неклассических клетки выравнивая ворота с нижней части концентрических кругов, которые полностью находятся в классической Моноцит ворота, который гарантирует, что промежуточные подмножество имеет выражение CD14, сопоставимые с основные классические населения в соответствии с текущей номенклатуры. Ворота и неклассические подмножество, нарисовав прямоугольник от нижнего края и промежуточных подмножество, выбор всех ячеек в нижней части населения (Рисунок 1F). В разделе «Отображение» выберите «Показать ворота частоты» для определения доли каждой Моноцит подмножества. 4. Проверка стробирования метод Чтобы определить, являются ли потенциально загрязняющие типы клеток эффективно закрытого out, сначала определить различных клеточных популяций с антителами против Т-клетки (CD3), лимфоцитов (CD19), нейтрофилов (CD66b) и НК-клеток (CD56) (Рисунок 2).Примечание: Здесь T клетки и нейтрофилов не сидят близко к «┐» форма моноцитов и являются воротами, в Рисунок 1 c. Убедитесь, что в шаге 3.4 (рис. 1 d) удаляются клетки и клетки B удаляются в шаге 3.5 (Рисунок 1E), как показано на рисунке 3. Если клетки или клетки B, не закрытый из подрегулировать ворота. 5. Фенотипические Моноцит маркер выражения Выделите ячейки от каждого Моноцит подмножества. Измените параметры раскрывающегося списка для создания гистограммы для каждого подмножества Моноцит (Рисунок 1F) отображение каждого маркера и его соответствия изотипа (рис. 4). Вычислите степень выражения каждого маркера (медиана или среднее геометрическое) по сравнению с контролем соответствующих изотипа.

Representative Results

Моноцит стробирования стратегии и анализа цитометрия потоков используется здесь (рис. 1) успешно условным Моноцит подмножеств и показал их относительные пропорции. Пропорции (для примера) рассчитывались как classicals 88,1%, 4.33% промежуточных и 7,49% не classicals. Эти подмножества ворота не были загрязнены с лимфоцитов, Т-клетки, нейтрофилы или НК-клеток, которые было подтверждено с маркерами CD19, CD3, CD56 и CD66b, соответственно. Оценивая относительное положение других групп населения, становится ясно, что Т-клетки и нейтрофилы подпадают также Моноцит «┐» формы на участке CD16/CD14 (рисунок 2A и 2D). Однако НК-клетки и клетки B населения пересекается с неклассической Моноцит населения (Рисунок 2B и 2 C). Шаги стробирования стратегии (рис. 1 d и 1E) были подтверждены исключить НК-клеток (рис. 3A) и B клеток (рис. 3B). Хотя популяции клеток B включена небольшая часть неклассических моноцитов, сумма была незначительной. Закрытого подмножеств, степень, в которой они выразили различные поверхности маркеры, M1 (CD64, CD86 и CD120b) и м2 (CD163 CD11b и CD93), была проведена оценка. Маркеры показали положительное выражение, по сравнению с их соответствующих элементов управления изотипа, как видно на сдвиг гистограммы (рис. 4). Медиана маркеров был больше, чем изотипа элементов управления. Применение этой стратегии стробирования образец крови, которая была разделена на четыре трубы, витражи и проанализированы отдельно, сопоставимые результаты урожайности между трубами (Таблица 4). Рисунок 1: представитель Моноцит стробирования стратегия в целом человеческой крови. (A) FSC(A) против FSC(H) участок: стробирования клетки, которые имеют равные площади и высоты, удалив таким образом сгустки (более FSC(A) по сравнению с FSC(H)) и мусора (очень низкая FSC) K = 1000. (B) FSC(A) против SSC(A) участок: широкий выбор моноцитов, основываясь на их свойствах SSC/FSC. (C) CD16 против CD14 участок: стробирования выбрать моноциты основанный на их характеристика «┐» форму. (D) CD16 против HLA-DR участок: шлюзовые для выбора HLA-DR позитивных клеток и удаления НК-клеток. (E) CD14 против HLA-DR: стробирования исключить клетки B (низкий высокий/CD14 HLA-DR) из моноцитов. (F) выбран моноцитов, раскрывающимся на CD16 против CD14 сюжет для ворот Моноцит подмножеств. Для A-F цвет представляет плотность клеток с синим и зеленым, указанием низкой плотности, красный и оранжевый, указывающее высокой плотности и оранжевый, указывающее средней плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: Проверка стробирования стратегии путем выявления потенциально загрязнять клетки. Потенциально загрязняющие клетки обозначены маркерами (A) Т-клетки (CD3), (B) B клетки (CD19), (C) НК-клеток (CD56) и (D) нейтрофилов (CD66b). На левой боковой панели показывают идентификации каждого населения после стробирования согласно рис. 1A и 1B, с цветом, представляющая плотность клеток от высокой (красный), низким (синий). Правая сторона панели показывают каждой популяции клеток (синий) накладывается на участке CD16/CD14 окончательный Моноцит раскрыть близость этих групп населения к моноцитов (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: подтверждение, что стробирования шаги удаления загрязняющих клеток. Тепловые карты, показывающие степень выражения от высокого (красный) до низкого (синий) CD56 (A) и (B) CD19. Шлюзовые шаги успешно исключить клетки с высоким CD56 (NK-клетки) и высокой CD19 (B-клетки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4: выражение Моноцит М1 (CD120b) и м2 маркеров (CD93). Сглаженные гистограммы Моноцит M1 и M2 маркер выражения (синий) показаны явный сдвиг от изотипа (красный) (A) classicals, промежуточных (B) и (C) не classicals. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Антитела Объем (50 мкл крови) Объем (16 x) 800 мкл крови CD14 – V450 0,75 МКЛ 12 МКЛ CD16 – APC 0.5 МКЛ 8 МКЛ HLA-DR-PerCP 0,625 МКЛ 10 МКЛ Таблица 1: Антитела для цельной крови поток и основной микс. Трубка PE антитела Код Isotype матч Складе концентрация Рабочий объем 1 IgG1 BD (555749) NA 1,0 мкг/20 мкл 0,625 МКЛ 2 CD163 BD (556018) BD IgG1 0,125 мкг/20 мкл 5 МКЛ 3 CD64 BD (558592) BD IgG1 0,06 мкг/20µL 10 МКЛ 4 IgG1 BD (555749) NA 1,0 мкг/20 мкл 1,25 МКЛ 5 CD86 BD (555658) BD IgG1 1,0 мкг/20 мкл 1,25 МКЛ 6 CD11b BD (561001) BD IgG1 1,0 мкг/20 мкл 1,25 МКЛ 7 IgG2a R & D (IC003P) NA 25 мкг/мл 5 МКЛ 8 CD120b (TNFRII) R & D (FAB226P) R & D IgG2a 25 мкг/мл 5 МКЛ 9 IgG1 BL (400112) NA 0.2 мг/мл 2.5 МКЛ 10 CD93 BL (336108) BL IgG1 50 мкг/мл 1,25 МКЛ Таблица 2: M1/M2-PE флюрохром помечены моноклональных антител для потока цельной крови. Трубка Антитела Рабочий объем 11 CD3 5 МКЛ 12 CD19 5 МКЛ 13 CD66b 1,25 МКЛ 14 CD56 5 МКЛ Таблица 3: PE флюрохром помечены моноклональных антител для лимфоциты (Т-клетки, клетки B), нейтрофилов и НК-клеток. Трубка % Классика % Средний Неклассические % 1 84.3 5.11 10.1 2 84,2 5.05 10.5 3 84.3 5.03 10.7 4 81,6 5.03 12.1 Таблица 4: Моноцит подмножество пропорции от одной крови витражи и проанализированы отдельно.

Discussion

Цельной крови проточной цитометрии является идеальный подход для изучения моноцитов, как клетки рассматриваются в условиях, приближенных к их физиологической микроокружения, обеспечивая понимание их роли в инфекции и воспалительных процессов. Кроме того использование свежих (т.е., необработанные) образцы крови сводит к минимуму изменения или преобразования клеток, которые могут произойти из-за хранения или обработки18,19, таких, как известно, происходят с замораживания размораживания моноцитов 20. подготовка оперативного образца рекомендуется как некоторые маркеры upregulated если образцы хранятся при комнатной температуре до переработке19. Титрование были определены оптимальные концентрации М1 и м2 маркеров, и это должно быть сделано для любых новых антитела ограничить неспецифической привязки, при одновременном обеспечении степени сдвиг объясняется выражение антигена и не ограничивается отсутствием антител. Удаление красных кровяных клеток и фиксации белых кровяных клеток с лизис решение является важным шагом в этом протоколе, как наличие красных кровяных клеток может мешать потока цитометрии21,22. Обратите внимание, что хотя некоторые лизис решения совместимы с без мыть окрашивание, яснее населения проявляется в наших руках, когда мыть шаг используется.

Правильную настройку проточный цитометр также имеет решающее значение при сравнении выражение Моноцит маркеров. Мы рекомендуем, что исследователи поддерживать интенсивностью флюоресценции последовательного целевого управления бисера и выполнять контроль качества на документа, который должен использоваться для обеспечения что последовательные результаты через различные образцы работать на разные дни. В дополнение к этому изотипа элементы управления используются для оказания помощи в толковании любой неспецифичный фонового сигнала, создаваемые неспецифическими антитела связывая. Моноциты имеют высокий уровень Fc рецепторов11 и поэтому подвержены неспецифической привязки. Следует отметить уровень неспецифической привязки отличается для разных подмножеств, и таким образом использование isotype управления становится важным при сравнении степень маркер выражения между подмножествами.

Другим важным критерием для рассмотрения является стробирования шаги работают. Некоторые исследования показывают, что важно привлечь туго ворота вокруг Моноцит населения в FSC(A)/SSC(A) участок избавиться от большинства не monocytic CD16 позитивные клетки23,24,25, но это может привести к потере некоторых Моноциты как non Моноцит клетки могут перекрываться с моноциты на FSC/SSC участки26. Скорее чтобы исключить любые другие клетки крови, которые могут загрязнить моноцитов, включение маркера третьего моноцитов CD14 и CD16, является важным26,27. По этой причине HLA-DR часто используется и является идеальным, поскольку он не выражен NK клеток или нейтрофилов17,28. Хотя лимфоциты (В-клетки и Т-клетки) могут выразить HLA-DR, они отличаются от моноцитов в отношении CD14 выражение. В то время как HLA-DR является идеальным третий маркер, CD86 также было рекомендовано5,27,29 , но здесь не используется как это также маркер M1 и таким образом была оценена степень его выражения на Моноцит подмножеств.

Проверка стробирования стратегия используется имеет решающее значение. В то время как клетки известны перекрываются с не classicals, если они не являются воротами из28, мы замечаем, что клетки B также могут перекрываться с не classicals (Рисунок 2B); является ли это случай в других исследованиях может зависеть от флюрохром выбор, инструмент конфигурации, чувствительности или даже болезнь условие рассматривается. Здесь, перекрывающиеся B клеток показали высокая экспрессия HLA-DR и были не закрытый, выбор HLA-DR клеток в Рисунок 1 d. Скорее, чтобы удалить клетки B мы использовали дополнительный участок CD14 / HLA-DR, где клетки B отделить от не classicals вследствие их выше HLA-DR и низким CD14 выражение.

Есть также много различных способов, в которых ворота для моноцитов, сами нарисовали в литературе; к ним относятся квадратами (подмножества разделяются квадрант маркеры) и прямоугольной или трапеции коробки13 (с отдельным коробки для каждого подмножества), который Кроме того отличают в их размещения, разграничение где заканчивается одно подмножество и начинается другой. Эти различия могут отражать тот факт, что моноциты существует континуум клеток, дифференцировать от классического к неклассической, а четко населения. Однако потому что различия в методах для определения подмножества, сами может привести к различиям в пропорциях подмножество вычисляемых Моноцит, становится важным, что метод стробирования достаточно объективный, а не субъективным, как это будет Сделайте этот метод более надежных и воспроизводимых. Некоторые исследования использовать элемент изотипа для окрашенных CD16 + для определения границы между классической и промежуточных подмножеств30. С другой стороны чтобы определить разделение интермедиаты и не classicals, было предложено, что светотеневой границы может быть вертикальный или наклонный, с выбором до следователей, условии, что она должна быть воспроизводимой, но прямоугольные ворота было рекомендовано для облегчения сопоставлений между исследования13,30,31. Здесь повышение объективности был получен путем печати данных на участке Зебра и применяя объективный визуальные правила, потому что Зебра участков обеспечивают дополнительные визуализации кий, смешивая цвета градиента для каждой равной вероятностью бен над традиционными контурное. Правая граница классической подмножества было обращено таким образом, чтобы население было равномерно распределены вокруг средней населения. Разделение между интермедиатов и не classicals также были стандартизированы, имея базы интермедиатов выровнять с нижней части концентрических кругов в рамках классической населения (т.е., промежуточные населения четко выражает высокий уровень CD14, согласно стандартной номенклатуры1).

Хотя некоторые исследования показали использования дополнительных маркеров, такие как C-C хемокиновых рецепторов типа 2 (CCR2) или 6-сульфогруппу LacNAc (SLAN) для получения успешного перечисление моноцитов и выявить их клиническое значение32,33 , в наших руках уровень выражения многих Моноцит функциональных маркеров широко варьируется от лица14. Такая вариация может ограничить полезность этих маркеров для определения подмножества на основе их выражения. Автоматизированной вычислительной подходы также были использованы для визуализации и кластер Моноцит подмножеств, включая визуальные интерактивные стохастических встраивание сосед (viSNE), t распределенных стохастика сосед встраивания (tSNE) или прогрессирования Spanning дерево Анализ плотности нормированный события (лопата)34,35, который может обеспечить визуальное представление ячеек, основанных на наборе используется несколько маркеров. В то время, как это было показано для повышения точности стробирования стратегии Моноцит подмножество классификации, признано, что недостатком является количество антител (и соответствующих Флюорофор каналов). Его полезность будет зависеть на вопросы; Дополнительные сложности не могут быть оправданными, например, в исследованиях перечисления.

Моноциты, закрытый с нашей техникой Показать пропорции согласно литературе и можно легко определить выражение поверхностных маркеров на три подгруппы. В целом методика и методология, объяснил здесь обеспечивает стандартизированный и простой метод перечисления Моноцит подмножество пропорции и оценки выражения поверхности маркер, который может быть расширен для включения других маркеров, а, тем самым проверка их функциональной роли в различных условиях.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Проточной цитометрии была исполнена в поток цитометрии основного объекта, который поддерживается путем Уэстмид института исследований, Westmead институт медицинских исследований концентратор, рака Нового Южного Уэльса и национального здравоохранения и медицинских исследований Совета. Это исследование было поддержано клинических исследований химии и Фонд образования.

Materials

BD vacutainer blood collection set Becton Dickinson 367286
BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml Becton Dickinson 7128959
Phospahate Buffered Saline (PBS) Lonza 17-516F
5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style) Invitro technologies 352054
V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] BD Biosciences 560349
APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] Abcam Australia ab140477
Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] BioLegend 307628
PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] BD Biosciences 555749 Lot # 4283901
PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] BD Biosciences 556018 Lot # 2335626
PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] BD Biosciences 558592 Lot # 36768
PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] BD Biosciences 555658 Lot # 3109766
PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] BD Biosciences 561001 Lot # 3228959
PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] R&D Systems IC003P Lot # 1212031
PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] R&D Systems FAB226P Lot # 612051
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] BioLegend 400112 Lot # B220359
PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] BioLegend 336107 Lot # B143544
PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] BD Biosciences 347347 Lot # 3010929
PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] BD Biosciences 561741 Lot # 2307721
PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] BD Biosciences 561903 Lot # 3011796
PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] BioLegend 305105 Lot # B154037
OptiLyse C Beckman Coulter A11895
Formaldehyde solution 37% Sigma F1635
BD FACSCanto II Flow Cytometer BD Biosciences
Automatic haematology analyser, XT-1800i Sysmex
Centrifuge GS-6R Beckman
Flowjo software v10.0.7 Tree Star Inc
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  2. Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).
  3. Wildgruber, M., et al. The "Intermediate" CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans. Scientific Reports. 6, 39483 (2016).
  4. Heine, G. H., et al. Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease. Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).
  5. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography. Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).
  6. Bories, G., et al. Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects. Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).
  7. Fadini, G. P., et al. An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy. Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).
  8. Satoh, N., et al. Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone. Diabetes Care. 33 (1), 7 (2010).
  9. Chen, X., Devaraj, S. Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).
  10. Williams, H., et al. Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease. International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
  12. Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. Phenotypic characterization of human intermediate monocytes. Frontiers in Immunology. 4, 339 (2013).
  13. Zawada, A. M., et al. Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study. Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).
  14. Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels. Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).
  15. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).
  16. Szaloki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).
  17. Abeles, R. D., et al. CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure. Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).
  18. Mukherjee, R., et al. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous. Scientific Reports. 5, 13886 (2015).
  19. Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).
  20. Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).
  21. Dagur, P. K., McCoy, J. P., Robinson, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Current protocols in cytometry. 73, (2015).
  22. Einwallner, E., et al. Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts. Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).
  23. Tsujioka, H., et al. Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction. Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).
  24. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity. Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).
  25. Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood. Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).
  26. Zawada, A. M., et al. Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease. Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).
  27. Zawada, A. M., et al. SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset. Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).
  28. Heimbeck, I., et al. Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females. Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).
  29. Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
  30. Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets. Frontiers in Immunology. 4, 23 (2013).
  31. Weber, C., et al. Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups “Atherosclerosis & Vascular Biology” and “Thrombosis”. Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).
  32. Shantsila, E., et al. Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).
  33. Hofer, T. P., et al. slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation. Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).
  34. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. 29, 886 (2011).
  35. Thomas, G. D., et al. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).

Tags

Monocyte SubsetsFlow CytometryWhole Blood AnalysisCD14CD16HLA-DRM1 And M2 MarkersGatingRed Blood Cell LysisWhite Blood Cell FixationSample PreparationFlow Cytometry SetupQuality Control

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Marimuthu, R., Francis, H., Dervish, S., Li, S. C., Medbury, H., Williams, H. Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (140), e57941, doi:10.3791/57941 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image