כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור אפיון מונוציט קבוצות משנה על-ידי cytometry זרימה של דם מלא. זה כולל חלוקה לרמות שער תת-קבוצות של להעריך את הבעות פניהם של סמני פני שטח נותן דוגמה ההערכה של התבטאות (דלקתיות) M1 ו- M2 סמנים (אנטי דלקתיות).
ומונוציטים אנו רותמים הפרעות דלקתיות שונות ויש שינויים לתאים אלו, כולל ערכה הפרופורציות שלהם ואת פונקציות, משמעות פתולוגית. שיטה אידיאלית עבור בחינת שינויים ל ומונוציטים הוא cytometry זרימה של דם מלא כמו טיפול מינימלי של דגימות בשיטה זו מגבילה את הפעלת תא מלאכותית. עם זאת, גישות שונות רבות נלקחים לשער תת-קבוצות מונוציט המוביל זיהוי לא עקבי של ערכות המשנה בין מחקרים. כאן נדגים שיטה באמצעות cytometry זרימה של דם מלא כדי לזהות ולאפיין מונוציט האנושי קבוצות משנה (קלאסית, ביניים וקלאסי). אנחנו המתאר כיצד להכין את דגימות הדם עבור cytometry זרימה, שער של ערכות המשנה (להבטיח תאים מזהמים הוסרו) וכן לקבוע מונוציט ביטוי ערכה של סמני פני השטח – זו דוגמה M1 ו M2 סמנים. פרוטוקול זה ניתן להרחיב מחקרים אחרים הדורשים המגביל שיטה סטנדרטית להערכת מונוציט משנה הפרופורציות ואת מונוציט ביטוי ערכה של סמנים אחרים פונקציונלי.
ומונוציטים הן סוג של תאי דם לבנים, אשר ממלאים תפקיד מרכזי קידום של פתרון לדלקת. ישנן שלוש קבוצות משנה הראשי של monocytes שזוהה, קלאסית (~ 85%), בינוני (~ 5%) ומונוציטים (~ 10%)-קלאסי, אשר מאופיינים על ידי רמת אשכול של בידול (CD) 14 ו- ביטוי CD161. הפרופורציות של קבוצות משנה מונוציט יכולים להיות שונים עם הנוכחות של מחלה, כגון שיעור מוגבר ביניים שונים המצבים הדלקתיים2,3 כולל מחלות לב וכלי דם, איפה לרמת ביניים הקשורים אירועים קליניים4,5. יתר על כן, בתנאים המחלה, ומונוציטים יכול גם לעבור שינויים פונקציונליים, עם שינויים רבים ניתן לגילוי על ידי הבדל סמן משטח ביטוי6,7. דוגמה אחת כזו היא מונוציט M1-הטייה עלייה בסמני המשויך M1 מקרופאגים, אשר נצפתה למחלות לב וכלי דם, סוכרת, השמנת יתר, תסמונת מטבולית-7,–8,–9 , 10.
למרות הפופולריות של cytometry זרימה כדי להעריך מונוציט משנה פרופורציה ותפקוד, יש השתנות ניכר הכנת הדוגמא, ערכה gating בין מחקרים שקשה להשוות ממצאים בין מחקרים כאלה. חשוב לציין, יש הסכמה כללית להבחנה בין קבוצות משנה מונוציט, עדיין בגישה סטנדרטית היא חיונית נותן את המשמעות הקלינית של שינויים בפרופורציות ערכה מספר מחלות. חלק מהקושי gating נובע מהעובדה ומונוציטים להבדיל מהספרייה הקלסית דרך הביניים ערכה-קלאסי11 ו ככזה, ומונוציטים קיים ספקטרום רציף ולא אוכלוסיות נפרדות12 . מעניין, Zawada. et al. הראו כי שימוש גם מלבני או בצורת טרפז gating קבוצת ביניים המשנה, זיכו בקבוצת משנה ביניים גבוה אשר חזה על הקצה של הלב וכלי הדם13. זה מדגיש, לפחות לחישוב הפרופורציות, נושא המפתח הוא יישום אסטרטגיה המגביל עקבית בין שונים דגימות (לימודים), במקום ניסיון להפלות באופן מוחלט בין קבוצות משנה. בעוד gating סופית עשוי להיות חשוב יותר כאשר הערכת פונקציה, השינוי בביטוי סמן בין קבוצות משנה הוא מצטבר12,14, ובכך שוב, עקביות gating אולי מפתח. וככזה, נדרש אובייקטיבית gating שיטת reproducibly apportions תת-קבוצות מונוציט בין מדגמים שונים. מטרת השיטה המובאת כאן היא לשער קבוצות משנה מונוציט עם הסבר ברור ואת ההצדקה הטכניקה המגביל המועסקים ולהעריך את ערכות המשנה להבעה סמן משטח, ובכך מספק שיטה אשר מאפשר לחוקרים יש אמון השימוש בטכניקה זו כאשר הערכת מדגמים שונים.
Cytometry זרימה של דם מלא היא גישה אידיאלי ללמוד ומונוציטים כמו התאים נבדקים בתנאי קרוב microenvironment הפיזיולוגיים שלהם לספק תובנה על השתתפותם ב זיהום, במצבים דלקתיים. יתר על כן, השימוש טריים (קרי, לא מעובדת) דגימות דם ממזער את שינויים או העתקות התא יכול להתרחש עקב אחסון או טיפול18,19, כגון אלה עלולה להתרחש עם ומונוציטים הקרת ההקפאה 20. הכנת הדוגמא בקש מומלץ כמו כמה סימונים upregulated אם הדגימות מוחזקים בטמפרטורת החדר לפני עיבוד19. ריכוז אופטימלי של סמני M1 ו- M2 נקבעו על ידי טיטור, יש לבצע פעולה זו עבור כל נוגדן חדש להגבלת מחייב שאינם ספציפיים תוך הבטחת כי מידת shift עקב ביטוי אנטיגן, אינו מוגבל על ידי חוסר של נוגדן. ההסרה של כדוריות דם אדומות, קיבוע של כדוריות הדם הלבנות עם פירוק פתרון הוא שלב חשוב של פרוטוקול זה כמו הנוכחות של תאי דם אדומים יכולים להפריע לזרום cytometry21,22. שימו לב כי בעוד כמה פתרונות פירוק תואמים לא-השטיפה מכתים, ברור יותר אוכלוסיות ניכרות בידיים שלנו כאשר צעד שטיפת משמש.
התקנה נכונה של cytometer זרימת חיוני גם בהשוואת ביטוי מונוציט סמנים. אנו ממליצים כי החוקרים לשמור על עוצמות קרינה פלואורסצנטית היעד עקבית של שליטה חרוזים ולבצע בקרת איכות על הכלי שישמש כדי לספק תוצאות עקביות מדגמים שונים להפעיל בימים שונים. בנוסף לכך, isotype פקדים משמשים כדי לסייע לפרש כל אות שאינם ספציפיים הרקע שנוצר על-ידי איגוד נוגדן שאינם ספציפיים. ומונוציטים יש רמות גבוהות של Fc קולטנים11 , ולכן הם נוטים לא ספציפית מחייבת. ראוי לציין, הרמה של איגוד שאינם ספציפיים שונה עבור קבוצות משנה שונים, לכן השימוש של פקד isotype הופכת לחשובה בעת השוואת מידת סמן ביטוי בין קבוצות משנה.
קריטריון חשוב נוסף כדי להיחשב היא המדרגות המגביל המועסקים. מחקרים מראים כי זה חיוני כדי לצייר שער חזק סביב מונוציט באוכלוסיית FSC(A)/SSC(A) עלילה להיפטר רוב הלא-monocytic CD16 תאים חיוביים23,24,25, אבל זה עשוי להוביל לאובדן של חלק ומונוציטים כפי הלא מונוציט תאים יכולים לחפוף עם ומונוציטים-FSC/האס חלקות26. במקום זאת, כדי לא לכלול כל תאי דם אחרים עשויים לזהם את ומונוציטים, ההכללה של סמן מונוציט השלישי בנוסף CD14 ו CD16, הוא חיוני26,27. מסיבה זו, ד ר הלע משמש לעתים קרובות והוא אידיאלי לידי זה הוא לא NK תאים או נויטרופילים17,28. למרות לימפוציטים (תאי B ותאי T) עשוי לבטא ד ר הלע, הם שונים ומונוציטים בהקשר לביטוי CD14. בעוד הלע-ד ר הוא סמן האידיאלי שלישית, CD86 יש גם הומלצו27,5,29 אך לא שימש פה זה גם סמן M1, ובכך את מידת ההבעה על קבוצות משנה מונוציט הוערך.
אימות של האסטרטגיה המגביל המשמש היא בעלת חשיבות מכרעת. בעוד תאי NK ידועים כדי חפיפה עם הלא-classicals אם הם הן לא פיקוח28, אנו מבחינים כי בתאי B יכול לחפוף גם הלא-classicals (איור 2B); אם זה המקרה במחקרים אחרים תלויים הבחירה fluorochrome, תצורת המכשיר, גלאי רגישות או אפילו מצב המחלה נבחנת. . כאן, B חופפים תאים הראה ביטוי גבוהה של ד ר הלע ולא היו לא פיקוח בחוץ על-ידי בחירת התאים חיובי ד ר הלע ב איור 1D. במקום זאת, כדי להסיר תאים B השתמשנו של מגרש נוסף של CD14 / הלע-DR, להפריד הלא-classicals עקב שלהם הלע-ד ר גבוה יותר ואיפה נמוך CD14 ביטוי בתאי B.
יש גם הרבה דרכים שונות בהן השערים עבור ומונוציטים עצמם נמשכו בספרות; אלה כוללים הגזרות (תת-קבוצות מופרדים באמצעות סמנים רבעים), תיבות מלבניות או טרפז13 (עם קופסאות נפרדות נמשך משנה) אשר בנוסף נבדלים הצבתן בהתוויית מסתיים משנה אחד ומתחיל אחרת. סביר הבדלים אלה משקפים את העובדה כי ומונוציטים קיים רצף של תאים, המבדילים קלאסית מן הלא-קלאסית, ולא אוכלוסיות נפרדות בבירור. עם זאת, כי בווריאציות שיטות לזיהוי תת-קבוצות עצמם יכול להוביל הבדלים הפרופורציות משנה מונוציט מחושב, הוא הופך להיות חשוב כי השיטה המגביל הוא סביר אובייקטיבי, ולא סובייקטיבי, כמו זה להפוך את שיטת לשחזור ועמיד יותר. מספר מחקרים השתמש בפקד isotype עבור CD16 כדי לקבוע את הגבול בין קבוצות משנה קלאסית ובינוניים30. מצד שני, כדי להגדיר את ההפרדה בין intermediates, הלא-classicals, שהוא הוצע כי הקו ניתוק עשוי להיות אנכית או אלכסונית, עם הבחירה עד החוקרים, ההתניות להיות שזה צריך להיות לשחזור, אבל שער מלבני מומלץ כדי להקל על השוואות בין מחקרים13,30,31. כאן, ובאובייקטיביות מירבית מוגברת הושג על-ידי התוויית הנתונים על מגרש זברה והחלת הכללים ויזואלית אובייקטיבית, מכיוון חלקות זברה מספקים cue הדמיה נוספות על ידי ערבוב הצבע כדי לכל סל הסתברות שווה מעל מגרש מתאר מסורתיים. הגבול הימני של המשנה קלאסית נמשך כך האוכלוסייה היה מופץ באופן שווה סביב החציון האוכלוסייה. החלוקה בין intermediates הלא-classicals היו גם סטנדרטית על ידי בעל בסיס intermediates להתיישר עם תחתית המעגלים בתוך האוכלוסייה קלאסית (קרי, האוכלוסייה ביניים בבירור מבטא רמות גבוהות של CD14, לפי המינוח הרגיל1).
בעוד מספר מחקרים הציעו את השימוש סמנים נוספים, כגון C-C כימוקין קולטן מסוג 2 (CCR2) או 6-sulfo LacNAc (SLAN) להשגת ספירה מוצלחת של monocytes וכדי לחשוף את משמעות קלינית32,33 , בידיים שלנו רמת הביטוי של סמנים פונקציונליים רבים מונוציט משתנה מאוד בין אנשים14. וריאציה כזו עלולה להגביל את התועלת של סמנים אלה כדי להגדיר קבוצות משנה המבוסס על הביטוי שלהם. שיטות חישוביות לצורך אוטומטית גם שימשו כדי להמחיש אשכול מונוציט קבוצות משנה כולל ויזואלית אינטראקטיבית סטוכסטי השכן הטבעה (viSNE), t-מבוזרות סטוכסטי השכן הטבעה (tSNE) או התקדמות עץ מורחב ניתוח של אירועים מנורמל צפיפות (ספייד)34,35, אשר יכול לספק ייצוג חזותי של התאים המבוסס על הסט של מספר סמני בשימוש. בזמן זה הוכח כדי להגביר את הדיוק של האסטרטגיה חסימה בסיווג משנה מונוציט, הוא מוכר כי החיסרון הוא המספר של נוגדנים (ואת ערוצי fluorophore המקביל) נדרש. השימושיות שלה תהיה תלויה בשאלות שנשאלות; מורכבות נוספת עלולה לא להיות מוצדקת, לדוגמה, במחקרים ספירה.
ומונוציטים מגודרת עם הטכניקה שלנו להראות הפרופורציות בקנה אחד עם הספרות, הביטוי של סמני פני השטח על ידי שלוש קבוצות משנה ניתן לקבוע בקלות. בסך הכל, הטכניקה ואת מתודולוגיה המוסברת מספק שיטה סטנדרטית וישירה של ספירת מונוציט משנה הפרופורציות והערכה סמן משטח ביטוי, אשר ניתן להרחיב לכלול סמנים אחרים גם כן, ובכך אימות תפקידיהם פונקציונלי בתנאים שונים אחרים.
The authors have nothing to disclose.
Cytometry זרימה בוצעה במתקן Flow Cytometry הליבה נתמך על ידי המכון Westmead עבור מכון המחקר הרפואי, Westmead מחקר ה-Hub, סרטן מדרום ווילס, ומתקני בריאות לאומי המועצה למחקר רפואי. מחקר זה נתמך על ידי קרן חינוך ומחקר קליני בכימיה.
BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml | Becton Dickinson | 7128959 | |
Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |