Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het karakteriseren van monocyt deelverzamelingen door volbloed stroom cytometry. Het gaat hierbij om overzichten hoe gate de subsets kunt weergeven en beoordelen van hun uitdrukking van oppervlakte markers en geven een voorbeeld van de beoordeling van de uitdrukking van de M1 (inflammatoire) en M2 markers (ontstekingsremmer).
Abstract
Monocyten zijn belangrijke medewerkers in diverse inflammatoire aandoeningen en wijzigingen aan deze cellen, met inbegrip van hun subset proporties en functies, pathologische betekenis kunnen hebben. Een ideale methode voor de behandeling van wijzigingen in monocyten is volledig bloed stroom cytometry zoals de minimaal hanteren van monsters door deze methode artefactuele cel activatie beperkt. Echter worden veel verschillende benaderingen genomen om de poort van de deelverzamelingen van de monocyt leiden tot inconsistente identificatie van de deelverzamelingen tussen studies. Hier tonen we een methode met behulp van volledig bloed stroom cytometry te identificeren en te karakteriseren van menselijke monocyt deelverzamelingen (klassieke, intermediate en niet-klassieke). Duidelijk naar voren komt hoe te bereiden de bloedmonsters voor stroom cytometry, poort van de deelverzamelingen (garanderen contaminerende cellen zijn verwijderd), en bepalen monocyt deelverzameling expressie van oppervlakte markers — in dit voorbeeld M1 en M2 markers. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere studies waarvoor een standaard gating methode voor de beoordeling van monocyt deelverzameling proporties en monocyt deelverzameling expressie van andere functionele merkers.
Introduction
Monocyten zijn een soort witte bloedcellen die een belangrijke rol spelen bij bevordering van en het oplossen van de ontsteking. Er zijn drie voornaamste deelverzamelingen van monocyten erkende, klassieke (~ 85%), intermediate (~ 5%), en niet-klassieke monocyten (~ 10%), die worden gekenmerkt door hun niveau van cluster van differentiatie (CD) 14 en CD16 expressie1. De verhoudingen van monocyt deelverzamelingen kunnen verschillen met de aanwezigheid van ziekte, zoals een grotere aandeel van tussenproducten in verschillende inflammatoire Staten2,3 , met inbegrip van hart-en vaatziekten, waar het niveau van tussenproducten is in verband met klinische gebeurtenissen4,5. Bovendien, in ziekten, monocyten kunnen ook functionele veranderingen ondergaan, met vele veranderingen waarneembaar door een verschil in oppervlakte marker expressie6,7. Een voorbeeld hiervan is monocyt M1-scheeftrekken, een toename van markeringen gekoppeld M1 macrofagen, die is waargenomen in hart-en vaatziekten, diabetes, overgewicht en metabool syndroom7,8,9 , 10.
Ondanks de populariteit van stroom cytometry monocyt deelverzameling aandeel en functie te beoordelen, is er een aanzienlijke variabiliteit in de bereiding van de monsters en subset gating tussen studies waardoor het moeilijk te vergelijken bevindingen tussen dergelijke studies. Nog belangrijker is, is er geen consensus in de afbakening van monocyt deelverzamelingen, maar een gestandaardiseerde aanpak is essentieel gezien de klinische betekenis van wijzigingen in deelverzameling verhoudingen in verschillende ziekten. Onderdeel van de moeilijkheid in het gating vloeit voort uit het feit dat monocyten onderscheiden van de klassieke via de intermediaire tot en met de niet-klassieke deelverzameling11 en als zodanig, monocyten bestaan als een continu spectrum in plaats van verschillende populaties12 . Interessant, toonde Zawada et al. dat met behulp van ofwel een rechthoekige of trapezium gating van de tussenliggende subset, beide hebben geleid tot een hogere tussenliggende subset die voorspeld een cardiovasculaire eindpunt13. Hieruit blijkt dat, ten minste voor het berekenen van de verhoudingen, het hoofdthema is toepassing van een consistente gating strategie tussen verschillende monsters (en studies), in plaats van proberen te definitief discrimineren tussen deelverzamelingen. Hoewel definitieve gating wellicht belangrijker zijn, bij de beoordeling van de functie, de verandering in de marker expressie tussen deelverzamelingen is incrementele12,14, en dus opnieuw, consistentie in het gating is misschien belangrijke. Als zodanig is een doelstelling gating methode die reproducibly apportions de monocyt subsets tussen verschillende monsters nodig. Het doel van de methode die hier gepresenteerd is aan de gate monocyt deelverzamelingen met een heldere uitleg en rechtvaardiging voor het gating techniek werkzaam en beoordelen van de deelverzamelingen voor oppervlakte marker expressie, waardoor een methode waarmee onderzoekers te hebben vertrouwen in het gebruik van deze techniek bij de beoordeling van de verschillende monsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Volbloed stroom cytometry is een ideale aanpak monocyten bestuderen, zoals de cellen in voorwaarden dicht bij hun fysiologische communicatie een inzicht te geven in hun rollen in infectie en inflammatoire voorwaarden worden onderzocht. Bovendien, het gebruik van verse (dat wil zeggen, onbewerkte) bloedmonsters minimaliseert de verbouwingen of de cel transformaties die kunnen optreden als gevolg van opslag of verwerking van18,19, zoals die optreden bij het bevriezen-ontdooid monocyten 20. snelle monstervoorbereiding is aanbevolen omdat sommige markeringen upregulated zijn als monsters vóór verwerking19op kamertemperatuur worden bewaard. De optimale concentratie van M1 en M2 markeringen werden bepaald door titratie, en dit moet gebeuren voor alle nieuwe antilichamen tegen niet-specifieke binding te beperken en tegelijkertijd te waarborgen dat de mate van verschuiving te wijten aan antigeen expressie is en niet door een gebrek aan antilichaam beperkt. De verwijdering van rode bloedcellen en fixatie van de witte bloedcellen met lysis van de oplossing is een belangrijke stap in dit protocol als de aanwezigheid van rode bloedcellen met stroom cytometry21,22 interfereren kan. Merk op dat terwijl sommige lysis oplossingen compatibel met neen-wash kleuring zijn, duidelijker populaties duidelijk in onze handen zijn als een wassen stap wordt gebruikt.
Juiste installatie van de cytometer van de stroom is ook cruciaal bij het vergelijken van expressie van monocyt markers. Het is raadzaam dat onderzoekers consistent doel fluorescentie intensiteiten van controle kralen blijven en kwaliteitscontrole uitvoeren op het instrument worden gebruikt om te zorgen voor consistente resultaten over verschillende steekproeven worden uitgevoerd op verschillende dagen. Naast dit, worden isotype besturingselementen gebruikt om te helpen bij de interpretatie van elke niet-specifieke achtergrond signaal gegenereerd door niet-specifieke antilichaam binding. Monocyten hebben hoge niveaus van Fc receptoren11 en daarom zijn vatbaar voor niet-specifieke binding. Van de nota, het niveau van niet-specifieke binding verschilt voor de verschillende subgroepen, en dus het gebruik van een besturingselement isotype wordt belangrijk bij het vergelijken van de mate van marker expressie tussen deelverzamelingen.
Een ander belangrijk criterium moet worden beschouwd is de gating stappen werkzaam. Sommige studies suggereren dat het is van cruciaal belang om te tekenen van een strakke hek rond de monocyt bevolking in FSC(A)/SSC(A) plot om zich te ontdoen van het merendeel van de niet-monocytic CD16 positieve cellen23,24,25, maar dit kan leiden tot verlies van enkele monocyten zoals niet-monocyt cellen kunnen overlappen met de monocyten op FSC/SSC percelen26. Als u wilt uitsluiten van andere bloedcellen die de monocyten besmetten kan, is de opneming van een derde monocyt markering naast CD14 en CD16, veeleer essentiële26,27. Om deze reden, HLA-DR wordt vaak gebruikt en is ideaal als het niet wordt uitgedrukt door NK cellen of neutrofielen17,–28. Hoewel lymfocyten (B-cellen en T-cellen) kunnen HLA-DR express, verschillen ze van de monocyten met betrekking tot CD14 expressie. Hoewel HLA-DR een ideale derde markeerdraad is, CD86 is ook aanbevolen5,27,29 , maar werd niet hier gebruikt als het is ook een marker van de M1 en dus de mate van expressie op monocyt deelverzamelingen werd beoordeeld.
Validatie van de gating strategie gebruikt is van cruciaal belang. Terwijl de NK-cellen zijn gekend om te overlappen met niet-klassiekers als ze niet uit28 omheinde zijn, zien we dat de B-cellen ook kunnen overlappen met de niet-klassiekers (figuur 2B); of dit het geval in andere studies is kan afhangen van de fluorescerende keuze, instrument configuratie, gevoeligheid van de detector of zelfs de ziekte conditie onderzocht. Hier, de overlappende B cellen bleek hoge expressie van HLA-DR en waren niet uit door selectie van HLA-DR positieve cellen in Figuur 1 d. Eerder verwijderen van B-cellen gebruikten we een extra perceel van CD14 / HLA-DR, waar de B-cellen scheiden van niet-klassiekers als gevolg van hun hogere HLA-DR en lage CD14 expressie.
Er zijn ook veel verschillende manieren waarin de poorten voor de monocyten zelf zijn getekend in de literatuur; het gaat hierbij om kwadranten (de subsets zijn gescheiden door Kwadrant markeringen) en rechthoekige of trapezium vakken13 (met aparte vakken voor elke deelverzameling getekend) die bovendien verschillen in hun plaatsing uitgezet waar een subset eindigt en een andere begint. Deze waarschijnlijk verschillen weerspiegelen het feit dat monocyten bestaan als een continuüm van cellen, differentiëren van klassieke tot niet-klassiek, in plaats van als duidelijk zijn te onderscheiden populaties. Nochtans, omdat variaties in technieken voor de identificatie van de deelverzamelingen zelf tot verschillen in de verhoudingen van de deelverzameling berekende monocyt leiden kunnen, wordt het belangrijk dat de gating methode is redelijk objectieve, in plaats van subjectieve, zoals dit zal de methode robuuster en reproduceerbaar maken Een besturingselement voor een isotype voor CD16 sommige studies gebruiken om te bepalen van de grens tussen de klassieke en tussenliggende subsets30. Aan de andere kant, als u wilt definiëren de scheiding tussen tussenproducten en niet-klassiekers, wordt er geopperd dat de afbakeningslijn mogelijk verticale of schuine, met de keuze tot de onderzoekers, de voorwaarde dat het moet reproduceerbaar, maar een rechthoekige gate heeft aanbevolen om vergelijkingen tussen studies13,30,31. Verhoogde objectiviteit was hier, verkregen door het uitzetten van de gegevens op een perceel van zebra en de toepassing van objectieve visuele regels, omdat zebra percelen een extra visualisatie cue bieden door het mengen van kleurverloop aan elke gelijke waarschijnlijkheid bin over een traditionele contour plot. De rechterrand van de klassieke subset werd getrokken zodat de bevolking was gelijkmatig verdeeld rond de mediaan van de bevolking. De scheiding tussen de tussenproducten en de niet-klassiekers werden ook gestandaardiseerd door het hebben van de base van de tussenproducten uitlijnen met de onderkant van de concentrische cirkels binnen de klassieke bevolking (dat wil zeggen, de tussenliggende bevolking duidelijk spreekt van hoge niveaus van CD14, volgens de Standaardnomenclatuur1).
Terwijl sommige studies hebben voorgesteld het gebruik van extra markers, zoals C-C chemokine receptor type 2 (CCR2) of 6-sulfo LacNAc (SLAN) voor het verkrijgen van succesvolle opsomming van monocyten en te onthullen hun klinische significantie32,33 , in onze handen het niveau van expressie van vele monocyt functionele merkers varieert sterk tussen individuen14. Deze variatie kan het nut van deze markers te definiëren op basis van hun uitdrukking deelverzamelingen beperken. Geautomatiseerde computationele benaderingen zijn ook gebruikt om te visualiseren en cluster monocyt deelverzamelingen met inbegrip van visuele interactieve stochastische buurman insluiten (viSNE), t-verdeelde stochastische buurman insluiten (tSNE) of progressie van de Spanning-boom Analyse van de gebeurtenissen van de dichtheid-genormaliseerd (SPADE)34,35, die voor visuele weergave van de cellen op basis van de set van meerdere markeringen gebruikt zorgen kan. Terwijl dit is aangetoond dat het verhogen van de nauwkeurigheid van de gating strategie in monocyt deelverzameling classificatie, wordt erkend dat een nadeel het aantal antilichamen (en bijbehorende fluorophore kanalen is) vereist. Het nut ervan zal afhangen van de vragen; de extra complexiteit kan niet gerechtvaardigd zijn, bijvoorbeeld in de opsomming studies.
Monocyten gated met onze techniek Toon verhoudingen in overeenstemming met de literatuur en de expressie van oppervlakte markeerders door de drie deelverzamelingen gemakkelijk kan worden bepaald. Over het geheel genomen biedt de techniek en de methodologie hier uitgelegd een gestandaardiseerde en eenvoudige methode opsommen monocyt deelverzameling verhoudingen en beoordelen van oppervlakte marker expressie, die kan worden uitgebreid tot andere markeringen alsmede, waardoor valideren hun functionele rol in verschillende andere omstandigheden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stroom cytometry werd uitgevoerd in de Stroom Cytometry Core faciliteit die wordt ondersteund door het Westmead Institute for Medical Research, Westmead onderzoek Hub, Cancer Institute New South Wales, en National Health and Medical Research Council. Deze studie werd ondersteund door klinische chemie onderzoek en Education Fund.
Materials
| BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
| BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml | Becton Dickinson | 7128959 | |
| Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
| 5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
| V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
| APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
| Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
| PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
| PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
| PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
| PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
| PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
| PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
| PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
| PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
| PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
| PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
| PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
| PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
| OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
| Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
| Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
| Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |
References
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).
- Wildgruber, M., et al. The "Intermediate" CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans. Scientific Reports. 6, 39483 (2016).
- Heine, G. H., et al. Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease. Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography. Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Bories, G., et al. Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects. Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).
- Fadini, G. P., et al. An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy. Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).
- Satoh, N., et al. Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone. Diabetes Care. 33 (1), 7 (2010).
- Chen, X., Devaraj, S. Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).
- Williams, H., et al. Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease. International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. Phenotypic characterization of human intermediate monocytes. Frontiers in Immunology. 4, 339 (2013).
- Zawada, A. M., et al. Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study. Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).
- Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels. Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).
- Szaloki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).
- Abeles, R. D., et al. CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure. Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).
- Mukherjee, R., et al. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous. Scientific Reports. 5, 13886 (2015).
- Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).
- Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).
- Dagur, P. K., McCoy, J. P., Robinson, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Current protocols in cytometry. 73, (2015).
- Einwallner, E., et al. Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts. Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).
- Tsujioka, H., et al. Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction. Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity. Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).
- Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood. Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).
- Zawada, A. M., et al. Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease. Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).
- Zawada, A. M., et al. SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset. Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).
- Heimbeck, I., et al. Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females. Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets. Frontiers in Immunology. 4, 23 (2013).
- Weber, C., et al. Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups “Atherosclerosis & Vascular Biology” and “Thrombosis”. Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).
- Shantsila, E., et al. Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).
- Hofer, T. P., et al. slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation. Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. 29, 886 (2011).
- Thomas, G. D., et al. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).
