JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Davranışsal yanıt profilleri larva balık incelenmesi için deneysel protokol: nöro-uyarıcı kafein uygulamaya

Published: July 24, 2018
doi:
10.3791/57938
, ,
1Department of Environmental Science, Center for Reservoir and Aquatic Systems Research,Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies,Baylor University

Summary

Burada, larva zebra balığı ve koca kafa minnow lokomotor aktivite ve bir otomatik izleme yazılımı kullanarak photomotor yanıt (PMR) incelemek için bir protokol mevcut. Ortak toksikoloji biyoanalizler dahil, bu davranışların analizleri kimyasal bioactivity incelemek için bir tanı aracı sağlarlar. Bu iletişim kuralı kafein, modeli neurostimulant kullanılarak açıklanmıştır.

Abstract

Balık modelleri ve davranışlar giderek Biyomedikal Bilimleri kullanılır; Ancak, balık uzun ekolojik, fizyolojik ve toksikolojik çalışmalar konu oldu. Kullanarak otomatik dijital izleme platformlar, neuropharmacology son çabaları larva balık lokomotor davranışları roman küçük moleküller için potansiyel tedavi hedefleri tanımlamak için yararlanarak. Bu çabaların, benzer araştırma Çevre Bilimleri ve karşılaştırmalı Farmakoloji ve toksikoloji balık modellerin çeşitli davranışlar tanılama araçlarını kirletici katmanlı değerlendirilmesi ve yüzey suları için gerçek zamanlı izleme olarak incelenmesi kirletici tehditler. Zebra balığı Biyomedikal Bilimler popüler larva balık modelinde ise, koca kafa golyan balığı bir ortak larva balık ecotoxicology modelidir. Ne yazık ki, koca kafa minnow larva davranış çalışmalarda önemli ölçüde daha az dikkat aldık. Burada, biz geliştirmek ve kafein bir modeli neurostimulant bir davranış profili iletişim kuralı’nı göstermektedir. Koca kafa sazan photomotor tepkiler bazen kafein tarafından etkilendi ama zebra balığı belirgin daha duyarlı photomotor ve çevreye uygun düzeyde yanıt lokomotor bitiş noktaları için vardı. Gelecekteki çalışmalar arasında yaş ve günün saati ile balık karşılaştırmalı davranış duyarlılık farklılıkları anlamak ve benzer davranışsal etkileri ve doğada meydana göstergesidir, bireysel olumsuz sonuçları belirlemek için ihtiyaç vardır veya biyolojik organizasyon nüfus düzeyleri.

Introduction

Balık modelleri giderek Biyomedikal araştırmalar için kullanılan rağmen balık düzenli olarak ekoloji ve Fizyoloji araştırmaları için yüzey suları kirlenme incelemek ve kimyasal maddelerin toksikolojik eşikleri anlamak için istihdam edilmiştir. Bu çabaların önemlidir, çünkü Kimyasal kirlenme sucul ekosistemler zayıflatabilir ve kaynak su kaynakları1,2kalitesini tehlikeye. Ticaret, ancak, eksikliği kimyasalların en temel toksikoloji bilgileri3bile.

Hayvan modeli deneyleri geleneksel düzenleyici toksisite sınamada kullanılan kaynak yoğun olan ve yüksek işlem hacmi sağlayamaz erken katmanı tarama 21’inci yüzyıl4‘ te test toksisite için gerekli. Daha sonra kabul ve daha hızlı ve verimli bir şekilde bileşikler için biyolojik etkinlikler3,5ekran edebilirsin vitro modelleri kullanmak için artan bir ivme vardır. Temel hücre modelleri birçok fırsat sunmak da, genellikle biyolojik karmaşıklığını eksikliği ve böylece metabolizma6dahil olmak üzere birçok önemli bütün organizma işlemleri için hesap yapmak.

Zebra balığı su toksikoloji ve ecotoxicology7,8‘ alternatif bir model olarak popülerlik kazanıyor ortak bir biyomedikal hayvan modeli var. Kendi küçük boyutu, hızlı bir gelişim ve yüksek verimlilik göz önüne alındığında, balık modelleri hızla ve verimli bir şekilde bioactivity ve toksisite bütün organizma ölçek9için kimyevîler elemek için kullanılabilir. Otomatik izleme yazılım yardımı ile larva zebra balığı davranışları kirletici maddeleri toksisite10,11için eleme içinde gelişmiş tanılama yardımcı programı sağlar. Eczacılık Bilimleri Araştırmaları lokomotor bitiş noktaları eylem kimyasal mekanizmaları bilgilendirici, fenotip davranışları için kullanılabilir ve daha sonra geçici olarak Roman molekülleri12için hücre altı hedefler tespit edebilir göstermiştir, 13. Zebra balığı Biyomedikal Bilimler popüler larva balık modelinde ise, koca kafa golyan balığı ecotoxicology çalışmalar için ve potansiyel sırasında kullanılan bir ortak, ekolojik önemli balık modeldir (Örneğin, yeni kimyasal değerlendirme) ve Retrospektif (Örneğin, çevredeki yüzey su veya atık su atık su deşarj izleme) çevresel değerlendirmeler. Ne yazık ki, zebra balığı daha belirgin daha az dikkat larva koca kafa enstitünün davranışsal tepkiler aldık. Devam eden araştırma iki ortak larva balık modelleri, zebra balığı ve koca kafa golyan balığı öneriyor larva balık desenleri yüzme beklenen modları ya da eylem mekanizmaları çeşitli kimyasallar için eşsiz görünür. Böylece, davranışsal bitiş noktaları hızla ve hassas kimyasal toksisitesi için incelemek için ve özellikle erken katmanı değerlendirmeler sırasında Endüstriyel kimyasal ve diğer kirletici için hücre altı hedefler belirlemek için potansiyel sağlar.

Burada, davranışsal yanıt profilleri larva balık incelenmesi için bir protokol raporu. Kafein, bir model neurostimulant ve gıdalar, insan tüketimi takip Atıksu tedaviler bitkilerden deşarj aracılığıyla sucul sistemlere giriliyor ortak bir su kirletici kullanarak bu yöntemleri göstermektedir içecekler, ve ilaç kafein14ile formüle edilmiştir. Biz genellikle bir photomotor yanıt (PMR) embriyonik ve larva ile ilaç çalışmaları sırasında adlandırılır aydınlatma koşulunda ani bir değişiklik için de dahil olmak üzere her iki larva zebra balığı ve koca kafa minnow, kafein davranışsal yanıt incelemek zebra balığı13,15. Daha fazla kimyasal karşılık profilleri balık modelleri geliştirmek için birkaç lokomotor bitiş noktaları arasında kafein etkileri tanımlamak. Bu çalışmada kullanılan kafein tedavi düzeylerini kafein16ölçülen çevresel değerlere göre pozlama dağıtımları üst centiles göstermek. Biz de larva balık LC50 değerleri ve tedavi tehlike değerini (THV), plazma düzeyleri balık bir insan tedavi plazma dozu ile tutarlı sonuçlanması beklenen su ilaç bir konsantrasyon benchmarked tedaviler içerir.

Protocol

Bu iletişim kuralı çalışmalarda genellikle standart deneysel tasarım izleyin ve istatistiksel çözümlemeler yönergeleri ABD Çevre Koruma Kurumu (EPA no. 2000.0) koca kafa sazan için ve ekonomik işbirliği Teşkilatı tavsiye ve Zebra balığı için geliştirme (OECD No 236). Bu Deneysel tasarımlar (çoğaltma artanÖrneğin,) gelecekteki çalışmaları için geçerli protokol içinde değiştirilebilir. Koşulları daha önce takip balık kültür edebiyat17yayınlandı. Tüm deneysel prosedürler ve balık kültür protokolleri Baylor Üniversitesi’nde onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi protokolleri takip ettim. 1. kimyasal arıtma için balık teşhir Kafein Kafein Sulandırılan sert suda çözülerek pozlama çözümleri hazırlayın. Uygun seri dilutions daha düşük kafein tedavi seviyeleri üretmek için sert su ile daha yüksek kafein tedaviler sulandrarak gerçekleştirin.Not: Bu deneyde kullanılan tedavi düzeylerin her birine Tablo 1 özetler. Zebra balığı Koca kafa golyan balığı Tedavi Nominal kafein konsantrasyon (mg/L) Ölçülen kafein konsantrasyon (mg/L) Tedavi Nominal kafein konsantrasyon (mg/L) Ölçülen kafein konsantrasyon (mg/L) Denetim 0 < LOD Denetim 0 < LOD 75 Centile * 0,001 0,001 75 Centile * 0,001 0,001 95 Centile * 0.039 0,013 95 Centile * 0.039 0,009 99 Centile * 0.412 0.361 99 Centile * 0.412 0.310 THV 4,07 3,81 THV 4,07 4.12 % 10 LC50 48.46 46.66 % 10 LC50 14,1 14,7 % 40 LC50 193.82 186.67 % 40 LC50 56.38 53.91 Tablo 1: deneysel kafein tedaviler zebra balığı, koca kafa minnow deneyleri için. Kafein her tedavi için nominal ve ölçülen değerler verilir. * Bu çalışmada kullanılan kafein tedaviler kafein16ölçülen çevresel değerlere göre pozlama dağıtımları üst centiles temsil eder. THV: Tedavi tehlike değeri. LOD: Limit algılama Hazır çözüm bireysel pozlama şampanyaları doldur. Zebra balığı pozlama chambers için pozlama çözümü 20 mL dolu 100 mL Cam şişeler ve 500 mL kadehler 200 mL pozlama çözeltisi ile koca kafa minnow pozlama salonları için kullanın. Bir aktarım pipet kullanarak, her dört Çoğalt pozlama odalarının tedavi başına 10 zebra balığı embriyo yaşlı 4-6 h sonrası döllenme (hpf) yerleştirin. Tarama her üç Çoğalt pozlama odası tedavi başına 24 h içinde yer 10 koca kafa minnow larva yaşlı. Koca kafa minnow larva daha büyük boyutta yapabilmek için transfer pipet ucu transferi önce kesilmiş. 16:8 h ışık: karanlık photoperiod ve sabit bir sıcaklık 28 ± zebra balığı deneyler korumak 1 ° C. Aynı photoperiod rejimi kullanma koca kafa minnow çalışmalar için ama bir sıcaklık 25 ± 1 ° c Kimyasal maruz kalma 96 h sonra yük bireysel balık (için koca kafa minnow) 24 ve 48 (zebra balığı için) ayrı Wells de tabaklar. Her şey eşit bir çözüm hacmi içerir emin olmak için zebra balığı larva 48 iyi tabak iyi başına 1.000 µL birim için 5000 µL autopipette kullanarak aktarın. Geri çekilin ve zebra balığı larva ve pozlama aktarmak için autopipette kullanın çözüm aynı anda. Onların daha büyük boyutta nedeniyle koca kafa minnow larva transferi pipet ucu kesilmiş kullanarak aktarın. Koca kafa minnow larva için bireysel wells aktarmadan önce her doldurmak için de 2.000 µL bir autopipette kullanarak. Wells için bireysel koca kafa larva transfer ederken iyi çözümde transfer pipet ucu yerleştirin ve kuyuya pipet ucundan yüzmeyi balık sağlar. 2. Video izleme parametreleri kalibrasyonu Davranışsal ölçüler önce gözlem ve kalibrasyon parametrelerini ayarlamak video izlemek yazılımında (tablo malzemeleri görmek). Kayıt odası en az 1 larva balık bir bireysel iyi ile iyi bir tabak koyun. Plaka ve ilişkili balık beyanlar kalibrasyon parametreleri ayarlamak için kullanın. Video kanalı yazılım tıklayın “dosya | İletişim kuralı oluşturmak”,”iletişim kuralı oluşturma Sihirbazı”diyalog kutusu açılacaktır. “Konumu Count” alanında bireylerin wells iyi plaka numarasını girin ve “Tamam”‘ı tıklatın. Ekranın üst kısmında tıklatın “View | Tam ekran”iyi plaka bir genel gider kamera görünümü görüntülemek için sistem ister,. Üç renkli şekiller olarak görünür “Alanları çizmek” simgesini tıklatın. Görüş alanı iyi plaka sağında, “Bölgeler” etiketli alana daire simgesini seçin. İyi iyi plaka sol üst alanda izleme dairesel video betimlemek için imleci kullanın. “Sağ üst Mark” seçin ve sonra görünüm alanının üst şu iyi anahat. Sonra “Alt işareti” değil de alt anahat seçin.Not: dairesel anahat çizdikten sonra konumunu büyük olasılıkla ayarlanması gerekir.  Anahat konumunu ayarlamak için “Seç” seçeneğini tıklatın ve sonra Anahat alanı taşımak için imleci kullanın. Ayrıca, ana hatlarıyla “kopya” ve “Yapıştır” ı tıklatarak çoğaltılabilir. Üst sol, sağ, üst ve alt alanları değil de izleme tanımlandıktan sonra “otomatik olarak görüntüleme alanları kalan Wells betimlemek için belgili tanımlık bilgisayar yazılımı-e sevketmek için yapıyı”‘a tıklayın. “Kalibrasyon” etiketli alanında “Ölçek çizmek”‘i tıklatın. İmleç plaka arasında yatay bir çizgi çizmek için kullanın. Bir kez çizgi çizilir, “Kalibrasyon ölçüm” etiketli bir iletişim kutusu görünür. İyi plaka girin ve “Tamam” ı tıklatın. “Alanları çizmek” simgesini tıklatarak çizim Yöneticisi’nden çıkın. “Çini” simgesini tıklatın.  İmleci kullanarak, böylece her kutu yeşil görüntüleme ekranda görünen tüm kutuları vurgulayın.Not: Fayans simgesi altı tek tek küçük kareler bir grup olarak görünür. “Görünümü tıklatın | Tam ekran”.  Görüntüleme alanında plaka sağında, “Bkg” “Algılama eşik” etiketli kutunun içini tıklatın. Eşik ayar çubuğu pixel algılama eşik ayarlamak için kullanın. Bir kez, uygun piksel algılama eşik seçilir, “Grubuna Uygula”‘ı tıklatın.Not: Bu protokol algılama eşik 13 zebra balığı gözlemler için siyah modunda ve 110 koca kafa minnow gözlemler için şeffaf modunda ayarlar. “Hareketi eşik” etiketli kutusuna parametreleri izleme istediğiniz hareket hızı girin. Hız parametreleri ayarladığınızda, “Grubuna Uygula”‘ı tıklatın.Not: Bu protokol: 5 mm/s 20 mm/s ve etkin olmayan/küçük hareketleri, küçük/büyük hareketleri ayarlar. Bu seçimler üç farklı hız düzeyleri, larva balık hareketlerini takip için yazılım programı: etkin olmayan (dondurma) = 20 mm/s. Tıklatın “parametreleri | Parametreleri protokol aþaðý açýlan menüsünden”. Diyalog kutusunda Enter gözlem zaman ve entegrasyon zaman “Zaman” sekmesini seçin. Parametreler girildikten sonra “Ok”‘ı tıklatın. Ayarlamak için menü bırak açık/koyu photoperiod kere ve her photoperiod açık açık sürücü ayarlarını kutusu “Işık sürüş” “Parametrelerinden” seçerek diyalog için ışık şiddeti.Not: birden çok koyu photoperiods ayarlamak için protokol video bkz. Video izleme parametreleri ayarladıktan sonra gözlem Protokolü kaydedin.Not: Bu protokol iki 10 dk hafif nokta ve iki 10 dk karanlık dönem oluşan ışık/karanlık aşamaları değiştirme 4 tarafından takip 10 dk calıştıkları aşama içerir bir 50 dk süre içinde balık davranış gözlemler. Entegrasyon saat 50 dk davranış deneme her dakika için davranış ölçmek için ayarlanır. 3. larva balık lokomotor gözlenmesi ve Photomotor davranış Davranış kayıt odasında deneysel balık içeren iyi tabak koyun. Video izleme yazılımı, adım 3’te geliştirilen izleme Protokolü açın. Video izleme Görüntüleyicisi’nde bütün larva bilgisayar ekranında görünür olduğundan emin olmak için o sadece bir bireysel larva her kuyuya mevcuttur ve bireysel wells 2.1.5 ve 2.1.6 adımlarda tanımlanan gözlem alanları içinde hizalanır kontrol edin. Tıkırtı üstünde “deneme | Yürütmek”.Not: Sistem bir ad ve konum gözlem verileri kaydetmek için girmesini ister. Bir kez adı ve gözlem konumunu veri belirtilmiş olan, önceden tanımlanmış görüntüleme alanları vurgulamak için “Birkaç canlı görüntü” simgesine tıklayınNot: Bu simge bilgisayar ekranının üst kısmında bulunur ve dört küçük kareler halinde bölünmüş bir kutu olarak görüntülenir. Bu ikonuna tıklayarak tüm önceden tanımlanmış görüntüleme alanları vurgular. Kayıt odası paneli kapatın ve tıklayın “arka plan | «««Başlat”bilgisayar monitöründe. 4. davranışsal verileri analiz Larva balık etkinliği verilerini almak için otomatik olarak izleme yazılımı tarafından derlenmiş ve davranışsal denemeler (adım 3.4) işlemini başlatmadan önce Kullanıcı tarafından belirtilen klasörde bulunur elektronik tabloyu açın. Şekil 1A ve 1B yıkamaya zebra balığı ve koca kafa minnow larva, saf lokomotor aktivite temsilcisi ölçümleri için sırasıyla bakın. Rakamlar 1 c ve 1 D etkili ışık karanlık veya ışık karanlık geçişleri arasındaki hareketi fark büyüklüğü incelemek PMR hesaplamalar için bakın. Şekil 1: Temel etkinlik yıkamaya zebra balığı (A ve B) ve koca kafa golyan balığı (C ve D) örneği. Zebra balığı(a)için Ortalama (± SEM) mesafe yüzdüm ve koca kafa golyan balığı (C) aktivitesinin temsil eden her bir dakikalık aralıklarla nokta ile verilir. İki karanlık ve ışık dönemlerinde iki: photomotor yanıt-e doğru ölçülür. Son (a, c, e ve g) ve (b, d, f ve h) ilk her photoperiod dakikasını Sarj tutucusu, sunun. Photomotor yanıt bir zebra balığı (B) hesaplamak için kullanılır ve koca kafa golyan balığı (D) değişiklik son dakika arasında kat edilen mesafeyi ortalama (±SEM) olarak ölçülen bir ilk photoperiod ve sonraki dönem ilk dakikasında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Representative Results

Kafein tedavi düzeyleri kayda değer zebra balığı ve koca kafa sazan ile 96 h deneyler sırasında değişir değil. Örneğin, Tablo 1 analitik doğrulanmış konsantrasyonları her tedavi seviye sunuyor. Bu iletişim kuralı su örnekleri kafein tedavi düzeyleri için genellikle daha önce bildirilen yöntemler28takip İzotop seyreltme sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi tarafından (LC-MS/MS) doğrulanmadı. Paraxanthine, kafein, birincil metaboliti oluşumu da sayısal. Bu analitik işlemleri için bir açıklama ek analitik bilgiler sağlanır. Nominal ve analitik doğrulama tedavilerin arasındaki benzerlikleri nedeniyle nominal tedavi düzeyleri bu yazının geri kalanı sunulmaktadır. Kafein önemli ölçüde zebra balığı ve koca kafa minnow davranışları değişmiş. Ancak, zebra balığı lokomotor yanıt koca kafa böceklerden kafein için sürekli olarak daha hassas olduğunu. Zebra balığı ve koca kafa minnow larva için en duyarlı davranış bitiş noktası, bir konsantrasyon 0,039 mg kafein tarafından etkilenen/L. Tablo 2 en düşük gözlenen etkisi konsantrasyonları (LOECs) ve hiçbir gözlenen etkisi konsantrasyonları (NOECs) özetler her davranış bir son nokta için her iki balık modelleri. Zebra balığı Koca kafa golyan balığı Bitiş noktası LOEC (mg/L) NOEC (mg/L) Bitiş noktası LOEC (mg/L) NOEC (mg/L) Toplam mesafe karanlık 0.412 0.039 Toplam mesafe karanlık − 56.38 Toplam mesafe ışık 48.46 4,07 Toplam mesafe ışık − 56.38 Toplam karanlık sayar 0.412 0.039 Toplam karanlık sayar − 56.38 Toplam sayıları ışık 48.46 4,07 Toplam sayıları ışık − 56.38 Mesafe karanlık patlama − 193.82 Mesafe karanlık patlama − 56.38 Mesafe ışık patlama 193.82 48.46 Mesafe ışık patlama − 56.38 Patlama karanlık sayar 193.82 48.46 Patlama karanlık sayar − 56.38 Patlama sayar ışık 193.82 48.46 Patlama sayar ışık − 56.38 Patlama süresi karanlık 193.82 48.46 Patlama süresi karanlık − 56.38 Patlama süresi ışık − 193.82 Patlama süresi ışık − 56.38 Seyir mesafesi karanlık 0.412 0.039 Seyir mesafesi karanlık − 56.38 Seyir mesafesi ışık 48.46 4,07 Seyir mesafesi ışık − 56.38 Seyir karanlık sayar 0.412 0.039 Seyir karanlık sayar − 56.38 Seyir sayar ışık 48.46 4,07 Seyir sayar ışık − 56.38 Seyir süresi karanlık 0.412 0.039 Seyir süresi karanlık − 56.38 Seyir süresi ışık 48.46 4,07 Seyir süresi ışık − 56.38 Mesafe karanlık dondurma 0.412 0.039 Mesafe karanlık dondurma 0.039 0,001 Dondurucu mesafe ışık 0.039 0,001 Dondurucu mesafe ışık − 56.38 Donma karanlık sayar 0.412 0.039 Donma karanlık sayar − 56.38 Dondurucu sayar ışık 48.46 4,07 Dondurucu sayar ışık − 56.38 Süre karanlık dondurma − 193.82 Süre karanlık dondurma 56.38 14,10 pazarlama Süre hafif donma 48.46 4,07 Süre hafif donma − 56.38 Koyu 1 PMR 48.46 4,07 Koyu 1 PMR 0.039 0,001 1 PMR ışık 48.46 4,07 1 PMR ışık − 56.38 Koyu 2 PMR 48.46 4,07 Koyu 2 PMR − 56.38 2 PMR ışık 48.46 4,07 2 PMR ışık − 56.38 Koyu 1 PMR patlama − 193.82 Koyu 1 PMR patlama − 56.38 Açık 1 patlama PMR − 193.82 Açık 1 patlama PMR − 56.38 Koyu 2 PMR patlama 193.82 48.46 Koyu 2 PMR patlama − 56.38 Açık 2 patlama PMR − 193.82 Açık 2 patlama PMR − 56.38 Koyu 1 PMR seyir 48.46 4,07 Koyu 1 PMR seyir − 56.38 Normal hızda 1 PMR ışık 48.46 4,07 Normal hızda 1 PMR ışık − 56.38 Koyu 2 PMR seyir 48.46 4,07 Koyu 2 PMR seyir − 56.38 Seyir açık 2 PMR 193.82 48.46 Seyir açık 2 PMR 56.38 14,10 pazarlama Koyu 1 PMR dondurma 48.46 4,07 Koyu 1 PMR dondurma − 56.38 Açık 1 dondurma PMR 193.82 48.46 Açık 1 dondurma PMR − 56.38 Koyu 2 PMR dondurma 48.46 4,07 Koyu 2 PMR dondurma − 56.38 Açık 2 buz gibi PMR 193.82 48.46 Açık 2 buz gibi PMR − 56.38 Tablo 2: zebra balığı ve koca kafa minnow davranış NOECs ve kafein LOECs. Hiçbir gözlenen etkisi konsantrasyonu (NOEC) ve en düşük gözlenen etkisi konsantrasyonu (LOEC) (mg/L) değerleri her ışık/karanlık yüzme etkinlik bitiş noktaları ve photomotor yanıt kafein için maruz zebra balığı ve koca kafa sazan için. Tire hiçbir etkisi tüm tedavi düzeyleri arasında özel bir son nokta tespit edildi gösterir. Şekil 2 toplam lokomotor aktivite ve kafein maruz 96 h takip zebra balığı ve koca kafa minnow, Sarj tutucusu, sunun sunar. Sarj tutucusu, sunun daha alt düzeylerde tedavi (0,038 mg/L) zebra balığı daha kafein ama belirgin sayıda photomotor bitiş noktaları tarafından değiştirilmiş olan koca kafa minnow larva içinde zebra balığı etkilendi. Kafein (193.82 mg/L) en yüksek tedavi düzeyde PMR bu yanıtları tam olarak ters zebra balığı içinde değişmiş denetimlerinden. Bu yükseltilmiş tedavi düzeyde ancak, Sarj tutucusu, sunun karanlıkta azalmış ve ışıklı ortamlarda arttı. Resim 2: Yüzme faaliyetleri ve photomotor yanıt zebra balığı (A ve B) ve koca kafa golyan balığı (C ve D) kafein 96 h maruz kaldıktan sonra. Zebra balığı(a)için Ortalama (± SEM) mesafe yüzdüm ve koca kafa golyan balığı (C) aktivitesinin temsil eden her 1 dk aralıklarla nokta ile verilir. Photomotor yanıt zebra balığı (B) ve koca kafa golyan balığı (D) bir değişiklik demek (± SE) toplam mesafe bir ilk photoperiod last minutes ve sonraki dönem ilk dakikasında arasındaki seyahat olarak ölçülür. İki karanlık ve iki ışık dönem photomotor yanıt ölçüldü. 24 Toplam (4 çoğaltır her 6 larva,) zebra balığı ve 12 (3 çoğaltır her 4 larva,) koca kafa enstitünün davranış gözlem için kullanılmıştır. p < 0,10; p < 0,05; p < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Larva Sarj tutucusu, sunun ölçme yanı sıra, açık ve koyu lokomotor aktivite analiz edildi üç hız eşikleri taşındı mesafe için hareketleri sayısını ve saat hareketleri. Bu veri davranışsal yanıt profilleri kafein (Şekil 3, Supplemental Şekil 1) geliştirmek için kullanılır. Her iki balık modelleri, kafein inhibe aktivite etkilenen tüm önemli ölçüde lokomotor bitiş noktaları. Her iki balık önemli olsa da, kafein, maruz takip patlama hızı eşikleri gösterdiği artmış aktivite modelleri. Benzer şekilde PMR gözlem sonuçlarını, kafein zebra balığı lokomotor bitiş noktaları daha fazla sayıda etkilenir. Aslında, kafein THV aşağıda çevre gerçekçi düzeyde karanlık koşullarda birkaç lokomotor yanıt önemli ölçüde değişmiş. Ancak, koca kafa minnow lokomotor aktivite önemli ölçüde herhangi bir tedavi düzeyi tarafından ışık koşulları altında etkilenen değil. Şekil 3: kafein 96 h maruz kaldıktan sonra larva zebra balığı ve koca kafa enstitünün yanıt profilleri. Zebra balığı koyu(a)ve kafein 96 h maruz kaldıktan sonra koca kafa golyan balığı koyu (C) ve (D) ışık etkinliği anlamına göre etkinlik yüzme ışık (B) anlamına gelir. Veri temsil etkinliği iki 10 dk karanlık photoperiods ve iki 10 dk hafif photoperiods her balık model için çizilen. Veri her şekilde 0 eksen, temsil denetlemek için normalleştirilmiş. Davranış parametreleri içerir mesafe yüzdüm, hareketleri (sayıları) sayısı ve saat her hareketi patlama 3 hız ayarı arasında (> 20 mm/s), seyir (5-20 mm/s) ve buz gibi (< 5 mm/s). Hareket desenler her hızı eşik ek olarak toplam mesafe yüzdüm ve hareketlerin toplam sayısı gösterilir. ↑ faaliyet denetimi ile karşılaştırıldığında önemli bir artış gösterir ve ↓ faaliyet denetimi ile karşılaştırıldığında önemli bir azalma gösterir. 24 Toplam (4 çoğaltır her 6 larva,) zebra balığı ve 12 (3 çoğaltır her 4 larva,) koca kafa minnow davranış gözlemleri her grup için kullanıldığı yerlerde. p < 0,10; p < 0,05; p < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Tamamlayıcı Şekil 1: Zebra balığı (A ve B) ve koca kafa golyan balığı (C ve D) üç hız eşikleri arasında Photomotor yanıt. Zebra balığı (A, B ve C) ve koca kafa minnow larva (D, E ve F) photomotor yanıt üç hız eşikleri arasında (dondurma: 20 mm/s) kafein 96 saat maruz kaldıktan sonra. Photomotor yanıt zebra balığı ve koca kafa golyan balığı bir değişiklik demek (±SE) toplam mesafe bir ilk photoperiod last minutes ve sonraki dönem ilk dakikasında arasındaki seyahat olarak ölçülür. İki karanlık ve iki ışık dönem photomotor yanıt ölçüldü. 24 Toplam (4 çoğaltır her 6 larva,) zebra balığı ve 12 (4 larvalar 3 çoğaltır) koca kafa enstitünün davranış gözlem için kullanılmıştır. * p < 0,01 bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Davranışsal toksikoloji çalışmaları için kimyasal arıtma düzeyleri seçerken, çeşitli faktörler dikkate alınmalıdır. Kafein tedavi seviyeleri mevcut çalışmada öngörülen çevre pozlama senaryoları atık su atık su16için üst centile değerlere göre seçildi. Mümkün olduğunda, biz düzenli olarak su toksikoloji etütler olasılıkçı pozlama değerlendirmeler çevre gözlemleri19,20,21kullanarak tedavi düzeylerini seçin. İlaçlar için hesaplanabilir, bir THV da da çalışmanın bir tedavi düzey olarak dahil oldu. THV değerleri (EQ 1)22,23 tahmin edilen su konsantrasyonları insan terapötik dozlarda (Cmax) ilaç balık23yılında lider olarak tanımlanan, ilk plazma çabaları24modelleme ilham kaynağı olan ve çoğu kan: su kimyasal katsayıları (EQ 2)25bölümleme göre hesaplanır.

THV Cmax = / PBW (EQ 1) oturum

günlük PBW günlük = [(100,73. Kow oturum · 0.16) + 0,84] (EQ 2)

Burada, ayrıca zebra balığı ve koca kafa minnow LC50 değerleri göre sublethal tedavi düzeylerini seçin. Özellikle eşikleri özellikli bir balık belirli davranışları arasında birden fazla kimyasallar karşılaştırırken davranışsal yanıt için yararlı bir karşılaştırma yordam bu yaklaşımı dikkate alın. Akut mekanik çalışmalar ve değerlendirmeler için su toksikoloji tanıyla yararlı olabilir kronik oranlarına hesaplamaları daha da kolaylaştırır. LC50 değerleri 2.1 adımda verilen standart yönergeleri izleyerek ön toksisite biyoanalizler elde.

Bu iletişim kuralı, biz ortak Deneysel tasarımlar istihdam ve istatistiksel teknikler bizi EPA ve OECD tarafından önerilen standart yöntemlerden toksikoloji araştırmalar balık modelleri ile. Rağmen biz p değerleri raporu (e.g., < 0,01, < 0,05, < 0,10), önemli farklılıklar (α = 0,10) aktivite düzeyleri varyans analizi (ANOVA) kullanarak tedaviler arasında tanımlanır normallik ve eşdeğerlik varyans varsayımlar karşılanmaktadır. Dunnett'ın veya Tukey'nın HSD öğleden hoc testi tedavi düzey farkları belirlemek için yapılmaktadır. Bu alpha seçin (α = 0,10) erken katmanı deneyleri ve yerine biyolojik olarak önemli etkisi boyutu bir anlayış çöküşünde davranış bitiş noktaları ve model organizmalar26, ne zaman sınırlı olduğu için özellikle tip II hataları azaltmak için değer yordamlar için birden fazla karşılaştırmalar Biyomedikal bilimlerde yaygın istihdam (Örn., RNA-Seq veri için Bonferroni düzeltmesi)27.  Gelecekteki çalışmalar değişkenlik bu davranışsal yanıt-e doğru anlamak ve potansiyel olarak Deneysel tasarımlar (Örneğin, artış çoğaltma) buna göre değiştirmek için ihtiyaç vardır.

Bir dizi faktöre yanı sıra kimyasal maruziyet larva balık davranışını etkileyebilir. Örneğin, gün, yaş, iyi boyutu, sıcaklık, ışık durumu ve her iyi temsil önemli hususlar11,30çözümde pozlama hacmi saati. Bu nedenlerden dolayı deneme sırasında larva balık lokomotor davranışını etkileyebilir dış faktörlerin etkilerini en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. Davranış gözlemleri dar zaman Windows (3-4 h) ve ne zaman zaman gün etkileri larva lokomotor davranış11üzerinde en az etkiye sahip bekleniyor dönemleri arasında gerçekleştirilmesi gerekiyor. Ayrıca, larva balık (28 ± 1 ° C zebra balığı için) ve 24 ± 1 ° C FHM için tutarlı bir sıcaklık ve bir ısı kontrollü İnkübatörler pozlama süresi boyunca içinde tanımlanmış ışık/karanlık döngü sağlanmalıdır. Ayrıca, nerede davranışları kaydedilir laboratuvar sıcaklığını sıcaklık etkileri davranışları önlemek için deneysel koşullar yaklaşıldığıdır koşulları sağlanmalıdır. Ayrıca, davranış gözlemleri sırasında kullanılan kuyu bireysel her balık için tutarlı bir ses seviyesinde sağlanmalıdır.

Larva ve embriyonik zebra balığı Sarj tutucusu, sunun daha önce Biyomedikal Bilimleri roman12,13bileşikler için potansiyel tedavi hedefleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı önceki davranışsal araştırma zebra balığı ile çevre kirletici kimyasal bioactivity araştırmak için 38 bitiş noktaları kullanarak ortalamalı. Kafein bir anlaşılır etki mekanizması (MoA) ile ortak bir su kirletici olsa da, birçok bileşikler ticaret önemli mekanik veri eksikliği. Bu nedenle, bu iletişim kuralını adalardaki anlayış toksisite veri ticari kimyasallar39da dahil olmak üzere, eksik bileşikler için kazanmak için istihdam edilebilir. Ayrıca, protokol iki en yaygın olarak kullanılan balık modelleri için yöntemler sağlar. Zebra balığı ecotoxicology içinde giderek daha popüler hale geliyor ortak bir biyomedikal balık model, Etkafa minnow ekolojik bir model olarak çevresel değerlendirme uygulamaları için yaygın olarak kullanılır ancak aldı ise daha önce belirtildiği gibi zebra balığı için karşılaştırıldığında otomatik sistemler ile davranış çalışmalarda nispeten daha az dikkat. Orada kalır rağmen hiçbir standart düzenleyici yöntemleri balık davranış toksikoloji çalışmalar için bu iletişim kuralı gelecekteki çabalarını desteklemek için bir yaklaşım sağlar.

Kafein, su ortamında16‘ tespit düzeyde balık modellerin her davranış yanıtları elde edildi. Rodriguez-Gil ve ark. 2018 su sistemlerinde kafein16ölçülen değerlere göre küresel çevre pozlama dağıtımları geliştirdi. Özellikle, tahmin edilen atık su atık su konsantrasyonu % 95’i LOECs mevcut çalışma (Tablo 2) zebra balığı ve koca kafa golyan balığı en hassas davranış bitiş noktaları için aşık olmaz. Kafein çeşitli davranışsal etkileri çevre ilgili düzeylerde zebra balığı (özellikle de karanlık koşullar) gözlendi rağmen bu davranış değişiklikleri veya doğal balık nüfus ortaya neden belli değil ekolojik önemli olumsuz sonuçları. Hassas, tanı tarama amaçlar için yararlı olsa da, larva balık davranış eşikleri temsilcisi diğer yaşam öyküsü aşamaları veya balık doğal nüfus olmayabilir. Daha fazla araştırma garanti benzer olup olmadığını belirlemek için davranışsal yanıt eşikleri doğada meydana ve olumsuz sonuçları, biyolojik organizasyonun bireysel ya da nüfus düzeylerindeki göstergesidir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmada ABD Ulusal Bilim Vakfı tarafından sağlanan desteği (proje #: CHE-1339637) ABD Çevre koruma ajansı ek desteği ile. Dr. Jone Corrales, Dr Lauren Kristofco, Gavin Saari, Samuel hanoğlu, Bekah Burket ve Bridgett Hill genel laboratuar destek için teşekkür ederiz.

Materials

ViewPoint Zebrabox ViewPoint ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations
Caffeine Sigma-Aldrich C0750-100G Study chemical
Incubator VWR 9110589 Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments
Incubator Thermo Fisher Scientific 35824-636 Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments
100 ml glass beakers VWR 89000-200 Zebrafish exposure chambers 
500 ml glass beakers  Pyrex EW-34502-03 Fathead minnow exposure chambers
5000 µl auto-pipette Eppendorf Research 5000 Used to fill individual wells in well plates
Transfer Pippettes VWR 414-004-004 Used to transfer study organisms 
48-well plates Fisher Scientific 08-772-52 Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates VWR 10062-896 Larval fathead minnow behavioral recording chambers
Calcium sulfate dihydrate Sigma-Aldrich C3771 For reconstituted hard water
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506 For reconstituted hard water
Sodium Bicarbonate  Sigma-Aldrich S5761 For reconstituted hard water
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 For reconstituted hard water
z-mod recirculating system Marine Biotech Systems Recirculating system to maintian zebrafish cultures
Statistical analysis software Sigma Plot  Version 13.0 Used to analyze beahvioral data and produce figures
Statistical analysis software Graphpad Prism Prism 5 Used to produce figures 
Autosampler/quaternary pumping system Agilent Technologies Infinity 1260 model  Analytical verification of caffeine treatment levels
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source Agilent Technologies Analytical verification of caffeine treatment levels
Triple quadrupole mass analyzer  Agilent Technologies Model 6420 Analytical verification of caffeine treatment levels
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7)  Agilent Technologies 685775-914T Caffiene chromatography 
MassHunter Optimizer Software  Agilent Technologies Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malaj, E., et al. Organic chemicals jeopardize the health of freshwater ecosystems on the continental scale. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9549-9554 (2014).
  2. Schäfer, R. B., Kühn, B., Malaj, E., König, A., Gergs, R. Contribution of organic toxicants to multiple stress in river ecosystems. Freshwater Biology. 61 (12), 2116-2128 (2016).
  3. Andersen, M. E., Krewski, D. Toxicity testing in the 21st century: bringing the vision to life. Toxicological Sciences. 107 (2), 324-330 (2008).
  4. Rovida, C., Hartung, T. Re-evaluation of animal numbers and costs for in vivo tests to accomplish REACH legislation requirements for chemicals-a report by the transatlantic think tank for toxicology (t (4)). Altex. 26 (3), 187-208 (2009).
  5. Council, N. R. . Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. , (2007).
  6. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  7. Scholz, S., Fischer, S., Gündel, U., Küster, E., Luckenbach, T., Voelker, D. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment-applications beyond acute toxicity testing. Environmental Science and Pollution Research. 15 (5), 394-404 (2008).
  8. Fraysse, B., Mons, R., Garric, J. Development of a zebrafish 4-day embryo-larval bioassay to assess toxicity of chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 63 (2), 253-267 (2006).
  9. Noyes, P. D., Haggard, D. E., Gonnerman, G. D., Tanguay, R. L. Advanced morphological-behavioral test platform reveals neurodevelopmental defects in embryonic zebrafish exposed to comprehensive suite of halogenated and organophosphate flame retardants. Toxicological Sciences. 145 (1), 177-195 (2015).
  10. Colón-Cruz, L., et al. Alterations of larval photo-dependent swimming responses (PDR): New endpoints for rapid and diagnostic screening of aquatic contamination. Ecotoxicology and Environmental Safety. 147, 670-680 (2018).
  11. Kristofco, L. A., et al. Age matters: developmental stage of Danio rerio larvae influences photomotor response thresholds to diazinion or diphenhydramine. Aquatic Toxicology. 170, 344-354 (2016).
  12. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327 (5963), 348-351 (2010).
  13. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nature Chemical Biology. 6 (3), 231-237 (2010).
  14. Bruton, T., Alboloushi, A., DeL a Garza, B., Kim, B. -. O., Halden, R. U. . Contaminants of Emerging Concern in the Environment: Ecological and Human Health Considerations. , 257-273 (2010).
  15. Woudenberg, A. B., et al. Zebrafish embryotoxicity test for developmental (neuro) toxicity: Demo case of an integrated screening approach system using anti-epileptic drugs. Reproductive Toxicology. 49, 101-116 (2014).
  16. Rodríguez-Gil, J., Cáceres, N., Dafouz, R., Valcárcel, Y. Caffeine and paraxanthine in aquatic systems: Global exposure distributions and probabilistic risk assessment. Science of the Total Environment. 612, 1058-1071 (2018).
  17. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  19. Kristofco, L. A., Brooks, B. W. Global scanning of antihistamines in the environment: Analysis of occurrence and hazards in aquatic systems. Science of the Total Environment. 592, 477-487 (2017).
  20. Saari, G. N., Scott, W. C., Brooks, B. W. Global assessment of calcium channel blockers in the environment: Review and analysis of occurrence, ecotoxicology and hazards in aquatic systems. Chemosphere. , (2017).
  21. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  22. Berninger, J. P., et al. Effects of the antihistamine diphenhydramine on selected aquatic organisms. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (9), 2065-2072 (2011).
  23. Brooks, B. W. Fish on Prozac (and Zoloft): ten years later. Aquatic Toxicology. 151, 61-67 (2014).
  24. Huggett, D., Cook, J., Ericson, J., Williams, R. A theoretical model for utilizing mammalian pharmacology and safety data to prioritize potential impacts of human pharmaceuticals to fish. Human and Ecological Risk Assessment. 9 (7), 1789-1799 (2003).
  25. Fitzsimmons, P. N., Fernandez, J. D., Hoffman, A. D., Butterworth, B. C., Nichols, J. W. Branchial elimination of superhydrophobic organic compounds by rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology. 55 (1-2), 23-34 (2001).
  26. Scheiner, S. M., Gurevitch, J. . Design and Analysis of Ecological Experiments. , (2001).
  27. Nakagawa, S. A farewell to Bonferroni: the problems of low statistical power and publication bias. Behavioral Ecology. 15 (6), 1044-1045 (2004).
  28. Bean, T. G., et al. Pharmaceuticals in water, fish and osprey nestlings in Delaware River and Bay. Environmental Pollution. 232, 533-545 (2018).
  29. Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behavioural Brain Research. 228 (1), 99-106 (2012).
  30. Padilla, S., Hunter, D., Padnos, B., Frady, S., MacPhail, R. Assessing locomotor activity in larval zebrafish: Influence of extrinsic and intrinsic variables. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 624-630 (2011).
  31. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  32. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
  33. Hutson, L. D., Liang, J. O. Making an impact: zebrafish in education. Zebrafish. 6, 119 (2009).
  34. Hutson, L. D., Liang, J. O., Pickart, M. A., Pierret, C., Tomasciewicz, H. G. Making a difference: education at the 10th international conference on zebrafish development and genetics. Zebrafish. 9 (4), 151-154 (2012).
  35. Kane, A., Salierno, J., Brewer, S. Fish models in behavioral toxicology: automated techniques, updates and perspectives. Methods in Aquatic Toxicology. 2, 559-590 (2005).
  36. Rodriguez, A., et al. ToxTrac: a fast and robust software for tracking organisms. Methods in Ecology and Evolution. 9 (3), 460-464 (2018).
  37. Hamm, J., Wilson, B., Hinton, D. Increasing uptake and bioactivation with development positively modulate diazinon toxicity in early life stage medaka (Oryzias latipes). Toxicological Sciences. 61 (2), 304-313 (2001).
  38. Kristofco, L. A., Haddad, S. P., Chambliss, C. K., Brooks, B. W. Differential uptake of and sensitivity to diphenhydramine in embryonic and larval zebrafish. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 1175-1181 (2018).
  39. Steele, W. B., Kristofco, L. A., Corrales, J., Saari, G. N., Haddad, S. P., Gallagher, E. P., Kavanagh, T. J., Kostal, J., Zimmerman, J. B., Voutchkova-Kostal, A., Anastas, P. T., Brooks, B. W. Comparative behavioral toxicology of two common larval fish models: exploring relationships between modes of action and locomotor responses. Science of the Total Environment. 460-461, 1587-1600 (2018).

Tags

Fish ModelsBehavioral ResponseLarval FishCaffeineNeuro-stimulantEnvironmental Biomedical SciencesLocomotor ActivityPhotomotor ResponseZebrafishFathead MinnowExposure ChambersVideo Tracking

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine. J. Vis. Exp. (137), e57938, doi:10.3791/57938 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image