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Environment

稚魚の行動応答プロファイルを調べるための実験プロトコル: 神経興奮剤カフェインへの応用

Published: July 24, 2018
doi:
10.3791/57938
, ,
1Department of Environmental Science, Center for Reservoir and Aquatic Systems Research,Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies,Baylor University

Summary

ここでは、ゼブラフィッシュとヨシノゴチの幼虫ミノーの自発活動と photomotor 応答 (PMR) 自動追跡ソフトウェアを使用して検討するプロトコルを提案します。共通の毒性生物検定株式これらの行動の分析は化学生物活性を調べる診断ツールを提供します。このプロトコルは、カフェイン、モデル neurostimulant を使用して記述されています。

Abstract

魚モデルと行動はますますナカオ; で使用されます。しかし、魚長期生態学的、生理学的、毒物学的研究の対象とされています。自動デジタル追跡プラットフォームを使用して、神経薬理学における最近の取り組みは小さな分子の潜在的な治療上のターゲットを識別するために仔魚運動行動を活用しています。同様、これらの取り組みには環境科学と比較薬理学の研究および毒性は汚染物質の階層型評価と表面水のリアルタイム モニタ リングの診断ツールとして魚モデルのさまざまな動作を調べる汚染の脅威。一方、ゼブラフィッシュは生物医学の仔魚の人気モデルで、ヨシノゴチ ミノーは毒性で一般的な仔魚モデルです。残念ながら、ヨシノゴチ ミノー幼虫は行動学かなり少ない注意を受けています。ここでは、我々 が開発し、モデル neurostimulant としてカフェインを用いた行動プロファイル プロトコルを示します。ヨシノゴチ ミノーの photomotor 応答はカフェインによって時折影響を受けた、ゼブラフィッシュあった photomotor および環境に関連するレベルで呼応する自発のエンドポイントの著しくより敏感。年齢と時間帯では、魚の中で比較行動感度の違いを理解して同様の行動効果は自然に発生して個人で副作用の兆候であるかどうかを決定するために今後研究が必要か人口のレベルの生物学的組織。

Introduction

魚モデルはますますバイオメディカル研究用、しかし魚採用されている日常的に生態・生理学研究所の表層水の汚染を確認し、化学物質の毒性閾値を理解します。このような努力は、化学汚染が水生生物の生態系を損なうソース水の供給1,2の品質を危険にさらすことができるので重要です。商業、しかし、不足の化学薬品のほとんどは、基本的な毒性情報3 をも。

規制毒性試験で使用される伝統的動物モデルの試金はリソース集中型で、高スループットを提供できない初期層スクリーニング毒性試験 21 世紀4のために必要な。その後、採用し、利用することができますより迅速かつ効率的に画面の生物活動3、5の化合物の in vitroモデルの成長の原動力があります。基づくセルのモデルは、多くの機会を提示、彼らは生物学的複雑さに欠ける、したがって代謝6を含む多くの重要な全体の生物プロセスは考慮されません。

ゼブラフィッシュは、水生毒性、生態毒性7,8の代替モデルとして人気を得ている一般的な生体動物のモデルです。その小型サイズ、急速な発展と高産卵数を考えると、魚モデルは迅速かつ効率的に活性や全体の生物スケール9で毒性の化学物質をスクリーニングするために使用できます。自動トラッキング ソフトウェアの助けを借りて、ゼブラフィッシュ稚魚の行動毒性10,11の汚染物質をスクリーニングで強化された診断ユーティリティを提供します。創薬科学研究運動エンドポイント化学作用機序の形成ではないかどうか、表現型の動作に使用することができるかどうか、および、新規分子12、細胞内ターゲットを識別可能性があります暫定的ことを実証しています。 13。ゼブラフィッシュは生物医学の仔魚の人気モデルで、ヨシノゴチ ミノーがエコトキシコロジー研究され将来の間に使用される一般的な生態学的に重要な魚モデル (例えば、新しい化学評価) と回顧展 (例えば、周囲の表面水または排水排水監視) 環境アセスメント。残念ながら、ヨシノゴチ仔メダカの行動反応はゼブラフィッシュより著しく少ないの注目を集めています。私たちの継続的な研究 2 つの一般的な仔魚モデル ゼブラフィッシュとミノーを仔魚の遊泳パターン表示予想モードや多様な化学物質の作用メカニズムにユニークな示唆しています。したがって、行動のエンドポイントは、迅速かつ敏感に毒性の化学物質を調べると初期層の評価、特に中に産業化学物質やその他の汚染物質の細胞内ターゲットを識別するために可能性を提供します。

ここでは、仔魚の行動応答プロファイルを調べることのためのプロトコルを報告します。カフェイン、モデル neurostimulant、廃水処置次の食品の人間の消費から放電による水生システムの導入は、一般的な水生汚染物質を使用してこれらのメソッドを示す飲料とカフェイン14を配合した医薬品です。行動反応の両方幼虫ゼブラフィッシュとミノーはしばしばと呼ばれる photomotor 応答 (PMR) 萌芽期と幼虫の製薬の研究中に照明条件の急激な変化などでカフェインを調べたゼブラフィッシュ13,15。我々 はさらに各魚モデルの化学応答プロファイルを開発するいくつかの歩行エンドポイント間でカフェインの効果を識別します。本研究で使用されるカフェイン治療レベルは、カフェイン16の測定環境値に基づく暴露分布の上部の centiles を表します。我々 はベンチマーク仔魚 LC50値、および治療の危険値 (THV) における血漿中濃度血中治療用量で一貫性のある魚のために予想される水医薬品濃度の治療法があります。

Protocol

このプロトコルの研究は一般的に標準化された実験的設計に従う、米国環境保護庁ヨシノゴチ ミノー用 (EPA 号書 2000.0) と経済協力機構から統計解析ガイドラインを推奨し、ゼブラフィッシュの開発 (OECD 第 236)。これらの実験の計画 (例えばレプリケーションの増加) は、今後の研究の現在のプロトコル内で変更できます。条件に従って以前の魚文化は文学17掲載すべての実験手順と魚文化プロトコルの後ベイラー大学で承認機関動物ケアおよび使用委員会のプロトコル。 1. 化学治療に魚を公開します。 再構成の硬水でカフェインを溶解することによりカフェイン暴露ソリューションを準備します。高いカフェイン治療低カフェイン治療レベルを生成するハード水希釈することによって適切なシリアル希薄を実行します。注:表 1はこの実験で使用されている治療レベルのそれぞれをまとめたものです。 ゼブラフィッシュ ヨシノゴチ ミノー 治療 公称カフェイン濃度 (mg/L) 測定のカフェイン濃度 (mg/L) 治療 公称カフェイン濃度 (mg/L) 測定のカフェイン濃度 (mg/L) コントロール 0 < LOD コントロール 0 < LOD 75 Centile * 0.001 0.001 75 Centile * 0.001 0.001 95 Centile * 0.039 0.013 95 Centile * 0.039 0.009 99 Centile * 0.412 0.361 99 Centile * 0.412 0.310 へ THV 4.07 3.81 THV 4.07 4.12 10% LC50 48.46 46.66 10% LC50 14.1 14.7 40% LC50 193.82 186.67 40% LC50 56.38 53.91 表 1: ゼブラフィッシュとミノーの実験のための実験的カフェイン治療。それぞれの治療のためのカフェインの公称値と実測値が与えられます。* この研究で使用されるカフェイン治療カフェイン16の測定環境値に基づく暴露分布の上部の centiles を表します。THV: 治療の危険値です。LOD: 検出限界 個々 の露出 champers の調製した溶液を注ぐ。ヨシノゴチ ミノー暴露室の露出溶液 200 mL と 100 mL ガラス ビーカー露出ゼブラフィッシュ暴露室向けの 20 ml、500 mL ビーカーを使用します。 転送ピペットを使用して、各治療につき 4 つのレプリケート暴露室の 10 ゼブラフィッシュ胚高齢者 4-6 h ポスト受精 (hpf) を配置します。 場所 10 ヨシノゴチ ミノー幼虫は各処理ごとの 3 つの複製暴露室の孵化の 24 h 内高齢者。ヨシノゴチ ミノー幼虫のサイズに合わせて、転送前に転送ピペットの先端をカットします。 16:8 h: 明暗日長と 28 ± の一定した温度でゼブラフィッシュ実験を維持 1 ° Cヨシノゴチ ミノー研究、温度 25 ± で同じ日長政権を使用 1 ° C 化学物質の暴露の 96 時間後負荷 (ゼブラフィッシュ) の 48 と (ヨシノゴチ ミノー) の 24 つの井戸で個々 の魚もプレートに。 それぞれにもソリューションの等量含まれるためには、ウェルあたり 1,000 μ L のボリュームの 5,000 μ autopipette を使用して 48 ウェル プレートにゼブラフィッシュ幼虫を転送します。撤回し、ゼブラフィッシュ幼虫と露出の両方を転送、autopipette を使用してソリューション同時に。 サイズが大きいので転送ピペットを用いた切断先端ヨシノゴチ ミノー幼虫を転送します。ヨシノゴチ ミノー幼虫を個々 の井戸に転送する前に塗りつぶしは各 2,000 μ L、autopipette を使用します。個々 のヨシノゴチ幼虫を井戸に転送するときよくソリューションに転送ピペットの先端を置くし、ピペット先端から井戸に泳ぐ魚ができます。 2. ビデオ追跡パラメーターの校正 行動措置前にビデオ トラック ソフトウェアで観察および校正パラメーターを設定 (材料の表を参照してください)。 個人の少なくとも 1 の仔魚とレコーディング室にウェル プレートを配置します。校正パラメーターを設定するのに表現としてプレートと関連付けられた魚を使用します。 ビデオ トラック ソフトウェアでクリックして”ファイル |プロトコルを生成する”、これが「プロトコル作成ウィザード」ダイアログ ボックスを開きます。「場所数」フィールドに、個人の井戸ウェル プレートの番号を入力し、”OK”をクリックします。 画面の上部をクリックして”表示 |全画面モード”、ウェル プレートのオーバー ヘッド カメラ ビューを表示するシステムを要求されます。 3 つの多色図形として表示される「描画領域」アイコンをクリックします。ウェル プレート表示領域の右に「エリア」欄で円アイコンを選択します。 カーソルを使用して、円形追尾もウェル プレートの左上の領域を記述します。「右上マーク」を選択し、、右の井戸の上部の表示領域を説明します。よく右下に概要を説明する「下マーク」を選択します。注: 円形のアウトラインを描画した後の位置必要があります調整します。 アウトラインの位置を調整するには、「選択」をクリックし、アウトライン領域を移動するカーソルを使用します。また、「コピー」をクリックし、「貼り付け」をクリックしてしてアウトラインをレプリケートできます。 されます 左、上、右、上と下も右エリアを追跡が定義されている、自動的に残りの井戸の表示エリアを記述するソフトウェアを要求する「ビルド」をクリックします。 「校正」と表示されたエリアに「描画スケール」をクリックします。カーソルを使用すると、プレート間に水平線を描画します。線は、かつて「校正測定」というラベルの付いたダイアログ ボックスが表示されます。ウェル プレートの長さを入力し、”OK”をクリックします。 「描画領域」アイコンをクリックして図面マネージャーを終了します。 「タイル」アイコンをクリックします。 カーソルを使用して、表示画面で表示されるので、各ボックスは緑色ですべてのボックスを強調表示します。注: タイル アイコンが六つの個々 の小さな正方形のグループとして表示されます。 “表示をクリックして |全画面表示”. プレートの表示領域の右側に、「Bkg」「検知閾値」ボックスをオンにクリックします。しきい値調整バーを使用して、ピクセル検出しきい値を設定します。一度、適切なピクセルの閾値を選択、「グループに適用」をクリックします。注: このプロトコルを設定します検出しきい値ゼブラフィッシュ観測用黒モードで 13、110 ヨシノゴチ ミノー観測用透明モードで。 「移動しきい値」のボックスには、パラメーターを追跡目的の移動速度を入力します。速度パラメーターを設定した後は、「グループに適用」をクリックします。注: このプロトコルは、5 mm/s で 20 mm/s と非アクティブ/小動きで小さい/大きい動きを設定します。これらの選択は 3 つの異なる速度レベルで仔魚の動きを追跡するソフトウェア プログラム: アクティブでない (凍結) = 20 mm/s。 クリックして”パラメーター |プロトコル パラメーター」ドロップ ダウン メニューから。ダイアログ ボックスでは、選択の「時間」タブは、観測時間と積分時間を入力します。パラメーターを入力後、「Ok」をクリックします。 設定するのには、光/暗い日長時間と照度光ドライバーの設定ダイアログ ボックス「パラメーター」から「光運転」を選択することによりそれぞれの日長オープン ドロップ ダウン メニュー。注: は、複数の光暗い日長を設定するためのプロトコルのビデオを参照してください。 ビデオのトラッキング パラメーターを設定すると、観察のプロトコルを保存します。注: このプロトコルは、4 2 10 分光と 2 つ 10 分暗い期間から成る光/暗い段階の変更が続く 10 分順化相を含む 50 分にわたって魚の行動を観察します。積分時間は、50 分行動試験の各分の動作を測定するために設定されます。 3 仔魚の運動の観測と Photomotor の動作 行動記録室で実験的な魚を含むウェル プレートを配置します。 ビデオのトラッキング ソフトウェアで、ステップ 3 で作成した追跡プロトコルを開きます。 ビデオ追跡ビューアーですべての幼虫がコンピューターの画面に表示されていることを確認するために、その 1 つだけの個々 の幼虫、各ウェルに存在し 2.1.5 と 2.1.6 の手順で定義した観測エリア内にある個々 の井戸が整列することを確認します。 クリックして”実験 |」を実行します。注: システムは、観測データを保存する場所と名前を提供するためにユーザーに求めます。 一度名前と保存場所の観測データが指定されている、すべての定義済みの表示領域を強調表示する「いくつかのライブ画像」アイコンをクリックして注: このアイコンはコンピューター画面の上部にある、4 つの小さな正方形に分けるボックスとして表示されます。このアイコンをクリックすると、すべての定義済みの表示領域が強調表示されます。 録音室のパネルを閉じるをクリックして”背景 |コンピューターのモニター上を開始”。 4. 行動データの分析 仔魚の活動データを取得するには、トラッキング ソフトウェアで自動的にコンパイルされ、行動試験 (3.4 の手順) を開始する前に、ユーザーが指定したフォルダーには、スプレッドシートを開きます。 それぞれ図 1 aと1 b非公開ゼブラフィッシュとヨシノゴチ ミノー幼虫の素朴な自発活動の代表的な測定のために参照してください。PMR の計算は、調べるに暗いまたは光に暗い光遷移の動き違いの大きさが効率的に数字 1と1 Dを参照してください。 図 1:非公開ゼブラフィッシュ (AとB) と (CとD) ヨシノゴチ ミノー的な活動の例です。ゼブラフィッシュ (A) の平均値 (± SEM) 距離泳いだし、ヨシノゴチ ミノー (C) は活動の各代表 1 分間隔のドットによって与えられます。2 つの暗黒と 2 つの光 photomotor 応答期間を測定します。最後 (、c、e、および g) と最初 (b、d、f、h) 各日長の分は、ゼブラフィッシュ (B) PMRs Photomotor 応答の計算に使用され、ヨシノゴチ ミノー (D) は、最後の分の間 (±SEM) の平均距離の変化として測定されます。初期日長と次の期間の最初の分。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Representative Results

カフェイン治療レベルは、ゼブラフィッシュとメダカと 96 h 実験中にかなり変わらないでした。たとえば、表 1は、各治療レベルの解析的検証濃度を示します。このプロトコルは、同位体希釈液体クロマトグラフィータンデム質量分析法 (MS/LCMS) 一般に次の以前に報告された方法28によってカフェイン治療レベルの水サンプルを検証しました。パラキサンチン、カフェイン、主代謝物の形成の定量化をも行った。補足分析情報は分析手順の説明です。治療の名目と解析的検証の間の類似点のため公称治療レベルは、この原稿の残りの掲載されています。カフェインは、ゼブラフィッシュとミノーの動作を大幅変更。しかし、ゼブラフィッシュの運動反応は一貫してヨシノゴチ ミノーよりカフェインに敏感でした。ゼブラフィッシュとミノーの幼虫の最も敏感な行動エンドポイント 0.039 mg の濃度のカフェインの影響を受けた/L.表 2観察された効果低い濃度 (LOECs) と観測効果濃度 (NOECs) をまとめたもの魚の両方のモデルで各行動のエンドポイント。 ゼブラフィッシュ ヨシノゴチ ミノー エンドポイント LOEC (mg/L) NOEC (mg/L) エンドポイント LOEC (mg/L) NOEC (mg/L) 総距離暗い 0.412 0.039 総距離暗い − 56.38 総距離光 48.46 4.07 総距離光 − 56.38 ダーク カウントします。 0.412 0.039 ダーク カウントします。 − 56.38 合計数光 48.46 4.07 合計数光 − 56.38 距離ダークをバースト − 193.82 距離ダークをバースト − 56.38 バーストの光の到達距離 193.82 48.46 バーストの光の到達距離 − 56.38 ダーク カウント破裂 193.82 48.46 ダーク カウント破裂 − 56.38 破裂の数光 193.82 48.46 破裂の数光 − 56.38 バースト期間ダーク 193.82 48.46 バースト期間ダーク − 56.38 バースト期間光 − 193.82 バースト期間光 − 56.38 巡航距離暗い 0.412 0.039 巡航距離暗い − 56.38 巡航距離光 48.46 4.07 巡航距離光 − 56.38 ダーク カウント クルージング 0.412 0.039 ダーク カウント クルージング − 56.38 巡航の数光 48.46 4.07 巡航の数光 − 56.38 航続期間ダーク 0.412 0.039 航続期間ダーク − 56.38 航続期間光 48.46 4.07 航続期間光 − 56.38 暗い距離を凍結 0.412 0.039 暗い距離を凍結 0.039 0.001 光距離を凍結 0.039 0.001 光距離を凍結 − 56.38 凍結カウント暗い 0.412 0.039 凍結カウント暗い − 56.38 凍結カウント光 48.46 4.07 凍結カウント光 − 56.38 凍結期間が暗い − 193.82 凍結期間が暗い 56.38 14.10 凍結期間の光 48.46 4.07 凍結期間の光 − 56.38 暗い 1 PMR 48.46 4.07 暗い 1 PMR 0.039 0.001 1 PMR を光します。 48.46 4.07 1 PMR を光します。 − 56.38 暗い 2 PMR 48.46 4.07 暗い 2 PMR − 56.38 2 PMR を光します。 48.46 4.07 2 PMR を光します。 − 56.38 暗い 1 PMR の破裂 − 193.82 暗い 1 PMR の破裂 − 56.38 バースト ライト 1 PMR − 193.82 バースト ライト 1 PMR − 56.38 暗い 2 PMR の破裂 193.82 48.46 暗い 2 PMR の破裂 − 56.38 ライト 2 を破裂 PMR − 193.82 ライト 2 を破裂 PMR − 56.38 暗い 1 PMR をクルージング 48.46 4.07 暗い 1 PMR をクルージング − 56.38 クルージング 1 PMR の光 48.46 4.07 クルージング 1 PMR の光 − 56.38 暗い 2 PMR をクルージング 48.46 4.07 暗い 2 PMR をクルージング − 56.38 巡航光 2 PMR 193.82 48.46 巡航光 2 PMR 56.38 14.10 暗い 1 PMR を凍結 48.46 4.07 暗い 1 PMR を凍結 − 56.38 凍結光 1 PMR 193.82 48.46 凍結光 1 PMR − 56.38 暗い 2 PMR を凍結 48.46 4.07 暗い 2 PMR を凍結 − 56.38 ライト 2 を凍結 PMR 193.82 48.46 ライト 2 を凍結 PMR − 56.38 表 2: ゼブラフィッシュとオイカワの行動 NOECs とカフェインのため LOECs です。ない観察効果濃度 (NOEC) と最も低い観察効果濃度 (LOEC) (mg/L) の値はそれぞれ光/暗い水泳活動エンドポイントとカフェインにさらされているゼブラフィッシュとメダカの photomotor 応答。ダッシュを示し、影響は認められなかった特定のエンドポイントのすべての治療レベルに。 図 2は、自発運動量合計とカフェイン 96 h 暴露ゼブラフィッシュとミノーの PMRs を示します。PMRs は、ゼブラフィッシュよりも低い治療レベル (0.038 mg/L) でカフェインが著しく大きい photomotor エンドポイント数によって変更されたヨシノゴチ ミノー幼虫は、ゼブラフィッシュの影響を受けた。カフェイン (193.82 mg/L) の最高の治療レベルは、ゼブラフィッシュ、これらの反応が正反対で PMR を変更コントロールから。この高い治療レベルでただし、PMRs 暗闇の中で減少し、光の条件で増加しました。 図 2:スイミング活動とゼブラフィッシュ (AとB) とヨシノゴチ ミノー (CとD) カフェイン 96 時間暴露後の photomotor 応答。ゼブラフィッシュ (A) の平均値 (± SEM) 距離泳いだし、ヨシノゴチ ミノー (C) は活動の各代表 1 分間隔のドットによって与えられます。Photomotor ゼブラフィッシュ (B) とヨシノゴチ ミノー (D) に対する初期日長の last minutes と次の期間の最初の分の間平均 (± SE) 総距離の変化として測定されます。2 つの暗黒と光の期間 photomotor の 2 つの応答を測定しました。24 の合計 (4 レプリケートします各 6 幼虫) ゼブラフィッシュと 12 (3 レプリケートします各 4 幼虫) ヨシノゴチ ミノーは行動観察のために使用されました。p < 0.10;p < 0.05;p < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 幼虫 PMRs を測定に加えて 3 つの移動距離の速度しきい値、動きの動きの数と期間の間で光と闇の自発運動を行った。このデータは、カフェイン (図 3,図 1カスタマーインフォメーション センターの障害) の行動応答プロファイルを開発する使用されます。魚モデルの両方で、カフェインは抑制活動すべてで大幅自発エンドポイントが影響を受けます。両方の魚がなく、大幅にカフェインへの露出に続く破裂の速度しきい値で実証活動の増加をモデル化します。PMR 観測の結果と同様に、カフェインの影響ゼブラフィッシュ運動エンドポイント数が大きい。実際には、カフェインは大幅、THV の下環境に現実的なレベルで暗い条件の下でいくつかの運動応答を変更しました。ただし、ヨシノゴチ ミノー自発運動も、治療レベルでの光条件下であまり影響されなかった。 図 3: カフェイン 96 時間暴露後の幼虫のゼブラフィッシュとメダカの応答プロファイル。ゼブラフィッシュ暗い (A) と軽い (B) に比べてカフェイン 96 時間暴露後ヨシノゴチ ミノー暗い (C) と (D) の光活性を意味する活動を意味します。データを表すアクティビティ 2 10 分暗い日長と魚モデルごとに 2 つの 10 分光日長をプロットします。各図では 0 の軸で表されるコントロールに、データを正規化します。行動パラメーターを含める距離 (カウント) の動きの数と各運動の期間破裂 3 の速度レベルを泳いで渡った (> 20 mm/s)、巡航 (5-20 mm/s)、及び凍結 (< 5 mm/s)。速度しきい値の各運動パターンに加えて、総距離が泳いで、動きの合計数が表されます。↑ はコントロールと比較して活動が大幅に増加を表し、↓ コントロールに比べて活性の有意な減少を示します。24 の合計 (4 レプリケートします各 6 幼虫) ゼブラフィッシュと 12 (3 レプリケートします各 4 幼虫) ヨシノゴチ ミノー各グループで行動観察に使用されています。p < 0.10;p < 0.05;p < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 補足図 1:Photomotor ゼブラフィッシュ (AとB) と 3 つの速度しきい値を越えてヨシノゴチ ミノー (CとD) の応答。ゼブラフィッシュ (A、B、および C) と 3 つの速度のしきい値間でのオイカワの幼虫 (D、E、および F) photomotor 応答をヨシノゴチ (凍結: 20 mm/s) カフェイン 96 時間暴露後。ゼブラフィッシュとの Photomotor 応答は、初期日長の last minutes と次の期間の最初の分の間平均 (±SE) 総距離の変化として測定されます。2 つの暗黒と光の期間 photomotor の 2 つの応答を測定しました。24 の合計 (4 レプリケートします各 6 幼虫) ゼブラフィッシュと 12 (4 幼虫 3 複製) ヨシノゴチ ミノーは行動観察のために使用されました。* p < 0.01このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

Discussion

行動毒性学研究のための化学処理レベルを選択すると、いくつかの要因が考慮されなければなりません。本研究ではカフェインの治療レベルは、排水放流16から予測環境ばく露シナリオの上部 centile 値に基づいて選ばれました。可能であれば、我々 は日常的に環境観察19,20,21の確率的曝露評価を用いた水生毒性研究の治療レベルを選択します。薬の計り知れないですの THV にも本研究の治療レベルとして収録されました。THV 値 (式 1)22,23魚23医薬品のヒト臨床用量 (Cmax) まで予測水濃度として定義されます、モデリングの努力24、初期のプラズマから触発され、分配係数 (式 2)25血: 水化学に基づいて計算されます。

THV = Cmax /ログ PBW (式 1)

ログ PBWログを = [(100.73 ログ Kow · 0.16) + 0.84] (式 2)。

ここでは、我々 はまたゼブラフィッシュとミノー LC50 値を基準にして致死治療レベルを選択します。我々 は複数の化学物質で魚のモデルと特定の動作のしきい値を比較するときに特にはこのアプローチの行動反応に有用なベンチマークの手順を検討します。さらに、急性水生毒性の解明、評価で診断に有用することができます慢性的な比率の計算を容易にします。LC50 値は、手順 2.1 は、標準化されたガイドラインに従う予備毒性生物検定から得られました。

このプロトコルでは一般的な実験的デザインを採用し、米国 EPA と OECD 魚モデルの毒物学のための標準化された方法が推奨する統計的手法です。我々 はp値を報告 (e.g、< 0.01、< 0.05、< 0.10)、有意差 (α = 0.10) 活動レベルは顕れた場合、分散分析 (ANOVA) を使用して識別されます正規性および分散の仮定の等価性。満たされています。Dunnett のまたはテューキー HSD の事後テストは、治療レベルの違いを識別するために実行されます。我々 はこのアルファを選択 (α = 0.10) 初期層試金およびとき重要な生物学的効果の大きさの理解が限られて流行動エンドポイントおよびモデル生物26の代りのために特に、タイプ II のエラーを減らすために値多重比較のための生物医学のより一般的な手順を採用 (e.g。、RNA シーケンス データのボンフェローニ補正)27。 将来の研究は、これらの行動応答の変動を理解し、可能性のある実験計画 (例えば、増加レプリケーション) を適宜変更する必要です。

いくつかの要因は、化学物質の暴露だけでなく稚魚の行動に影響を与えます。たとえば、日、年齢、よくサイズ、温度、照明条件、各井戸を表す重要な考慮事項11,30露出ソリューションの量の時間です。これらの理由から、実験中に仔魚の行動に影響を与えることができる外部要因の影響を最小限に抑えるために講じる必要があります。行動観察は、狭い時間 windows (3 に 4 h) で、幼虫の歩行動作11に最小限の影響日効果の時間を予想するときの期間にわたって実行必要があります。さらに、一貫性のある温度 (28 ± 1 ° C、ゼブラフィッシュ) と 24 ± 1 ° C、FHM は暴露期間中低温インキュベーターで定義された明暗サイクルの仔魚の維持が必要があります。さらに、行動の記録、研究室の温度は動に及ぼす温度の影響を避けるために実験条件を近似条件を維持しなければなりません。さらに、行動観察の中に使われていた井戸は、それぞれ個々 の魚について一貫性のあるボリュームで維持しなければなりません。

幼生や胚のゼブラフィッシュ小説12,13を化合物の潜在的な治療上のターゲットを識別するために以前 PMRs 生体医学で使用されています。このプロトコルは環境汚染物質の化学的活性を調査する 38 のエンドポイントを用いたゼブラフィッシュと以前の行動研究を拡張します。カフェインはアクション (MoA) の理解のメカニズムを有する一般的な水生汚染物質が、商業的に多くの化合物は、機構の重要なデータを欠いています。したがって、このプロトコルは商業化学物質39を含む毒性データに欠けている化合物 2442億の洞察力を得るために用いることができます。さらに、プロトコルは、最も一般的に使用される魚モデルの 2 つのメソッドを提供します。前述のとおり、ゼブラフィッシュは毒性でますます人気になっている一般的な生体魚モデル、ミノーは環境アセスメント用生態学的なモデルとして使われませんが受けたヨシノゴチゼブラフィッシュと比較して自動化されたシステムと行動研究で注目は比較的少ない。魚行動毒性学研究法の標準化された規制は特にありません、このプロトコルの今後の取り組みをサポートするためのアプローチを提供します。

カフェインは、水生環境16で検出されたレベルで魚モデルのそれぞれの行動応答を引き出した。ロドリゲス ギルら2018 は、カフェイン16の測定値に基づく水生システムのグローバル環境暴露ディストリビューションを開発しました。具体的には、予測された排水排水濃度の 95% は、(表 2) 本研究でのオイカワのゼブラフィッシュとヨシノゴチのエンドポイントに最も敏感な行動、LOECs 以下でしょう。カフェインのいくつかの行動の効果は、環境に関連するレベルで (特にで暗い) ゼブラフィッシュのみがわかりにくいこれらの動作を変更可能性があります自然の魚の個体数は、の結果か生態学的重要な副作用。敏感な診断のスクリーニング目的のために役に立つ、仔魚行動しきい値は他の生活史段階の自然集団における魚の代表をできない場合があります。さらなる研究を保証と同様かどうかを決定する行動応答しきい値だろう自然に発生して生物学的組織の個人または人口レベルで副作用の兆候であります。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、米国国立科学財団によって提供されたサポート (# プロジェクト: チェ 1339637) 米国環境保護庁からの補助をします。演習全般サポート、博士 Jone コラレス、博士ローレン Kristofco、ギャビン サーリ、サミュエル ・ ハッダード、掲示 Burket とブリジット ヒルに感謝します。

Materials

ViewPoint Zebrabox ViewPoint ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations
Caffeine Sigma-Aldrich C0750-100G Study chemical
Incubator VWR 9110589 Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments
Incubator Thermo Fisher Scientific 35824-636 Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments
100 ml glass beakers VWR 89000-200 Zebrafish exposure chambers 
500 ml glass beakers  Pyrex EW-34502-03 Fathead minnow exposure chambers
5000 µl auto-pipette Eppendorf Research 5000 Used to fill individual wells in well plates
Transfer Pippettes VWR 414-004-004 Used to transfer study organisms 
48-well plates Fisher Scientific 08-772-52 Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates VWR 10062-896 Larval fathead minnow behavioral recording chambers
Calcium sulfate dihydrate Sigma-Aldrich C3771 For reconstituted hard water
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506 For reconstituted hard water
Sodium Bicarbonate  Sigma-Aldrich S5761 For reconstituted hard water
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 For reconstituted hard water
z-mod recirculating system Marine Biotech Systems Recirculating system to maintian zebrafish cultures
Statistical analysis software Sigma Plot  Version 13.0 Used to analyze beahvioral data and produce figures
Statistical analysis software Graphpad Prism Prism 5 Used to produce figures 
Autosampler/quaternary pumping system Agilent Technologies Infinity 1260 model  Analytical verification of caffeine treatment levels
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source Agilent Technologies Analytical verification of caffeine treatment levels
Triple quadrupole mass analyzer  Agilent Technologies Model 6420 Analytical verification of caffeine treatment levels
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7)  Agilent Technologies 685775-914T Caffiene chromatography 
MassHunter Optimizer Software  Agilent Technologies Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6
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References

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Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine. J. Vis. Exp. (137), e57938, doi:10.3791/57938 (2018).
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