Yalıtım ve mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri çok yıllık çim deneylerde Analizi
Summary
Kazı alanından bitki köklerinin yanı sıra endosphere, rizosferde ve toprak içine örnekleri işleme DNA ekstraksiyon ve veri analiz yöntemleri de dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu kağıt bu teknikleri toprak, endosphere ve rizosferde microbiomes çalışma için kullanmak diğer laboratuvarlar sağlamak için tasarlanmıştır.
Abstract
Bitki ve toprak microbiome çalışmalar rolleri mikroorganizmaların tarımsal verimlilik oynamak anlamak için giderek daha önemli hale gelmektedir. Bu yazının amacı hızla toprak, rizosferde ve endosphere çoğaltılmış alan çalışmaların örnek ve örnek türü, tedavi ve bitki genotip nedeniyle mikrobiyal toplumlarda ortaya çıkabilecek değişiklikleri analiz konusunda ayrıntı sağlamaktır. Bu yöntemleri göstermek için kullanılan deney ve çoğaltılmış alan araziler iki, saf, içeren sıcak-sezon çimenler oluşur (Panicum virgatum ve Andropogon gerardii) ve düşük-çeşitlilik ot karışımı (A. gerardii, Sorghastrum nutans, ve Bouteloua curtipendula). Kısaca, bitkiler kazılan, kökleri çeşitli kesmek ve fosfat tampona yerleştirildikten ve rizosferde toplamak için sarsıldı. Kökleri buz ve çamaşır suyu ve etanol (alkol) ile sterilize yüzey üzerinde Laboratuvar götürülür. Rizosferde filtre ve Santrifüjü tarafından yoğunlaşmıştır. Kök topu çevresinde kazılan topraktan plastik torbalar içine yerleştirilir ve laboratuara toprak az miktarda DNA çekimi için nerelere getirdi. DNA kökleri, toprak ve rizosferde çıkarılan ve V4 bölge 16S rRNA gen için astar ile güçlendirilmiş. Amplicons sıralı sonra açık erişim Biyoinformatik araçları ile analiz. Bu yöntemler araştırmacılar nasıl mikrobiyal topluluk çeşitlilik ve kompozisyon örnek türü nedeniyle, tedavi, değişeceğini test etmek izin ve genotip bitki. İstatistiksel modeller yanı sıra bu yöntemleri kullanarak, temsilcisi sonuçları kökleri, rizosferde ve toprak mikrobiyal toplumlarda önemli farklılıklar göstermektedir. Burada sunulan yöntemleri alan örnekler toplamak, ayırma, ayıklamak, ölçmek, yükseltmek ve DNA dizisi adımlar komple bir kümesini sağlar ve mikrobiyal topluluk çeşitlilik ve çoğaltılmış alan denemeler bileşiminde analiz.
Introduction
Microbiome araştırma anlama ve besin bisiklet, organik madde devir oranı ve geliştirme veya toprak patojenleri1,2inhibisyonu gibi ekosistem süreçleri değiştirmek için önemli sonuçları vardır. Bu alanda araştırma da toprak mikroplar doğal bitki toplulukları ve agroecosystems verimliliği üzerine etkileri anlamak için büyük bir potansiyele sahiptir. Doğal ekosistemler toprak microbiome odaklı olması birçok çalışma olmakla birlikte, daha az sayıda bitki rizosferde ve endosphere mikroplar agroecosystems3üzerinde odaklanmıştır. Nebraska’da, tarım tarım önemli bitkileri araştırma için hayati bir konu nerede yetişir bu topraklar çalışmaları yapma devletin büyük parçalar arasında manzara hakim. Bu yöntemleri kağıt amacı araştırmacılar agroecosystems içinde mevcut mikroplar nasıl bitki kökleri mikrobiyal topluluklar rizosferde ve endosphere ve sonunda değiştirmek belirlemek için açıklamak için iletişim kuralları standart kümesi sağlamaktır Bu mikropların toprak sağlık ve bitki verimlilik oynamak işlevleri anlamak.
Burada sunulan Yöntem biraz diğerleri bu kağıt hangi mikrop öğrenme hedefleniyor4,5 ‘ te yalnızca iç kök ve nasıl onlar mikrop hemen dışında kök dizininde farklı tarafından kullanılan yöntemleri farklıdır rizosferde. Bu çalışmada kullanılan amplicon sıralama DNA örneğinde buldu mikrobiyal özellikleri tanımlar ve müfettişler nasıl topluluklar örnek türü veya tedavi bağlı olarak değiştiğini belirlemek izin verir. Bu iletişim kuralı ve Lundberg vd tarafından kullanılan bir çok benzer iletişim kuralı arasındaki önemli farklar biri 6 sonication yerine, bu iletişim kuralını yüzey sterilizasyon çamaşır suyu ve etanol ile rizosferde kökleri kaldırmak için kullanmasıdır. Diğerleri de etkili bir şekilde yüzey sterilizasyon kullandık7,8,9,10. Bu yöntemler biraz farklı ama diğer yöntemlere göre daha avantajlı değildir. Yeterli sayıda kişi ile endosphere, rizosferde ve toprak bölümlenmiş seçtiğinizde yaklaşık 450 örnekleri kadar ekler günlük 150’den fazla alan araziler işlemek mümkündür çünkü bu yöntemler özellikle de büyük sahada yapılan deneyler için uygundur. Bu el yazması alanında örnek, laboratuvar malzeme işlemek, hulâsa ve DNA dizisi için kullanılan yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar ve sonuç sıralama verileri çözümlemek için adımları kısa bir genel bakış sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazması açıklanan yöntemler bilim adamları kolayca toprak ve bitki metagenomics alana girmek izin vermesi gerekir. Yıllar boyunca, biz bu el yazması açıklanan deney beri bizim yöntemleri iyileştirdiyseniz. Biz şimdi tüpler için örnek alana dışarı çıkmadan önceden etiket bu bir değişimdir. Laboratuarımızın barkodlama sistemi ve bir etiket yazıcısı kullanır. Etiket yazıcısının sadece ne zaman etiketleme tüpler, ama aynı zamanda daha kolay izlemek ve doğru örnekleri olmadan insan el yazma kaprisleri tanımlamak için her şeyi yapar zaman kazandırır. Başka bir kritik nokta bu geri alandan en kısa zamanda getirdikten sonra malzeme işlemek çalışıyoruz olduğunu. DNA analizi için kullanılan toprak dondurmak, sterilize ve kökleri, donma ve filtre ve tarladan döndükten sonra 12-36 saat içinde rizosferde dondurmak hedefliyoruz. Biz DNA ekstraksiyon protokolleri için zamanında eller en aza indirir, tanıttı insan hatası azaltır bir robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) satın böylece DNA ekstraksiyon yordamları adım, özellikle için toprak ve rizosferde, uzun, ve tutarlılık içinde çok farklı geliştirir toplu toprak, kökleri veya rizosferde işlenir. Bitki materyali ile çalışırken belirlenmesi için ya da bir “temsilcisi örnek” almak için kök türü almak kök türüne karar vermek önemlidir. Kökler ve DNA çekimi iletken 96-şey DNA ekstraksiyon plakaları doldururken örnekleri arasında çapraz bulaşma olduğunu kontrol ettikten gibi önemli olduğunda donmuş bir durumda bırakır. Başka bir önemli faktör dikkate tasarımı sahada yapılan deneyler ve tam bir kullanarak tasarım mümkünse randomize kullanılacak çoğaltır sayısıdır26. Yüksek alan değişkenlik nedeniyle çok sayıda küçük farklılıkları algılamak için çoğaltır gerekli olabilir. Son olarak, deneyimlerimizden toprak kazı kökleri çok ıslak değildir emin olmak önemlidir. Toprak su ile doygun Eğer sadece çalışmak zor bir durum değil ama çok da rizosferde tanımlamak ve toprak kökleri kaldırmak için zordur.
Erken bu yöntemlerin geliştirilmesi sırasında yapılan bir değişiklik el ile çalışma alanı ve daha kolaylaştırmak için bir gaz jeneratör tarafından desteklenmektedir vortexers için yükseltilmiş rizosferde serbest bırakmak için tüpler sallayarak yerine açısından standart yapıldı. zaman ve şekilde her tüpün tedirgin. Amplicon sıralama yaklaşım bir sınırlama sonuçları taksonomik çözünürlüğe genellikle sınırlıdır ve birçok OTUs aile veya cins düzeyinde bilinmeyen veya yalnızca bilinen olmasıdır. Özellikle sonuçları çözünürlüğü artırabilir veri analizi için yeni ve gelişmekte olan yaklaşımlar haberdar olmak önemlidir bu alanda araştırma hızla gelişmektedir.
Bu sadece eğitim için bakteri ve Arkeler, değil mantar kurallarıdır. Amplifikasyon için farklı astar kullanılması mantar toplulukları aynı DNA örnekleri27,28kullanarak çalışma için izin verir. Yöntemleri basitleştirilmiş olabilir çünkü bu yöntemler satın alma donanımları büyük miktarda gerektirmez. Yöntemleri tarif biz burada esas olarak “kim var orada” belirlemek için ama alanını hızlı bir şekilde av tüfeği sıralama yöntemlerle, yalıtım ve işlevselliğini test ele alınması işlevi hakkında önemli soru sormayı içine gelişmektedir mikroplar veya sıralama bütün mikrobiyal genleri.
Temsilcisi sonuçları açıklanan yöntemleri kullanarak tanımlanan mikrobiyal topluluklar farklılıkları vurgulayın. Veri Analizi22bir beta-çeşitlilik yaklaşım kullanarak, kompozisyon farklılıklar arasında örnek türleri gösterilmiştir. Bu fark açıkça gözlemlenmiştir nerede endosphere, rizosferde ve toprak benzersiz mikrobiyal topluluklar3içeren diğer çoğu çalışmalarda. Shannon çeşitlilik Dizin bereket ve sakin endosphere, rizosferde ve toprak her bitki türü içinde mevcut mikrobiyal türlerin belirlemek için hesaplanır. Bu çalışma ve diğerleri gösterildiği gibi alfa çeşitlilik biraz rizosferde azalan ve sonra önemli ölçüde azalan içinde endosphere3,5,29topraktaki yüksek olur. Bu sonuçlar yöntem tanımlamak burada endosphere, rizosferde ve toprak kompozisyon değişiklikleri tanımlamak için uygun olduğunu gösteriyor.
Proteobakteriler hakimiyeti endosphere ve toprak30,31,32üzerinde çalışmalarda ortak bir bulgudur. Endosphere genel olarak daha düşük bir mikrobiyal türlerin çeşitliliğinin bakteridaha yüksek bir göreli bereket ile vardır. Bu tekrar sonuçları buraya diğer bulgular literatür temsilcisi olduğunu vurgular. Bu çalışmada tedavisinin etkileri önemli ölçüde farklı değildi ve bu iki önemli nedeni olabilir tedaviler tarafından dayatılan farklılıkları algılamak için yeterli varyasyon oluşturmak için yeterince büyük değildi ve bu örnekleme sonunda yapıldı Sezon ne zaman alanları olan ne sezon sonunda ölçüldü benzer seviyelere azot çekmek için yeterli zaman vardı olabilir, büyüyen. Daha uzun bir süre boyunca benzer fertilizasyon oranları kullanarak başka bir çalışmada sadece nispeten küçük değişiklikler microbiome bileşiminde ölçülen33edildi. Diğer çalışmalar değişiklikler nedeniyle Azot Gübre34,35mantar ve bakteri topluluklarda göstermiştir.
Onların microbiomes3,32,36 belirlenmesinde rol oynamak için bilinen bitki türleri ve farklı bitki genotip içinde arasında gösterdi mikrobiyal topluluk varyasyon bile küçük farklılıklar bir tek tür37. Bu çalışmada, mikrobiyal topluluk kompozisyon önemli bir fark bitki türleri arasında bulundu. Tüm örnek türlerinde göründüğü en farklı mikrobiyal kompozisyon switchgrass vardı ama türler arasındaki farklar sadece içinde endosphere istatistiksel olarak anlamlı değildi. Rizosferde topluluk kompozisyon daha fazla çoğaltır çözümlemesi için kullanılabilir Eğer önemli hale gelebilir.
Kombine alan, laboratuvar ve analitik protokoller burada açıklanan ne kadar farklı faktörler etkisi çalışmak için güçlü bir yöntem mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri36endosphere bileşimi sağlar. Büyük bir microbiomes, özellikle tarım alanlarındaki eğitim alanında yapılması gereken işler var. Nasıl verimleri toprak microbiome tarafından değiştirilmiş hakkında önemli sorular henüz tam aydınlatılmamıştır gerekiyor. Nasıl ürün rotasyonu etkisi toprak microbiome, nasıl microbiome zamanlama değiştirir, nasıl abiyotik stres ile ilgili bile en temel soru değiştirir microbiome microbiome değiştirmek için bu faktörler ile toprak tipi etkileşir nasıl ve olup olmadığını bazı bitkileri veya bölgelerde ABD’nin evrensel mikroplar tüm açık sorular vardır. Bu yöntemler aynı zamanda varlığı ve sebat yararlı ve patojenik bakterilerin tanımlamak epidemiyolojik çalışmalar için faydalı olacaktır. Başka bir gelecek horizon bu yöntemler için DNA yöntem tanımlamak burada bitki ve mikrop RNA ve metaboliti veri ile entegre başlatmak için olacak. Ek iyileştirme ve daha fazla değişkenlerinin test bu protokollerin duruma getirilmesi için daha da önemli olacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu el yazması geliştirilmesi kök ve Rhizobiome Yenilik Ödülü OIA-1557417 Ulusal Bilim Vakfı EPSCoR Merkezi tarafından desteklenir. Veri toplama fonları Nebraska Üniversitesi-Lincoln, Tarımsal Araştırma ve geliştirme ve USDA bir Hatch hibe tarafından desteklenmiştir. Biz de USDA ARS desteğinden kabul ve destek tarım ve gıda araştırma girişimi rekabetçi Grant No 2011-68005-30411 tarafından kurmak ve bu alanları yönetmek için USDA Ulusal Enstitüsü Gıda ve tarım sağlandı.
Materials
| Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 12955-4 | Extraction kit for soil and rhizosphere |
| Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 13496-4 | Extraction kit for roots |
| D-Handle Digging shovel, 101 cm L | Fiskars | 9669 | |
| Rapid Tiller, 40 cm L | Truper | 34316 | |
| Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm | Ziploc | NA | |
| Cooler | Any | NA | |
| Wash pan | Any | NA | |
| Plastic bucket | Any | NA | |
| Gloves (work and lab) | Any | NA | |
| 20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-8FS | |
| 20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-4FS | |
| portable generator | Honda brand works well | NA | |
| Sterile cell strainers 100 μm mesh size | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| NaH2PO4·H2O | VWR | 0823 | |
| Na2HPO4 | VWR | 0404 | |
| Silwet L-77 | Lehman Seeds | VIS-30 | Surfactant |
| Autoclaves | Any | NA | |
| Drying Oven | Any | NA | |
| Scale | Any | Any | |
| Bleach | CLOROX – household strength | NA | |
| Tween 20 | Any | NA | |
| Liquid Nitrogen | Any | NA | |
| Dry Ice pellets | Any | NA | |
| Ethanol | Any | NA | |
| 11 cm precision fine point tweezers | Fisher | 17456209 | |
| 18 cm Straight point specimen forceps | VWR | 82027-436 | |
| 13.5 cm Pruning Scissors | Fiskars | 9921 | |
| 2 mL tube | Any | NA | |
| 15 mL PP conical tube | MIDSCI | C15B | |
| 50 mL PP conical tube | MIDSCI | C50B | |
| Ultrapure water | Millipore-sigma | Milli-Q Integral, Q-POD | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | For DNA quantification of removed samples |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | For DNA quantification |
| 96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates | Corning | 3631 | |
| pPNA PCR Blocker | PNA Bio | PP01-50 | |
| mPNA PCR Blocker | PNA Bio | MP01-50 | |
| Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing | BEI Resources | HM782D | |
| Adhesive 8 well-strips for plates | VWR | 89134-434 | |
| Stainless steel beads, 3.2 mm dia | Next Advance | SSB32 | |
| 1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) | CoStar | 3959 | |
| antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere | TWD Tradewinds, INC | ASWF1SPK | |
| antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf | TWD Tradewinds, INC | ASWFXSCS | |
| Genie 2 Digital Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex adapter for 50 mL tubes | Scientific Industries | SI-H506 | |
| Mortar (100 mL) and pestle | Any | NA | |
| Metal micro-spatula | VWR | 80071-672 | |
| Disposable antistatic microspatulas | VWR | 231-0106 | |
| Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) | Duro | 18402 | |
| 5424 Centrifuge for 2 mL tube | Eppendorf | 22620461 | |
| Centrifuge for 96-well plate | Sigma4-16S | 81510 | |
| Centrifuge rotor for 50 mL tubes | Sigma4-16S | 12269 – Biosafe | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | Kapa Biosystems |
References
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).
- Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7 (1), 15019 (2017).
- White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).
- Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
- Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).
- Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).
- Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).
- Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87 (2014).
- Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
- Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688 (1949).
- Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
- Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).
- Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , 1-212 (2009).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
- Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151 (2016).
- O’Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).
- Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).
- Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349 (6250), 860-864 (2015).
- Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950 (2014).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).
- Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).
- Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5 (7), e11915 (2010).
- Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).
