Изоляция и анализ микробных сообществ в почве, ризосфере и корни в экспериментах многолетние травы
Summary
Раскопки корни растений от поля, а также обработки образцов в ризосфере, endosphere и почвы описаны в деталях, включая ДНК извлечения и анализа методов данных. Этот документ предназначен для включения других лабораторий использовать эти методы для исследования почвы, endosphere и microbiomes ризосфере.
Abstract
Микрофлора исследования растений и почвы становятся все более важными для понимания роли микроорганизмов счетчик производительности в сельском хозяйстве. Эта рукопись предназначен для предоставления сведений о том, как быстро образец почвы, ризосфере и endosphere реплицированных полевых испытаний и анализировать изменения, которые могут произойти в микробных сообществ из-за образец типа, лечение и генотип растений. Эксперимент, используемый для демонстрации этих методов состоит из участков реплицированных поля, содержащие два, чистый, теплый сезон травы (просо заострённая и Бородач Жерара) и низким разнообразие травосмеси (A. Жерара, Sorghastrum поникший, и Bouteloua curtipendula). Вкратце раскопки растений, различные корни вырезать и помещаются в фосфатного буфера и затем потряс собирать ризосфере. Корни были привлечены в лабораторию на льду и поверхности, стерилизованное с отбеливателем и этанола (EtOH). Ризосфере фильтруется и сосредоточены центрифугированием. Выемки грунта вокруг корневого кома из помещаются в пластиковые мешки и принес в лабораторию, где небольшое количество почвы берется для экстракции ДНК. ДНК извлекается из корней, почвы и ризосфере и затем усиливается с праймерами для региона V4 гена 16S рРНК. Ампликонов последовательности, а затем проанализированы с открытым доступом Биоинформатика инструменты. Эти методы позволяют исследователям для тестирования, как многообразие микробных и состав изменяется из-за образец типа, лечение и завод генотипа. Используя эти методы, а также статистические модели, представитель результаты показывают, что существуют значительные различия в микробных сообществ корни, ризосфере и почвы. Представленные здесь методы предоставляют полный набор шагов для как собирать образцы поле, изолировать, извлекать, количественно, усиливают и последовательности ДНК и анализировать многообразие микробных и композиции в реплицированной полевых испытаний.
Introduction
Микрофлора исследования имеет важные последствия для понимания и манипулирования экосистемных процессах таких питательных Велоспорт, оборот органического вещества и разработки или ингибирование почву патогенов1,2. Эта область исследований также имеет большой потенциал для понимания воздействия микробов почвы на продуктивность естественных растительных сообществ и агроэкосистем. Хотя существует множество исследований, которые были сосредоточены на почве микрофлора в естественных экосистемах, меньше сосредоточились на завод ризосфере и endosphere микробы в агроэкосистемах3. В штате Небраска сельское хозяйство доминирует пейзаж через большие части государства, делая исследования этих почв, где аграрно важные культуры выращиваются жизненно важной темой для исследования. Цель этой методы документа — предоставить стандартный набор протоколов для описания микробов, присутствующих в агроэкосистемах, чтобы определить, как корни растений изменить микробных сообществ в ризосфере и endosphere и в конечном итоге исследователи понимаете функции, которую эти микробы играть в производительности растений и здоровья почвы.
Метод здесь представлены незначительно отличается от методов, используемых другими5 4,в, что этот документ направлен на изучение которых микробы являются исключительно внутри корень и как они отличаются от микробов сразу за пределами корень в ризосфере. Ампликон последовательности, используемое в настоящем исследовании идентифицирует микробной таксонов в образец ДНК и позволяет детективов, чтобы определить, как общины меняется в зависимости от типа образца или лечения. Одним из ключевых различий между этим протоколом и очень подобный протокол, используемый в Лундберг и др. 6 , что вместо sonication, этот протокол использует поверхности стерилизации с отбеливателем и этанола для удаления ризосфере от корней. Другие также использовали поверхности стерилизации эффективно7,8,9,10. Эти методы не являются более выгодным, чем другие методы, но немного отличается. Эти методы являются особенно хорошо подходит для крупных полевых экспериментов, потому что с достаточно людей можно обрабатывать более 150 поле сюжетов в день, который добавляет до приблизительно 450 образцов когда разделена на endosphere, ризосфере и почвы. Эта рукопись подробно описывает методы, используемые для образца в поле, обработки материала в лаборатории, извлекать и последовательности ДНК и предоставляет краткий обзор шагов для анализа полученных данных последовательности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, описанные в этой рукописи должны позволить ученых легко ввести поле метагеномики почвы и растений. С годами мы уточнили наши методы после проведения эксперимента, описанные в этой рукописи. Одно из изменений является, что мы сейчас предварительно метки трубы перед выходом в поле образец. Наша лаборатория использует систему штрихкодирования и принтер этикеток. Принтер этикеток не только экономит время, когда маркировки труб, но и делает все проще отслеживать и правильно определить образцы без капризов человека почерк. Другой критической точки является, что мы пытаемся обработки материала, после чего он вернулся из поля как можно скорее. Мы стремимся заморозить почва, используемая для анализа ДНК, стерилизовать и заморозить корни и фильтровать и заморозить ризосфере 12 до 36 часов после возвращения из поля. Процедуры экстракции ДНК длительных с много шагов, особенно для почвы и ризосфере, поэтому мы купили робот (Kingfisher Flex, ThermoFisher), который минимизирует руки на время протоколы извлечения дна, уменьшает человеческой ошибки, которые могут быть введены, и улучшает последовательность в пути разные пакеты почвы, корни или ризосфере обрабатываются. При работе с материалом растений важно решить в корневом типе изучаться или принимать различные типы корневых получить «репрезентативной выборки». Корни и листья в замороженном состоянии при проведении экстракции ДНК имеет важное значение, как обеспечить есть нет перекрестного загрязнения между образцами при заполнении пластины извлечения ДНК 96-луночных. Еще один важный фактор, чтобы рассмотреть это количество реплицирует использоваться при проектировании полевых экспериментов и используя полный рандомизированных дизайна там, где это возможно26. Из-за изменчивости высокой поля может быть необходимо иметь большое количество реплицирует обнаружить небольшие различия. Наконец из нашего опыта важно убедиться, что почвы не слишком мокрая, при раскопках корни. Если почва насыщена водой это не только запутанна, чтобы работать с, но это также очень трудно определить ризосфере и устранить почву от корней.
Одно изменение, которое было сделано на раннем этапе в ходе разработки этих методов было вместо пожимая трубки вручную, чтобы освободить ризосфере, которую мы повышен до vortexers, питание от газогенератора для облегчения работы в поле и более стандартизированы по образом, что каждая трубка был взволнован и время. Ограничение ампликон последовательности подхода состоит в том, что таксономический резолюции результаты зачастую ограничен и многие OTUs неизвестных или единственный известный на уровне семьи или рода. Это поле исследований быстро развивается, поэтому очень важно быть в курсе новых и развивающихся подходов, особенно для анализа данных, которые могут повысить разрешение результатов.
Эти протоколы являются только для изучения бактерий и архей, не грибов. Использование различных Праймеры для усиления позволит исследование грибковых общин с использованием же ДНК образцов27,28. Эти методы не требуют приобретения большого количества оборудования, потому что методы могут быть упрощены. Методы, мы опишем здесь в основном для определения «кто там», но поле быстро превращается в задавать важные вопросы о функции, которые могут решаться с помощью методов секвенирования ружье, изоляции и тестирование функциональных возможностей микробы, или последовательности всей микробных геномов.
Представитель результаты подчеркивают различия в микробных сообществ, которые могут быть определены с помощью методов, описанных. С помощью бета разнообразие подход к анализу данных22, были показаны композиционные отличия между типами образца. Эти различия были четко прослеживается в большинстве других исследований, где endosphere, ризосфере и почвы содержат уникальные микробных сообществ3. Шеннон разнообразию индекс рассчитывался определить изобилие и равномерность микробных видов в рамках каждого вида растений в endosphere, ризосфере и почвы. Как показано в этом исследовании и во многих других странах, альфа-разнообразие является самым высоким в почве, слегка уменьшаясь в ризосфере и затем значительно уменьшается в endosphere3,5,29. Эти результаты показывают, что описанные здесь методы подходят для определения изменения в endosphere, ризосфере и почвы.
Преобладание бактерии по алфавиту является общий вывод в исследованиях по31,30,endosphere и почвы32. Endosphere обычно имеет меньше разнообразие видов микроорганизмов с выше относительное обилие бактерии по алфавиту. Это вновь подчеркивает, что результаты здесь являются представитель других выводов в литературе. Эффекты лечения в этом исследовании не были значительно отличается и две основные причины для этого, возможно, что различия введенных лечения не достаточно большой, чтобы генерировать достаточно вариантов для обнаружения и что этой выборки было сделано в конце вегетационный период, когда поля могут имели достаточно времени, чтобы привлечь вниз азота аналогичного уровня, который является то, что было измерено в конце сезона. В другом исследовании с использованием аналогичных оплодотворение ставок в течение более длительного периода времени только сравнительно небольшие изменения в составе микрофлора были измеренных33. Другие исследования показали изменения в грибковых и бактериальных сообществ из-за азотных удобрений34,35.
Видов растений, как известно, играют роль в определении их microbiomes3,,3236 и даже небольшие различия в микробных вариации были продемонстрированы между генотипами различных растений в пределах один вид37. В этом исследовании было обнаружено значительной разницы в состав микробных сообществ между видов растений. Во всех типах образца оказалось что switchgrass наиболее выразительной микробный состав, но различия между видами были только статистически значимой в endosphere. Ризосфере сообщества композиция может стать значительным, если больше реплицирует были доступны для анализа.
Комбинированные области, лаборатории и аналитических протоколов, описанные здесь обеспечивают мощный метод для изучения как различные факторы влияния состава микробных сообществ в почвах и ризосфере, endosphere корни36. Существует много работы предстоит сделать в области изучения microbiomes, особенно в сельскохозяйственных полей. Важные вопросы о как урожайность изменяются, микрофлора почвы еще предстоит полностью выяснены. Даже самые основные вопросы, касающиеся как севооборотов влияние микрофлора почвы, как сроки изменяет микрофлора, как абиотического стресса изменяет микрофлора, как тип почвы взаимодействует с этими факторами изменить микрофлора и есть ли Универсальные микробов в отдельных культур или регионах США являются все открытые вопросы. Эти методы также будет полезным для эпидемиологических исследований для определения присутствия и сохранение патогенных и полезных бактерий. Еще один будущий горизонт для этих методов будет приступить к интеграции ДНК методы, описанные здесь с завода и Микроб РНК и метаболит данных. Дополнительные улучшения и тестирование более переменных будет иметь важное значение для дальнейшей оптимизации этих протоколов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Развитие этой рукописи поддерживается Национальный научный фонд EPSCoR центр для корня и Rhizobiome инновации премии ия-1557417. Сбор данных было поддержано средств от университета Небраска-Линкольн, сельскохозяйственных исследований и разработок и Люк грант от USDA. Мы также признаем поддержку от USDA-ARS и была оказана поддержка сельского хозяйства и продовольствия исследований инициатива конкурентных Грант № 2011-68005-30411 от USDA национального института продовольствия и сельского хозяйства, создавать и управлять этими полями.
Materials
| Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 12955-4 | Extraction kit for soil and rhizosphere |
| Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 13496-4 | Extraction kit for roots |
| D-Handle Digging shovel, 101 cm L | Fiskars | 9669 | |
| Rapid Tiller, 40 cm L | Truper | 34316 | |
| Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm | Ziploc | NA | |
| Cooler | Any | NA | |
| Wash pan | Any | NA | |
| Plastic bucket | Any | NA | |
| Gloves (work and lab) | Any | NA | |
| 20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-8FS | |
| 20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-4FS | |
| portable generator | Honda brand works well | NA | |
| Sterile cell strainers 100 μm mesh size | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| NaH2PO4·H2O | VWR | 0823 | |
| Na2HPO4 | VWR | 0404 | |
| Silwet L-77 | Lehman Seeds | VIS-30 | Surfactant |
| Autoclaves | Any | NA | |
| Drying Oven | Any | NA | |
| Scale | Any | Any | |
| Bleach | CLOROX – household strength | NA | |
| Tween 20 | Any | NA | |
| Liquid Nitrogen | Any | NA | |
| Dry Ice pellets | Any | NA | |
| Ethanol | Any | NA | |
| 11 cm precision fine point tweezers | Fisher | 17456209 | |
| 18 cm Straight point specimen forceps | VWR | 82027-436 | |
| 13.5 cm Pruning Scissors | Fiskars | 9921 | |
| 2 mL tube | Any | NA | |
| 15 mL PP conical tube | MIDSCI | C15B | |
| 50 mL PP conical tube | MIDSCI | C50B | |
| Ultrapure water | Millipore-sigma | Milli-Q Integral, Q-POD | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | For DNA quantification of removed samples |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | For DNA quantification |
| 96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates | Corning | 3631 | |
| pPNA PCR Blocker | PNA Bio | PP01-50 | |
| mPNA PCR Blocker | PNA Bio | MP01-50 | |
| Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing | BEI Resources | HM782D | |
| Adhesive 8 well-strips for plates | VWR | 89134-434 | |
| Stainless steel beads, 3.2 mm dia | Next Advance | SSB32 | |
| 1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) | CoStar | 3959 | |
| antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere | TWD Tradewinds, INC | ASWF1SPK | |
| antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf | TWD Tradewinds, INC | ASWFXSCS | |
| Genie 2 Digital Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex adapter for 50 mL tubes | Scientific Industries | SI-H506 | |
| Mortar (100 mL) and pestle | Any | NA | |
| Metal micro-spatula | VWR | 80071-672 | |
| Disposable antistatic microspatulas | VWR | 231-0106 | |
| Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) | Duro | 18402 | |
| 5424 Centrifuge for 2 mL tube | Eppendorf | 22620461 | |
| Centrifuge for 96-well plate | Sigma4-16S | 81510 | |
| Centrifuge rotor for 50 mL tubes | Sigma4-16S | 12269 – Biosafe | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | Kapa Biosystems |
References
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).
- Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7 (1), 15019 (2017).
- White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).
- Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
- Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).
- Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).
- Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).
- Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87 (2014).
- Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
- Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688 (1949).
- Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
- Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).
- Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , 1-212 (2009).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
- Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151 (2016).
- O’Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).
- Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).
- Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349 (6250), 860-864 (2015).
- Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950 (2014).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).
- Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).
- Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5 (7), e11915 (2010).
- Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).
