実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

1. フィールド サイトの説明 コレクション期間中に実験サイトをについて説明します。フィールド (緯度、経度、高度) の位置を決定する GPS を使用しています。 サンプリングの深さ、サンプリング時間、および土の質を記述します。 環境要因は、微生物群集を形作る上で重要な役割を果たす.年平均気温、降水量、過年度の輪作、耕起、施肥法と現場の歴史などの気象情報を記録します。自動気象観測所またはその他のデバイスは、成長の季節にわたって毎日の降雨量と温度を記録する便利です。 2. 収集と土、根、およびルート フィールド サンプルの処理 植物の発掘。 ラベル、洗濯パンとバケット サンプリングする植物材料についての情報が含まれている付箋。プロット数などの情報を植物の遺伝子、植物種あります。プロット ラベルの付いたバケツを運ぶし、分野で確立されたワークステーションで洗濯パンを残してください。 根土で植物を保持のいずれかをカットする 30 cm の深さにシャベルで土に穴を開けます。大体の分量は 18 cm3です。ランダムに選択し、プロット内の異なる領域からプロットごとに 2 つの植物を収集します。 シャベルを活用して植物の根を発掘し、ラベル付きのバケツに根のボールを配置します。フィールド内のワークステーションに出土した根のボールとラベルの付いたバケツを戻します。切断し、植物体地上部バイオマスを破棄します。 根と一括土のコレクションからの土の除去。 手動で土壌を削除または、根から土を取除くスペードか手持ちの耕うん機を使用する根を振る。根を揺れ非常に砂土での土壌を削除するのに十分です。手袋を着用し、処理場近くにルーツを置きます。 根を揺れ、土壌の大部分は洗濯パンになります。洗浄鍋の土を混合し、ハンドヘルド茎と任意の土壌土塊を破る。ラベルの付いた 17.7 x 19.5 cm ファスナー収納袋と涼しい場所、または氷の上に障害物がない土壌のサンプルを置きます。 根と根のコレクション。 70 で滅菌剪定はさみを使用して %etoh、消費税さまざまな根、植物ごとの 4 に 6 根と各ルートの長さ約 9-12 cm 約。35 mL のオートクレーブ、リン酸バッファーを含むラベル付きの 50 mL チューブに根 (カット、必要に応じて合わせて) を配置 (6.33 グラム/L の NaH2PO4、8.5 g/L の Na2HPO4無水、pH 6.5、200 μ l/L 界面活性剤)。注: 界面活性剤 (材料の表を参照) 後に追加されたオートクレーブ滅菌リン酸緩衝。鉢と根長のボリュームは、植物と植物種によって異なります。 根の表面から根を解放する 2 分管を振る。70% で滅菌ピンセットで江藤、削除根管、簡単にしみからの紙タオル、および新しい、場所ラベル 50 mL のチューブ。両方の根と根氷の上を含む 1 つを含む管を配置します。 3. フィールドの処理の実験室でサンプルします。 フィールド コレクション後の根の表面殺菌。注: フィールドから帰国後できるだけ早く表面殺菌を実行します。表面できない場合同じ日に根を消毒、保存処理されるまで 4 ° C で根。 約 35 mL 0.01% + 50% の漂白剤のフィールドで収集した 50 mL の根管にトゥイーン 20 を追加します。30 〜 60 秒の 50 mL の管を振る。50% の漂白剤を注ぎ、35 ml 70% のエタノール。別の 30 〜 60 秒の横に振る。 70% オフを注ぐ EtOH、35 mL の滅菌、超高純度水を追加。1 分間振る。さらに 2 回水洗浄を繰り返します。注: 私たちの表面殺菌治療が十分なように、我々 は最後のすすぎの水のサンプルをメッキし、(P. 王、未発表データ、2014) 細菌の増殖は認められなかった。他の研究者は、同様の方法9,10を使用してルート殺菌効率のテストしています。 きれいなペーパー タオル根乾燥をしみ。サンプルごとに清潔なペーパー タオルを使用します。注: 使用する前にペーパー タオル、消毒が可能します。私たちは私たちのペーパー タオルを滅菌しないでください。ただし、サンプルあたり 1 のペーパー タオルを使用し、使用されるまでラップ タオルを保ちます。 滅菌鉗子、剪定はさみ、約 5 mm の部分と場所に根をカットしてきれいで、ラベル付きの 15 mL の円錐管に根をカットしました。さらに加工されるまで-80 ° C でサンプルを格納します。 根圏のサンプルを処理します。 サンプル全体を再懸濁しますフィールドから根サンプルを含む 50 の mL の管を振る。滅菌、100 μ m メッシュ セル ストレーナーを使用してフィルター (材料の表を参照)、新しい 50 mL のチューブに再懸濁のサンプル。 室温で 5 分間 3000 × g でチューブを遠心します。すぐを離れて注ぎ、上澄みを廃棄します。 氷の上の 50 の mL の管に根ペレットを配置します。根圏ペレットと中断する渦に滅菌リン酸緩衝 (界面活性剤) なしの 1.5 mL を追加します。 きれいなラベル、2 mL および microfuge の管に懸濁液をピペットで移しなさい。常温で 2 分間 15,871 x g でチューブをスピンします。すぐに、上澄みを離れて注ぐし、きれいなペーパー タオルの管をドレインします。 さらに加工されるまでの-20 ° C でペレットを格納します。注: 手順 3.2.2 – 3.2.4 ストレージのサンプル チューブのサイズを減らすために行われます。50 mL チューブと比較して小さい 2 mL 管を保存する効率的なより多くのスペースです。 DNA 抽出と土壌分析用の土壌サンプルを処理します。 滅菌金属へらを使用して、DNA の抽出のための土の約 3 g できれいで、ラベル付きの 2 mL 管を埋めます。小さな根の部分、破片を避けるため。-20 ° C でこの土壌サンプルを格納します。リンス金属ヘラ 70 %etoh 各サンプル間。 クリーン洗浄鍋に空の袋小さいふるいの上に大きなふるいに積み上げふるい (材料の表を参照してください)、土壌、手動で両方のふるいを通して土をふるい。慎重にサンプル間ふるいをきれいにするのにブラシを使用します。 将来土壌物理化学・ テクスチャ解析の 17.7 x 19.5 cm のジッパー式バッグにふるわれた土壌の 100 に 125 g 置いておきます。短期的なストレージ 4 ° C で土の袋を配置します。 土壌水分の土壌サンプルを処理します。 風袋規模でラベル付けされた茶色の紙袋。茶色の紙袋にふるわれた土壌の 40 に 45 g を測定します。茶色の紙袋とデータ シート上の土の重量を記録し、55-60 ° c. に乾燥オーブンの場所バッグ セット 72 時間後に、乾燥炉から袋を削除します。少なくとも 30 分の冷却し、重量を量る土壌袋を許可します。 体重を記録するには、ゼロにスケールを風袋、スケールに茶色の紙袋。式を使用して各サンプルの土壌水分の割合を計算します。注: 土壌水分法はケロッグ生物駅長期生態調査 (KBS LTER) からです。KBS フィルターは、研究者は彼らのウェブサイト (https://Lter.kbs.msu.edu/) の確立したプロトコルの広い範囲を提供します。 4. 加工ルートの準備は、DNA の抽出のサンプルします。 サンプルが均一なので、冷凍根材を挽きます。 きれいな乳鉢と乳棒研削プロセス全体にわたって凍結サンプルを維持する、きれいなへらでプラスチック ビーカーに液体窒素を注ぐ。 モルタルの凍結するティッシュを置き、微粉末に乳棒で粉をひきます。液体窒素凍結サンプルを維持するために研削中を継続的に追加します。 ヘラを使用すると、きれいで、ラベル付きの 2 mL チューブに地上組織を配置します。-80 ° C でストア 5. 土壌と根圏 96 ウェル フォーマットのサンプルからの DNA の抽出 96 ウェル プレートに土壌サンプルを読み込みます。 70 %etoh, 1% の漂白剤の作業領域を拭いてください。これらの手順でラボの手袋を着用します。-20 ° C のストレージから土壌サンプルを削除、氷のバケツで解凍することができます。 DNA 抽出キットで提供されている 96 ウェル抽出プレートからシール マット カバーを取り外します。使用しない間に清潔に保つため 2 ペーパー ワイパー間シール マット カバーを置きます。汚染を避けるために、接着剤 8 ウェル PCR を使用してストリップ 96 ウェル抽出プレートの 12 列をカバーします。 風袋滅菌計量-目標到達プロセス (SM サイズ) 規模で、200 に 250 mg 土壌の重量を量り。注: これらの滅菌の目標到達プロセスは 1 つの側面に平坦化漏斗は規模できっかりので。漏斗は土壌と井戸に直接配置されます。このテクニックはサンプルの損失を回避、流出を最小限に抑える、交差汚染を防止します。 抽出プレートの最初の井戸を明らかにするには、適切な充填重量を量る漏斗の首もし、適切な井戸の中に土のサンプルをゆっくりとガイドの場所を付着力のストリップを慎重に持ち上げます。井戸をカバーする付着力のストリップを交換してください。 プレートが塗りつぶされるまで各サンプルの新しい、滅菌漏斗の使用、プレートの各ウェルにこのプロセスを繰り返します。1 つは抽出ブランク コントロールとしても空のまま。注: 1 つも空白のまま負の (空の) コントロールとして機能するすべての抽出プレートに。キット試薬11に存在する汚染物質を制御します。 抽出プレートにシール マット カバーを取り付けます、DNA の抽出の準備ができるまで、-20 ° C でプレートを保管します。 96 ウェル プレートに根のサンプルを読み込みます。 -20 ° C のストレージから根サンプルを削除し、氷のバケツで解凍することができます。 5.1.2 DNA 抽出プレートを準備するために上記の手順に従ってください。 規模で、きれいなペーパー ワイプを配置し、スケールの滅菌金属のヘラを風袋します。慎重にいくつかのサンプル チューブから根ペレットをえぐり、ヘラを使用します。ヘラをスケールに戻り、根サンプルの 200 と 250 mg の間の重量を量る。 抽出プレートの最初の井戸を明らかにし、同様に塗りつぶされたヘラを角こすり根材料滅菌つまようじで適切な井戸の中に粘着テープを慎重に持ち上げます。 70% によって続かれる水に金属のヘラをリンス サンプル間のエタノール。1 つを抽出ブランク コントロールとしても空のまま、プレートがいっぱいなるまで、プレートの各ウェルにこのプロセスを繰り返します。 根と土、96 ウェル フォーマットのサンプルから DNA の抽出。 抽出土壌および根圏 DNA を使用してキットに最適土壌 (材料の表を参照)、次の製造元のプロトコル。注: 我々 は独自の試薬のフミン酸、その他強力な PCR 阻害物質の土壌で発見を削除機能のため土壌および根圏 DNA を分離するのにこの特定のキットを使用します。 DNA の定量化。 92 サンプルと標準キットを使用しての 4 濃度を数値化 (材料の表を参照してください標準が含まれて)、製造元のプロトコルに従って。 キットを使用して 4 つの標準のための井戸に合わせて板から削除された残りの 4 サンプルの定量化 (材料の表を参照)、製造元のプロトコルに従って。 6. ルートからの DNA の抽出を、96 ウェル フォーマットでサンプリングします。 96 ウェルのプレートにルートのサンプルを読み込みます。 70 %etoh, 1% の漂白剤の作業領域を拭いてください。これらの手順の中に手袋を着用します。 ドライアイスでバケツにサンプルを置くことによってすべての回で凍結地面ルート サンプルを保ちます。 液体窒素でプラスチック ビーカーを記入し、冷却するプラスチック ビーカーに帯電防止 microspatulas と滅菌計量-目標到達プロセス (XSM のサイズ) を配置します。 キットに付属している 96 ウェル抽出ビーズ プレートからシール マット カバーを取り外して使用しない間に清潔に保つため 2 ペーパー ワイパー間に配置。注: これらの DNA の抽出を行った時間以降にリリースされた、このキットの新しいバージョンは、抽出ビーズ プレートを供給するユーザーを必要があります。テーブルの材料、我々 はこれらの項目を注文するために必要なベンダー カタログ情報をリストアップしました。 汚染を避けるために、接着剤 8 ウェル PCR を使用してストリップ 96 ウェル抽出プレートの 12 列をカバーします。 冷凍井戸にサンプルを保つためにドライアイスに抽出ビーズ プレートを配置します。 抽出プレートの最初の井戸を発見、適切な井戸の中に充填重量を量る漏斗の首を配置し地上根組織の 3 ヘラのスクープを追加を付着力のストリップを慎重に持ち上げます。井戸をカバーする付着力のストリップを交換してください。注: 土壌および根圏がフリーズ解除の重量を量る前に氷の上植物材料は計り分け冷凍に対し。冷凍植物組織、特に少量は融解せずスケールで重量を量りにくいです。重量を量る地面ルート組織をどのように多くのヘラ スクープされた十分なテストが行われました。キットのメーカー組織の正確な量を必要としないが、お勧めします約 50 mg。 別の植物サンプルの型が異なり、ユーザーが適切な量を決定する必要がありますに注意してください。 プレートがいっぱいなるまで、プレートの各ウェルにこのプロセスを繰り返します。 DNA の抽出の準備ができるまで、-20 ° C でプレートを格納します。 根組織の DNA の抽出。 (材料の表を参照してください) の植物に最適化されたキットを使用して DNA を抽出メーカーのプロトコルに続きます。注: ルート サンプルから最大収率を達成するために植物の組織のために特別に設計されているこのキットを使用してください。土壌、根圏とは異なりフミン酸および他の汚染物質は根組織のための問題のより少しします。 ステップ 5.4 のように DNA を定量化します。 7. 増幅と隔離された DNA のシーケンスします。 校正のポリメラーゼで V4 地域 16 s 遺伝子の増幅 (材料の表を参照) Gohlらで説明されているよう異なるインデックス プライマー シーケンスの前にプールと12バーコード サンプル。Gohl ら12 2 段階 PCR を用いた V4 プライマー (補足ファイル 1) で説明した方法を使用してシーケンス。メモ: メソッドの一部でこれらの手順を説明12,13,14の詳細を他の場所で、したがってここで説明するないです。ルートのサンプル、PNA ブロッカーが完全に記述されている15は、以前されて植物組織から増幅プラスチド DNA の量を減らすに追加されました。2 つのコントロールが含まれて抽出プレート空白のコントロール (5.1.5 の手順の後のメモを参照)、否定的な制御、シーケンスで使用されていた、細菌 DNA の知られている人口のモック コミュニティ正として役立った (材料の表を参照)コントロール。注: ほとんどの場合、MiSeq 試薬キット v3 は、2 X 300 基本ペア終了モードで使用されます。この原稿のサンプル、イルミナ HiSeq 2500 250 対バックエンド (2 x 250) モードと高速モードで使用しています。すべてのサンプルは、同じレーンに配列されました。 微生物群集解析 (USEARCH v9.2.64、QIIME v1.9.1 RStudio v3.4.3 16) パイプラインを介してシーケンス データを処理します。 USEARCH17を使用してシーケンス データを準備します。注: USEARCH は、利用可能なオンライン完全な指示 (https://www.drive5.com/usearch/) です。 インデックスの読み取りやバーコードを使用してイルミナ読み取りをサンプルに割り当てシーケンス データをデマルチプレックスします。 コンセンサス シーケンスを取得するペアエンド リードをマージします。コマンドを使用します: usearch-fastq_mergepairs * R1*.fastq-@ – fastq_maxdiffs ラベル 10 – fastq_minmergelen 230 – fastq_maxmergelen – 320 fastq_pctid 80 – fastqout merged.fq。注: パラメーターは、USEARCH の取扱説明書を参照するを介して設定されます。 PCR の反作用によって引き起こされるかもしれないプライマー シーケンスで置換を避けるためにシーケンス データからプライマーを削除します。コマンドを使用します: usearch-fastx_truncate merge.fq – stripleft 19 stripright – 20 – fastqout stripped.fq。 低品質の読み取りを削除し、質の高い運用分類単位 (乙) シーケンスを保持シーケンス データをフィルター処理します。コマンドを使用します: usearch-fastq_filter stripped.fq-fastq_maxee 1.0 – fastaout filtered.fa。 USEARCH で OTUs を生成します。 乙シーケンスの一意のセットを識別するために dereplication を実行します。コマンドを使用します: usearch-fastx_uniques filtered.fa fastaout – uniques.fa – sizeout-Uniq のラベルを書き換えます。 97-100% ユニークな OTUs を指定する配列の類似性を持つ OTUs をクラスターします。コマンドを使用します: usearch-cluster_otus uniques.fa – minsize 2 – otus otus.fa-乙のラベルを書き換えます。注: この手順は、クラスター化された OTUs からシングルトンの取り外しとシーケンス データからキメラの除去にも取り込んでいます。 USEARCH で乙表を作成します。コマンドを使用します: usearch-usearch_global stripped.fq – db otus.fa-プラス – id 0.97 – otutabout otutable.txt 鎖。注: このコマンドは、読み込み (カウント) すべて OTUs 各サンプルの数を持つテーブルを生成します。乙表は、差分豊富な解析や微生物の多様性解析など後工程に使用されます。補足図 2 に乙表の例を示します。 QIIME v1.9.1 18真空分析を行います。注: 真空曲線は乙テーブルを使用してシーケンス処理の深さが正しく微生物群集をサンプルかどうかを決定する計算されます。膨張曲線の例を図 3 の補足。 アルファ多様性解析18を実施します。QIIME v1.9.1 で alpha_rarefaction.py を使用して、各サンプル内微生物群集の多様性を計算します。注: この解析は、シャノン19、シンプソン20、Chao121など多様度指数を計算します。 ベータ多様性解析18,22を実施します。Python スクリプトを使用して: QIIME v1.9.1 ブレイ-カーティス非類似度行列で beta_diversity_through_plots.py。注: この分析は、サンプル間の群集組成を比較します。 グループ間の統計的分析を行います。RStudio16でビーガン パッケージ23 v2.4.5 のアドニスと分散分析関数を使用して PERMONOVA の計算距離行列を使用します。ビーガン パッケージで capscale 関数を使用 (CAP) 主座標分析の標準的な分析を行います。RStudio ggplot2 パッケージ24 v2.2.1 を使用してデータを視覚化します。