בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי
Summary
חפירה של שורשי צמחים מן השדה, כמו גם עיבוד של דגימות לתוך endosphere, rhizosphere ואדמה מתוארים בפירוט, כולל הפקת דנ א ושיטות ניתוח הנתונים. נייר זה נועד לאפשר מעבדות אחרות שימוש בטכניקות אלה לצורך המחקר של קרקע, endosphere, rhizosphere microbiomes.
Abstract
מחקרים microbiome צמחים ואדמה הופכים יותר ויותר חשוב להבנה שמיקרואורגניזמים התפקידים לשחק את התפוקה החקלאית. מטרתו של כתב יד זה נועד לספק פירוט כיצד לדגום קרקע, rhizosphere ו- endosphere של ניסויי שדה משוכפל ולנתח שינויים שעלולות להתרחש בקהילות מיקרוביאלי סוג הדגימה, טיפול וכתוצאה צמח גנוטיפ במהירות. הניסוי נעשה שימוש כדי להדגים שיטות אלה מורכב חלקות השדה משוכפל המכיל שני, טהור, חמים-העונה עשבי (ושכנותיה virgatum ו gerardii זקניים) ותערובת נמוך-המגוון דשא (א gerardii, Sorghastrum נטויה, , Bouteloua curtipendula). בקצרה, צמחים הם חפרו, מגוון רחב של השורשים הם לחתוך להציב במאגר פוספט ואני מזועזע ואז לאסוף את rhizosphere. שורשים מובאים למעבדה על קרח, משטח לעקר עם אקונומיקה, אתנול (EtOH). Rhizosphere הוא מסונן, מרוכז על ידי צנטריפוגה. חפירות ארכיאולוגיות מהאדמה סביב כדור הבסיס להציב לתוך שקיות פלסטיק, הובאו למעבדה שבו כמות קטנה של אדמה נלקח DNA עקירות. ה-DNA שחולצו מן השורשים, קרקע, rhizosphere, ואז מוגבר עם צבעי יסוד האזור V4 של הגן rRNA מטוסי אף-16. Amplicons הם וסודרו, ואז נותחו בכלים לביואינפורמטיקה גישה פתוחה. שיטות אלה לאפשר לחוקרים לבדוק איך הקהילה מיקרוביאלי גוניות משתנה בשל סוג הדגימה, טיפול, ולשתול גנוטיפ. באמצעות שיטות אלו יחד עם מודלים סטטיסטיים, התוצאות נציג מדגימים ישנם הבדלים משמעותיים בקהילות מיקרוביאלית של שורשים, rhizosphere אדמה. השיטות המובאות כאן מספקים ערכה מלאה של צעדים כיצד לאסוף דגימות שדה בודד, לחלץ, לכמת, להגביר, רצף ה-DNA, לנתח את הקהילה מיקרוביאלי גיוון והרכב במשפטי שדה משוכפלת.
Introduction
מחקר Microbiome יש השלכות חשובות על הבנה וטיפול האקולוגית תהליכים כגון מזין רכיבה על אופניים, תחלופת חומר אורגני, לבין פיתוח או עיכוב של אדמת פתוגנים1,2. המחקר בתחום זה מחזיקה גם פוטנציאל גדול עבור הבנת ההשפעות של אדמה חיידקים על הפרודוקטיביות של קהילות צמחים טבעית ו- agroecosystems. אמנם ישנם מחקרים רבים התמקדו microbiome אדמה ב הטבעיות, דבר פחות התמקדו צמח חיידקים rhizosphere ו- endosphere agroecosystems3. בנברסקה, החקלאות חולש על הנוף על פני חלקים גדולים של המדינה, ביצוע המחקרים של קרקעות אלה איפה בחקלאות הגידולים גדלים נושא חיוני למחקר. מטרת המאמר שיטות היא להעניק חוקרים ערכה רגילה של פרוטוקולים כדי לתאר את החיידקים המצויים agroecosystems, כדי לקבוע כיצד שורשי צמחים לשנות את הקהילות מיקרוביאלית ב rhizosphere ו endosphere, בסופו של דבר להבין את הפונקציות שהחיידקים האלה לשחק את התפוקה ובריאות הצמח בקרקע.
השיטה המוצגת כאן שונה במקצת מן שננקטו על-ידי אחרים4,5 ב כי הנייר הזה מכוון למידה אילו חיידקים נמצאים אך ורק בתוך הבסיס, איך הם שונים חיידקים מיד מחוץ לשורש rhizosphere. רצף אמפליקון השתמשו במחקר זה מזהה את taxa חיידקים הנמצאים לדנ ומאפשר לחוקרים כדי לקבוע כיצד הקהילות לשנות בהתאם סוג הדגימה או טיפול. לאחד ההבדלים העיקריים בין פרוטוקול זה פרוטוקול דומה מאוד בשימוש על-ידי. Lundberg et al. 6 הוא כי במקום sonication, פרוטוקול זה משתמש עיקור משטח עם אקונומיקה, אתנול כדי להסיר את rhizosphere מן השורשים. אחרים החלו להשתמש בו גם משטח עיקור ביעילות7,8,9,10. שיטות אלה אינן יתרון יותר מאשר שיטות אחרות, אך שונה במקצת. שיטות אלה מתאימים במיוחד בשביל ניסויי שדה גדול משום עם מספיק אנשים ניתן לעיבוד חלקות השדה מעל 150 ליום, אשר מוסיפה עד בערך 450 דוגמאות כאשר לחלקו ל endosphere, rhizosphere ואדמה. כתב יד זה מתאר בפירוט את שיטות השתמשו כדי לדגום בשדה, לעבד את החומר במעבדה, לחלץ, רצף ה-DNA, ומספק סקירה קצרה של צעדים כדי לנתח את הנתונים המתקבלים רצף.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשיטות המתוארות בכתב היד צריך לאפשר למדענים בקלות להכנס לתחום metagenomics אדמה וצמח. במהלך השנים, אנו יש מעודן השיטות שלנו מאז ביצוע הניסוי המתואר בכתב היד. שינוי אחד הוא כי עכשיו מראש מתייגים צינורות לפני היציאה לשדה מדגם. המעבדה שלנו משתמשת מערכת barcoding תווית מדפסת. המדפסת תווית לא רק חוסך זמן כאשר תיוג צינורות, אבל גם הופך את הכל קל יותר לאתר, לזהות כראוי את דגימות ללא הגחמות של כתב היד האנושית. נקודה קריטית נוספת היא שאנחנו מנסים לעבד את החומר לאחר שהבאת אותו בחזרה מן השדה בהקדם האפשרי. אנו שואפים להקפיא את הקרקע המשמש עבור ניתוח הדנ א, לעקר, להקפיא את השורשים, לסנן ואת להקפיא את rhizosphere תוך 12 עד 36 שעות לאחר שחזר מן השדה. ההליכים מיצוי הדנ א הם ממושך עם שלבים רבים, במיוחד עבור קרקע ומי rhizosphere, כך רכשנו רובוט (Flex השלדג, ThermoFisher), זה ממזער את הידיים בזמן הפרוטוקולים הפקת דנ א, מפחיתה טעויות אנוש הנובעות עשוי להיות מוצג. ומשפר את עקביות תשלימו אצוות של אדמה, שורשים או rhizosphere מעובדים. כאשר עובדים עם חומר צמחי חשוב להחליט על סוג הבסיס שילמדו או לקחת מגוון סוגי שורש כדי לקבל “מדגם מייצג”. שמירה על שורשים, משאיר במצב קפוא כאשר ניצוח של עקירות הדנ א הוא חשוב, כמו זה להבטיח שיש אין זיהום צולב בין דגימות בשעת מילוי צלחות מיצוי הדנ א 96-ובכן. גורם חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון הוא המספר של משכפל שישמש בעת תכנון שדה ניסויים ושימוש מלא אקראי עיצוב במידת האפשר26. בשל השתנות השדה גבוהה זה יהיה חייב להיות מספר גדול של משכפל כדי לזהות הבדלים קטנים. לבסוף, מתוך הניסיון שלנו זה חיוני כדי לוודא קרקעות אינם רטובים מדי בעת סטטורי השורשים. אם קרקעות רוויים עם מים זה מבולגן לא רק לעבוד עם, אך זה גם מאוד קשה כדי להגדיר את rhizosphere וכדי להסיר את הקרקע מן השורשים.
שינוי אחד שהתבצע מוקדם מאוד במהלך הפיתוח של שיטות אלה היה במקום רועד הצינורות ביד כדי לשחרר את rhizosphere שלנו לשדרג vortexers מופעל על ידי גנרטור גז כדי להקל את עבודת השדה ועוד סטנדרטית במונחים של הזמן ואת אופן כל שפופרת היה נסער. מגבלה אחת של הגישה רצף אמפליקון היא הרזולוציה טקסונומי של התוצאות הוא מוגבל אוטוס רבים הם לא ידועים או היחיד הידוע ברמת המשפחה או סוג. תחום המחקר מתפתח במהירות רבה ולכן חשוב להיות מודעים גישות חדשות ומתפתחות, במיוחד עבור ניתוח נתונים זה עשוי לשפר את הרזולוציה של התוצאות.
פרוטוקולים אלה הם רק עבור הלומדים חיידקים, ארכאונים, לא פטריות. השימוש של תחל שונים עבור הגברה יאפשר לחקר קהילות פטרייתי שימוש באותו DNA דגימות27,28. שיטות אלה אינם דורשים הרכישה של כמויות גדולות של ציוד כי השיטות ניתן לפשט. השיטות נתאר כאן הם בעיקר לקביעת “מי זה שם”, אך השדה מתפתח במהירות לתוך שואל שאלות חשובות על הפונקציה, אשר שניתן לטפל בהן באמצעות רובה רצף שיטות, בידוד ו בדיקת הפונקציונליות של חיידקים, או רצף הגנום כולו מיקרוביאלי.
התוצאות נציג להדגיש את ההבדלים בקהילות חיידקים העלולים להתגלות בשיטות המתוארות. ההבדלים ההלחנה באמצעות הגישה בטא-המגוון של ניתוח נתונים22, הוצגו בין סוגי מדגם. ההבדלים האלה נצפו בבירור במחקרים רוב אחרים כאשר endosphere, rhizosphere ואדמה מכילה קהילות חיידקים ייחודי3. המדד לגיוון שאנון מחושב כדי לקבוע את השפע ואת שויון של המין מיקרוביאלי מתנה בתוך כל מיני צמחים endosphere, rhizosphere, וכן קרקע. כפי שמוצג במחקר זה ובמקומות רבים אחרים, גיוון אלפא הוא הגבוה ביותר האדמה, להקטין מעט ב- rhizosphere, ואז להקטין באופן משמעותי5,3,endosphere29. תוצאות אלו מצביעות על השיטות המתוארות כאן מתאימים לזיהוי שינויים ההלחנה ב endosphere, rhizosphere, ו אדמה.
הדומיננטיות של פרוטאובקטריה הוא ממצא נפוץ במחקרים על endosphere וקרקע30,31,32. Endosphere יש בדרך כלל מגוון התחתון של מינים חיידקים עם השפע היחסי גבוה יותר פרוטאובקטריה. זה שוב מדגיש כי התוצאות כאן הן נציג ממצאים אחרים בספרות. ההשפעות הטיפול במחקר זה היו לא שונה באופן משמעותי, שתי סיבות הגדולות עשויים להיות כי ההבדלים המוטלים על-ידי הטיפולים לא היו גדולים מספיק כדי ליצור וריאציה מספיק כדי לזהות כי דגימה זו נעשה בסוף עונת, כאשר השדות אולי היו מספיק זמן כדי לשלוף את החנקן לרמות דומות, וזה מה נמדד בסוף עונת הצמיחה. במחקר אחר באמצעות שיעורי ההפריה דומה לאורך תקופה ארוכה יותר של זמן, רק יחסית שינויים קטנים בהרכב של microbiome היו נמדדו33. מחקרים אחרים הראו שינויים בקהילות פטרייתי והן חיידקי עקב חנקן-דשן-34,–35.
מיני צמחים ידועים לשחק תפקידים בקביעת שלהם microbiomes3,32,36 , הבדלים קטנים אפילו וריאציה הקהילה מיקרוביאלי הוכחו בין צמחים שונים אחרים בתוך אחד המינים37. במחקר זה, נמצא הבדל משמעותי בהרכב הקהילה מיקרוביאלי בין מיני צמחים. כל סוגי מדגם זה הופיעה שיש switchgrass הרכב מיקרוביאלי ברורים ביותר, אבל ההבדלים בין המינים היו רק משמעותי סטטיסטית ב endosphere. הרכב הקהילה rhizosphere הפכה משמעותית אם משכפל נוסף היו זמינות לניתוח.
שדה משולב, מעבדה, והפרוטוקולים אנליטי המתוארים כאן מספקות שיטה חזקה לימוד השפעת גורמים שונים איך ההרכב של הקהילות מיקרוביאלי קרקעות, rhizosphere, את endosphere של השורשים36. יש הרבה מאוד עבודה באזור של הלומדים microbiomes, במיוחד בשטחים חקלאיים. שאלות חשובות לגבי איך התשואות שונו על-ידי microbiome הקרקע טרם להיות הובהר באופן מלא. אפילו את השאלות הבסיסיות ביותר לגבי איך היבול סבבים להשפיע על אדמת microbiome, איך התזמון משנה את microbiome, מתח איך והאביוטיים הפיצולים של microbiome, כיצד סוג הקרקע אינטראקציה עם גורמים אלה כדי לשנות את microbiome, ולבדוק אם קיימים יוניברסל חיידקים מסוימים יבולים או אזורים של ארה ב הם כל שאלות פתוחות. שיטות אלה יהיה גם שימושי עבור מחקרים אפידמיולוגיים לזהות את הנוכחות ואת ההתמדה של חיידקים פתוגניים, ומוצלח. אופק עתידי אחר ששיטות אלה יהיה להתחיל שילוב ה-DNA בשיטות המתוארות כאן עם הצמח, חיידק ה-RNA, מטבוליט נתונים. שיפור נוסף ובדיקות של משתנים נוספים יהיה חשוב עבור נוספים מיטוב של פרוטוקולים אלה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפיתוח של כתב יד זה נתמך על ידי המרכז EPSCoR של קרן המדע הלאומי השורש, Rhizobiome חדשנות פרס אויה (oia)-1557417…. איסוף הנתונים נתמכה על ידי קרנות של אוניברסיטת נברסקה, מינהל המחקר החקלאי ופיתוח על ידי מענק הפתח של משרד החקלאות. אנחנו גם תמיכה של משרד החקלאות-ARS ומסכים העניקה תמיכה חקלאות, מזון המחקר יוזמת תחרותי מענק מס 2011-68005-30411 של משרד החקלאות המכון הלאומי של מזון וחקלאות להקים ולנהל את שדות אלה.
Materials
| Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 12955-4 | Extraction kit for soil and rhizosphere |
| Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 13496-4 | Extraction kit for roots |
| D-Handle Digging shovel, 101 cm L | Fiskars | 9669 | |
| Rapid Tiller, 40 cm L | Truper | 34316 | |
| Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm | Ziploc | NA | |
| Cooler | Any | NA | |
| Wash pan | Any | NA | |
| Plastic bucket | Any | NA | |
| Gloves (work and lab) | Any | NA | |
| 20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-8FS | |
| 20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-4FS | |
| portable generator | Honda brand works well | NA | |
| Sterile cell strainers 100 μm mesh size | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| NaH2PO4·H2O | VWR | 0823 | |
| Na2HPO4 | VWR | 0404 | |
| Silwet L-77 | Lehman Seeds | VIS-30 | Surfactant |
| Autoclaves | Any | NA | |
| Drying Oven | Any | NA | |
| Scale | Any | Any | |
| Bleach | CLOROX – household strength | NA | |
| Tween 20 | Any | NA | |
| Liquid Nitrogen | Any | NA | |
| Dry Ice pellets | Any | NA | |
| Ethanol | Any | NA | |
| 11 cm precision fine point tweezers | Fisher | 17456209 | |
| 18 cm Straight point specimen forceps | VWR | 82027-436 | |
| 13.5 cm Pruning Scissors | Fiskars | 9921 | |
| 2 mL tube | Any | NA | |
| 15 mL PP conical tube | MIDSCI | C15B | |
| 50 mL PP conical tube | MIDSCI | C50B | |
| Ultrapure water | Millipore-sigma | Milli-Q Integral, Q-POD | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | For DNA quantification of removed samples |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | For DNA quantification |
| 96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates | Corning | 3631 | |
| pPNA PCR Blocker | PNA Bio | PP01-50 | |
| mPNA PCR Blocker | PNA Bio | MP01-50 | |
| Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing | BEI Resources | HM782D | |
| Adhesive 8 well-strips for plates | VWR | 89134-434 | |
| Stainless steel beads, 3.2 mm dia | Next Advance | SSB32 | |
| 1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) | CoStar | 3959 | |
| antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere | TWD Tradewinds, INC | ASWF1SPK | |
| antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf | TWD Tradewinds, INC | ASWFXSCS | |
| Genie 2 Digital Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex adapter for 50 mL tubes | Scientific Industries | SI-H506 | |
| Mortar (100 mL) and pestle | Any | NA | |
| Metal micro-spatula | VWR | 80071-672 | |
| Disposable antistatic microspatulas | VWR | 231-0106 | |
| Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) | Duro | 18402 | |
| 5424 Centrifuge for 2 mL tube | Eppendorf | 22620461 | |
| Centrifuge for 96-well plate | Sigma4-16S | 81510 | |
| Centrifuge rotor for 50 mL tubes | Sigma4-16S | 12269 – Biosafe | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | Kapa Biosystems |
References
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).
- Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7 (1), 15019 (2017).
- White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).
- Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
- Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).
- Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).
- Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).
- Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87 (2014).
- Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
- Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688 (1949).
- Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
- Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).
- Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , 1-212 (2009).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
- Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151 (2016).
- O’Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).
- Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).
- Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349 (6250), 860-864 (2015).
- Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950 (2014).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).
- Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).
- Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5 (7), e11915 (2010).
- Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).
