マウス心臓のセクションを使用してその場で交配で発現組織固有の miRNA
Summary
マイクロ Rna (Mirna) は、メッセンジャー Rna (Mrna) の転写調節因子として、短いと高い相同性の RNA シーケンスです。現在の miRNA 検出方法は、感度と特異度で変わる。In situハイブリダイゼーションや免疫染色マウス心臓ティッシュ セクションのマイクロ Rna とタンパク質分子の同時検出を組み合わせたプロトコルについて述べる。
Abstract
マイクロ Rna (Mirna) は、メッセンジャー Rna (Mrna) にバインドの翻訳を阻害して、劣化を促進させる、単一座礁させた RNA 転写産物です。日には、miRNAs はマイクロ Rna 転写産物の信頼性の高い検出法の必要性を意味したが、生物学的および病気プロセスの多数に関与しています。ここでは、ジゴキシゲニン標識 (DIG) ロックされた核酸 (LNA) プローブを用いた miRNA 検出、マウス心臓セクションにおける蛋白免疫染色と組み合わせるための詳しいプロトコルについて述べる。まず、プローブを使用して、コントロールと心臓肥大のマウスからの中心セクションに miRNA 182 式を識別するの in situハイブリダイゼーション法を行った。次に、共同 miRNA-182 心筋細胞をローカライズするのには、同じセクションの心臓トロポニン T (cTnT) タンパク質に対する免疫染色を行った。このプロトコルを使用して、アルカリ性ホスファターゼによる miRNA 182 ベースの比色定量法と蛍光染色を通じて cTnT を検出することができました。このプロトコルは、LNA の掘分類されたプローブを介して関心の任意の miRNA の発現とマウス心臓切片に関連するタンパク質の発現を検出する使用することができます。
Introduction
マイクロ Rna (Mirna) は短い (18-25 のヌクレオチド)、単一座礁させた、非コード Rna メッセンジャー RNA (mRNA) の翻訳を抑制することおよび/または mRNA の分解促進により転写レベルでの遺伝子発現の負の制御因子として機能します。1。 miRNAs はイントロンやコーディングのエクソンから転写されるまたは非コード遺伝子と切断 70 ヌクレオチド2の短い茎ループ構造は、前駆体 miRNAs (pre-Mirna) に DROSHA、による核。次の細胞質をエクスポート、プレは 18-25 のヌクレオチド3,4にまたがる成熟 Mirna にダイサーによってさらに処理されます。その後、RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) として組み込まれていますこれらの Mirna 一本鎖 Rna を式3,5 を抑制するため、3′ 非翻訳領域 (3′ UTR)、ターゲット Mrna に結合可能.
最後の三十年に彼らが最初に識別されたので、遺伝子発現、その独自の表現のレベルが厳しく制御された6のマスター調節因子に Mirna が登場しました。Mirna の役割は、臓器開発7,8,9,10、11,12、恒常性1314,のメンテナンスに記載されています。、病気コンテキスト神経15,16,17,18,19, 心血管20, を含む自己免疫条件21 だけでなく、 ,22癌23,24,25。MiRNA 発現パターンの関連性の増加の感謝は前方マイクロ Rna 転写産物の信頼性の高い検出法の必要性をもたらしています。このようなメソッドなどリアルタイム PCR、マイクロ アレイ、北にしみが付くことの in situハイブリダイゼーション、miRNA のトラン スクリプトは短いから成るという事実のために主に感度、特異性、定量的な力で変化して高い相同配列の6。
我々 は最近、miRNA-182、心筋肥大26、高架の血行力学的要求27,28に応えて心臓の構造的に適応を記述する条件の開発の重要な役割を報告しました。心臓肥大は不適応改造29に関連付けられている場合は、会計 8.5% すべての死のために起因する心血管の条件、心不全のリスク増加につながることができる心筋の量の増加によって特徴付けられる病気30。
ここで、ジゴキシゲニン標識 (DIG) ロックされた核酸 (LNA) プローブとマウス心臓ティッシュ セクションのマイクロ Rna とタンパク質分子の同時検出用免疫染色での in situハイブリダイゼーションを組み合わせた私たちのプロトコルを説明私たち心臓肥大のモデル。
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNA のトラン スクリプトの検出は、感度、特異性、定量的な力が異なる別の技術で実現できます。ここでは、miRNAの in situハイブリダイゼーション免疫染色のカップリングを示す心のセクションは同じに、マイクロ Rna とタンパク質分子の発現量の同時評価を可能にするプロトコルを記述し、。心臓切片で上皮内掘 LNA マイクロ Rna プローブの交配を実行する方法を示す.次に、我?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は原稿の批判的なコメントのアタナシオス Papangelis を感謝したいです。バイオ テクノロジー ・生物科学研究会議 (BBSRC; で FM をサポートします。BB/M009424/1)。IP は、アメリカ心臓協会の科学者開発の補助金 (17SDG33060002) によってサポートされます。
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
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